Terapia cellulare per insufficienza cardiaca nel ratto: Doppia Toracotomia per infarto miocardico e epicardico impianto di cellule e Biomatrix

Sommario

L'impianto di una biograft per trattare infarto del miocardio indotta da legatura LAD in un modello di roditore è convenzionalmente richiesto due operazioni a cuore aperto. Al fine di ridurre la mortalità e fornire le condizioni ottimali per la fissazione di biomatrici solidi e gelatinosi associati con le cellule, sono state sviluppate procedure minimamente invasive.

Abstract

Terapia cellulare cardiaca ha guadagnato crescente interesse e l'impianto di biomateriali associati con le cellule è diventata una questione importante per ottimizzare la consegna delle cellule del miocardio. Modello di roditore di infarto del miocardio (MI) composto da discendente anteriore sinistra (LAD) legatura è stata comunemente eseguita mediante una toracotomia; un secondo intervento a cuore aperto tramite una sternotomia viene tradizionalmente eseguita per l'applicazione epicardica del trattamento. Dal momento che la descrizione di LAD modello legatura, il tasso di mortalità post-operatoria è sceso 35-13%, comunque il secondo intervento chirurgico è rimasta critica. Al fine di migliorare il recupero post-intervento chirurgico e ridurre il dolore e l'infezione, procedure chirurgiche minimamente invasive sono presentati. Due toracotomie state eseguite, quello iniziale per LAD legatura e la seconda per il trattamento somministrazione epicardico. Biografts costituiti da cellule associate con matrici di tipo solido o gel sono stati applicati sulla ar infartuatoEA. LAD legatura comportato la perdita della funzione cardiaca, come confermato da ecocardiografia eseguita dopo 2 e 6 settimane. Colorazione tricromica Goldner eseguita su sezioni di cuore confermata la formazione della cicatrice transmurale. Ambulatori di primo e secondo portato a meno che il 10% la mortalità post-operatoria.

Introduzione

Dalla fine del 19 ^° secolo, le malattie cardiovascolari è rimasto il serial killer numero uno nei paesi industrializzati. Tra questi, malattia coronarica rappresenta la eziologia principale. I risultati della fase acuta di infarto del miocardio (MI) ed è seguita da rimodellamento disadattivi che si sviluppa progressivamente verso una fase cronica e insufficienza cardiaca grave. Nonostante i recenti significativi progressi tecnologici e terapeutici, la morbilità e la mortalità dovute alla progressione dello scompenso cardiaco è ancora in crescita ^1. In questo contesto, la terapia cellulare ha guadagnato crescente interesse come una nuova opzione terapeutica per arrestare la progressione della malattia verso l'insufficienza cardiaca e per stimolare la capacità rigenerativa recentemente identificato del miocardio. Indagini sperimentali e clinici hanno fornito prove convincenti degli effetti benefici ottenuti dopo il trapianto cardiaco di vari tipi di cellule. I principali risultati inclusi migliorata cardifunzione contrattile ac, diminuito rimodellamento ventricolare sinistro, ridotta dimensione infartuale, ed ha aumentato la densità vascolare nella zona infartuata. Tuttavia, il basso numero di cellule di conservazione dopo l'iniezione delle cellule è rimasto un importante svantaggio. Associazione di celle con un biomatrice per migliorare di consegna cella ² ha recentemente promosso ricercatore e interessi clinici.

Legatura della discendente anteriore dell'arteria coronaria (LAD) è un metodo di riferimento per MI in piccolo modello animale che provoca infarto transmurale e una cicatrice maturo. La terapia cellulare applicata nella fase cronica di MI richiede un secondo intervento chirurgico. Un sternotomia mediana è di solito eseguita per consentire l'iniezione intramiocardico delle cellule o impianto epicardico di biografts. Tali procedure chirurgiche invasive aumentare il tasso di mortalità, i tempi di recupero post-operatorio, il dolore, e il rischio di infezione. L'approccio mini-invasivo qui presentato non solo impedisce tale distorsione, ma fornisce anche oaccessibilità ptimal del cuore per l'applicazione del trattamento. MI e impianto epicardico delle cellule associate a un tipo di gel biomatrice vengono eseguite su un cuore che batte con toracotomia intercostale sinistro.

Protocollo

NOTA: Lewis ratti maschi e femmine, 200-220 g sono stati alloggiati in condizioni standard di laboratorio (12 ore di luce e buio ciclo, ad libitum acqua e cibo, IVC gabbia). Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le raccomandazioni della FELASA e la legge svizzera sulla protezione degli animali.

1 Cella Preparazione: isolamento di cellule staminali mesenchimali dal midollo osseo

1. Anestetizzare i ratti con isoflurano 5% O ₂ e 5 L / min in una camera di induzione per 5 min. Posizionare muso dell'animale in un cono collegato al sistema di anestesia. Eseguire un pizzico punta o la coda per confermare la sedazione.
2. Togliere la pelle dalla gamba con le forbici tagliando la pelle dalla caviglia all'anca. Togliere i muscoli e tagliare l'arteria femorale per dissanguamento degli animali. Esporre l'articolazione dell'anca e dislocare la testa del femore. E 'importante non danneggiare la testa del femore. Mettere le ossa in PBS sterile in un tubo di plastica da 50 ml.
3. Rimuovere tutti i muscles e legamenti delle ossa senza romperle. NOTA: E 'importante che l'osso rimane intatto per evitare il collegamento di soluzione di lavaggio o contaminazione con etanolo. Sciacquare le ossa pelati in etanolo al 70% per 5 min.
4. Sotto la cappa a flusso laminare sterile, tagliare entrambe le punte delle ossa con le forbici. Lavare il midollo osseo mediante iniezione di PBS sterile dalla estremità dell'osso. Raccogliere osseo in una provetta da 15 ml. Centrifugare 7 min a 300 x g.
5. Rimuovere il surnatante. Sospendere il pellet in 3 ml di globuli rossi Lysis buffer. Incubare la sospensione per 1 min a temperatura ambiente prima della filatura ancora per 7 min a 300 x g. In un pallone di coltura di 150 ml, aggiungere sterile terreno di coltura cellulare (395 ml medio IMDM, 5 penna ml / strep, 100 ml FBS) e seminare le cellule.
6. Modificare media il secondo giorno per rimuovere le cellule non aderenti.
   1. Eseguire i cambiamenti medi ogni secondo giorno per 2-3 settimane, fino ad ottenere la quantità cella desiderata.
   2. In alternativa, preparare il biograft per semezione le cellule sulla matrice solida come necessario e descritto altrove ^3.
7. Il giorno di impianto cardiaco, preparare le cellule o raccogliere il biograft poco prima dell'applicazione epicardico.
   1. Raccogliere le cellule utilizzando soluzione distacco delle cellule Accutase. Contare le cellule. Riempire una provetta da 1,5 ml per centrifuga con il volume della sospensione cellulare calcolate per ottenere quantità cella desiderata. Centrifugare per 7 minuti a 300 xg e rimuovere il surnatante.
   2. In alternativa, raccogliere il biograft da terreno di coltura cellulare, sciacquare in PBS sterile, e tenere in terreno di coltura fresco senza siero.

2 Prima Toracotomia e KOP legatura

1. Pesare il ratto. Accendere il rilievo di riscaldamento a 37 ° C. Anestetizzare il topo con il 5% isoflurano e 5 L / min 100% O ₂ in una camera di induzione per 5-7 min. Eseguire un pizzico punta o la coda per confermare la sedazione. Posizionare il ratto sulla rampa di riscaldamento.
2. Intubare l'animale con un 14G catetere iv. Collegare il catetere intubazione di un ventilatore roditore programmato per 2.5 L / min di ossigeno, 2,5% isoflurano, volume corrente di 2 ml, e una frequenza respiratoria di 90 respiri / min.
3. Preparare una soluzione di buprenorfina a 0.1 mg / kg. Iniettare per via sottocutanea un terzo della soluzione. Radere la parte sinistra del torace. Disinfettare con una soluzione di Betadine 1%.
4. Incidere la pelle perpendicolare allo sterno al quarto spazio intercostale. Separare i 3 strati di muscolatura toracica (pettorale, ascendente pettorale, e pettorale obliqua esterna). Aprire il quarto spazio intercostale (tra nervature 4 e 5).
5. Utilizzare un piccolo divaricatore per diffondere le costole e per esporre il cuore. Aprire con cautela il pericardio. Individuare e legare la discendente anteriore dell'arteria coronaria (LAD) con un 7,0 mm 4 sutura sotto l'atrio.
6. Chiudere lo spazio intercostale con due punti con 3.0 punti di sutura. Posizionare i due punti di sutura prossimale e distale dallo sterno. In primo luogo, tSerrate la sutura distale. Fissare il tubo di scarico ventilatore per 2 secondi per gonfiare il petto ed evitare qualsiasi pneumotorace. Stringere la seconda sutura. Posizionare i muscoli strati a posto (non sono necessari punti di sutura). Chiudere la pelle con un 5.0 sutura.
7. Disinfettare la sutura con una soluzione di Betadine 1%. Iniettare il resto della soluzione buprenorfina. Spegnere il sistema di anestesia. Rimuovere il catetere intubazione.
8. Tenere il topo in gabbia sotto una lampada caldo per 1-2 ore. Mantenere un termometro nella gabbia e controllare la distanza tra la luce calda e la gabbia per evitare il surriscaldamento. Restituire il ratto nell'unità IVC. Iniettare per via sottocutanea Buprenorfina 0,05-0,1 mg / kg dopo -operatively ogni 6-12 ore per 48 ore.

3. epicardico Amministrazione della Via trattamento una seconda Toracotomia

1. Ripetere i passaggi 2,1-2,3.
2. Incidere la pelle perpendicolare allo sterno al quinto spazio intercostale. Separare il 3 stratis del muscolo toracico (grande pettorale, ascendente pettorale e pettorale obliqua esterna). Aprire il quinto spazio intercostale (fra nervature 5 e 6).
3. Utilizzare un piccolo divaricatore per diffondere le costole e per esporre il cuore. Se c'è qualche aderenza, rimuoverli delicatamente con una pinza sottile.
4. Individuare la zona infartuata che appare come un'area pallida sotto la legatura. NOTA: Se necessario, utilizzare un 10 centimetri pezzo di sutura (7.0) inserito al vertice per visualizzare meglio il ventricolo sinistro. Estrarre delicatamente la sutura mantenuto liberamente da un morsetto per esporre il cuore.
5. Applicare uno dei seguenti trattamenti:
   1. Posizionare il biograft alla superficie del cuore. Utilizzare la siringa preriempita di fibrina sigillante preriscaldata a temperatura ambiente per 10 min. Applicare una goccia (50-100 ml) di fibrina sigillante sotto la biograft utilizzando un ago 25 G Luer. Verificare che il biograft sia perfettamente sigillato.
   2. In alternativa, applicare il pellet di cellule raccolte con un puntale in superficie of cuore sull'area pallido sotto la legatura. Applicare una goccia (50-100 ml) di fibrina sigillante sul pellet di cellule.
6. Rimuovere il pezzo di sutura dall'apice.
7. Ripetere i passaggi 2,6-2,8.

Risultati

Tutti gli animali recuperati entro 1 ora dopo toracotomia. La guarigione della ferita è stata rapida. È stata osservata nessuna infezione o edema.

La doppia toracotomia sinistra consentito un accesso ottimale al cuore (Figura 1). Il dolore e la mortalità post-operatoria erano bassi. L'animale recuperato rapidamente dalla chirurgia ed ha guadagnato peso (Figura 2). Kaplan Meir sopravvivenza percentuale è stata del 96% per il primo toracotomia. Quattro rat...

Discussione

La legatura permanente di LAD provoca danno miocardico irreversibile. Il primo modello animale è stato descritto nel 1960 ^4. Da allora, è stato considerato come un modello standard e adatto a MI cronica. La sua stabilità e riproducibilità consentito valutazione sperimentale delle terapie per MI ^5. Miglioramento delle procedure di seguito la descrizione iniziale riportato un tasso di mortalità operatoria del 35-13% ^6.

Come previsto, LAD legatura indotto funzio...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sutura Polysorb 3-0	Covidien	UL 204
Sutura Polysorb 5-0	Covidien	UL 202
Sutura Surgipro II 7-0 Sutura	Covidien	VP904X
Catetere Insyte 14 G	BD	381267
Inspira Ventilatore avanzato a volume controllato	Apparecchio Harvard	557058
pinza Dumont #7	FST Germania	11274-20
Fibrina Sigillante	Baxter	1501441	TISSEEL Colla, Congelato -20 gradi C
Castroviejo Eye Specula	Harvard Apparatus	72-8925	utilizzare come divaricatore per le costole
IMDM GlutaMAX	Gibco	31980
Pen/Strep	Gibco	15140
FBS	PAA Clone	A15-101
Forbici per ossa	Strumenti di scienze fini	16044-10
Soluzione di lisi delle cellule del sangue rossa	Gentra Systems	D-50k1
Soluzione di distacco di cellule accutase	delle cellule staminali	7920