Qui vi presentiamo il nostro metodo stabilito per riprogrammare cellule somatiche umane in libera-transgene iPSCs umane con virus di Sendai, che mostra esito coerente e una maggiore efficienza.
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Articolo metodologico
Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus
In questo articolo
Sommario
Abstract
Alcuni anni fa, la creazione di cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSCs) ha inaugurato una nuova era nel campo della biomedicina. Possibili usi di iPSCs umani comprendono la modellazione patogenesi delle malattie genetiche umane, la terapia cellulare autologa dopo la correzione genica e screening di farmaci personalizzati, fornendo una fonte di cellule rilevanti e sintomi specifici del paziente. Tuttavia, ci sono diversi ostacoli da superare, come eliminare l'espressione del transgene fattore riprogrammazione restante dopo la produzione iPSCs umani. Ancora più importante, l'espressione del transgene residuo in iPSCs umane indifferenziate potrebbe ostacolare differenziazioni corretta e fuorviare l'interpretazione della malattia in questione in fenotipi vitro. Con questo motivo, privo di integrazione e / o iPSCs umani privi di transgene sono state sviluppate utilizzando diversi metodi, quali adenovirus, il sistema piggyBac, minicircle vettore, vettori episomale, la consegna diretta delle proteine e sintetizzato mRNA. Tuttavia, l'efficienza di reprograllo utilizzando metodi libero-integrazione è piuttosto basso nella maggior parte dei casi.
Qui, vi presentiamo un metodo per isolare iPSCs umani utilizzando Sendai-virus (virus RNA) sistema di riprogrammazione based. Questo metodo di riprogrammazione mostra i risultati coerenti e di alta efficienza in modo economicamente efficiente.
Introduzione
Le cellule umane staminali embrionali (hESC) hanno la capacità di auto-rinnovarsi in vitro e hanno pluripotenza, che potrebbe essere potenzialmente utile per la modellazione della malattia, per lo screening di stupefacenti, e di sviluppare le terapie a base di cellule per il trattamento di malattie e lesioni dei tessuti. Tuttavia, hESCs hanno una limitazione per la terapia di sostituzione cellulare a causa delle barriere immunologiche, oncologiche ed etiche, e di studiare i geni correlati alla malattia, hESCs malattie specifiche possono essere isolati attraverso pre-impianto diagnosi genetica preimpianto (PGD) si avvicina, ma è ancora tecnicamente impegnativ....
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Protocollo
1. Preparazione di cellule e dei media (1 ° giorno)
- Cultura ed espandere fibroblasti umani con i media DMEM contenente 10% FBS.
- Piastre fibroblasti umani (Figura 1) su una piastra da 24 pozzetti alla densità appropriata per pozzetto il giorno prima trasduzione.
NOTA: Le seguenti diluizioni seriali sono raccomandati (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K e 6.25K), perché diversi tipi di cellule hanno diverse capacità di attacco. - Incubare le cellule per un giorno a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore, assicurando le cellule hanno pienamente aderito ed esteso.
2. Eseguire tr....
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Risultati
Fibroblasti solito infette non mostrano cambiamenti morfologici in diversi giorni dopo la trasduzione del virus Sendai, ma cinque giorni dopo, cominciano ad avere forme diverse (Figura 1). Come descritto in un pannello di destra della figura 1, le cellule non hanno tipica morfologia fibroblasto più. Hanno una forma rotonda e più grande nucleo di citoplasma. Anche quando trasduzione viene eseguita nel 80% di confluenza cellulare, sembra che siano meno confluenti nel pozzo dopo cominciano.......
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Discussione
Riprogrammazione delle cellule somatiche umane per hiPSCs detiene promesse senza precedenti nella biologia di base, medicina personale, e il trapianto 12. In precedenza, le generazioni IPSC umane necessarie virus a DNA che ha il rischio di integrazione nel genoma dell'ospite, che può creare mutazioni genetiche indesiderabili che limitano ulteriori applicazioni cliniche quali sviluppo di farmaci e terapie di trapianto 13. Con questa ragione, molti studi sono stati riportati per generare-vettore .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Lee per le discussioni importanti sul manoscritto. Il lavoro in laboratorio Lee è stato sostenuto da sovvenzioni dal Robertson Investigator Award of Foundation di New York Stem Cell e dal Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di riprogrammazione CytoTune-iPS | Invitrogen | A1378002 | |
| CF-6, MEF, resistente alla neomicina, trattato con mitomicina C. | Stelo globale | GSC-6105M | 5 x 105/6 cm o 12,5 x 105/piastra a 24 pozzetti |
| Tripsina EDTA 0,25% Tripsina con EDTA 4Na 1X | Invitrogen | 25200114 | |
| DMEM/F-12 medio | Invitrogen | 11330-032 | |
| Piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti, fondo piatto con coperchio | BD | 353935 | |
| Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 μ M (Stock: 10 mM) |
| fattore di crescita dei fibroblasti basici | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Stock: 100 ug) |
| Siero sostitutivo knock-out | Gibco | 10828028 | |
| Dulbecco' s Medium Eagle modificato (D-MEM, DMEM) (1X), liquido (ad alto contenuto di glucosio) | Invitrogen | 11965118 | |
| Siero fetale bovino | Thermo Scientific Fermentas | SH30071,03 | |
| L-Glutammina-200 mM (100X), liquido | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
| MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 1/100 | |
| 2-Mercaptoetanolo (1.000X), | liquido GIBCO | 21985023 | 1/1.000 |
| Hausser Emocitometri a contrasto di fase | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
| EmbryoMax 0,1% Soluzione di | gelatina Millipore | ES-006-B | |
| SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
| anti-Tra-1-81 | Segnalazione cellulare | 4745S | 1/200 |
| anticorpo monoclonale di topo Oct4 | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1.000 |
| Nanog R | & D | AF1997 | 1/1.000 |
| Alexa Flouor 488 capra anti-topo | Invitrogen | 948492 | 1/2.000 |
| DPBS (Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato), 1X senza calcio & magnesio | Cellgro | 21-031-CV | |
| Kit di trascrizione inversa QuantiTect | QIAGEN | 205313 | |
| PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | |
| cappa di prelievo | NuAire | NU-301 | |
| cannocchiale di dissezione | Nikon | SMZ745 |
Riferimenti
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science.....
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Ristampe e permessi
