Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

Summary

Qui vi presentiamo il nostro metodo stabilito per riprogrammare cellule somatiche umane in libera-transgene iPSCs umane con virus di Sendai, che mostra esito coerente e una maggiore efficienza.

Abstract

Alcuni anni fa, la creazione di cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSCs) ha inaugurato una nuova era nel campo della biomedicina. Possibili usi di iPSCs umani comprendono la modellazione patogenesi delle malattie genetiche umane, la terapia cellulare autologa dopo la correzione genica e screening di farmaci personalizzati, fornendo una fonte di cellule rilevanti e sintomi specifici del paziente. Tuttavia, ci sono diversi ostacoli da superare, come eliminare l'espressione del transgene fattore riprogrammazione restante dopo la produzione iPSCs umani. Ancora più importante, l'espressione del transgene residuo in iPSCs umane indifferenziate potrebbe ostacolare differenziazioni corretta e fuorviare l'interpretazione della malattia in questione in fenotipi vitro. Con questo motivo, privo di integrazione e / o iPSCs umani privi di transgene sono state sviluppate utilizzando diversi metodi, quali adenovirus, il sistema piggyBac, minicircle vettore, vettori episomale, la consegna diretta delle proteine ​​e sintetizzato mRNA. Tuttavia, l'efficienza di reprograllo utilizzando metodi libero-integrazione è piuttosto basso nella maggior parte dei casi.

Qui, vi presentiamo un metodo per isolare iPSCs umani utilizzando Sendai-virus (virus RNA) sistema di riprogrammazione based. Questo metodo di riprogrammazione mostra i risultati coerenti e di alta efficienza in modo economicamente efficiente.

Introduction

Le cellule umane staminali embrionali (hESC) hanno la capacità di auto-rinnovarsi in vitro e hanno pluripotenza, che potrebbe essere potenzialmente utile per la modellazione della malattia, per lo screening di stupefacenti, e di sviluppare le terapie a base di cellule per il trattamento di malattie e lesioni dei tessuti. Tuttavia, hESCs hanno una limitazione per la terapia di sostituzione cellulare a causa delle barriere immunologiche, oncologiche ed etiche, e di studiare i geni correlati alla malattia, hESCs malattie specifiche possono essere isolati attraverso pre-impianto diagnosi genetica preimpianto (PGD) si avvicina, ma è ancora tecnicamente impegnativo e le donazioni di embrioni sono piuttosto rari. Questi problemi sono legati al progresso della biologia delle cellule staminali, che ha portato allo sviluppo di cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs).

IPSCs umani sono geneticamente riprogrammate da cellule somatiche adulte umane e porto le caratteristiche di cellule simil-staminali pluripotenti simili a hESCs, che li rende una fonte utile per la medicina rigenerativa, come dscoperta tappeto, modelli di malattia e la terapia cellulare in paziente-specifici ^1,2 maniera.

Fino ad ora, ci sono diversi metodi per generare iPSCs umani, inclusi virus-mediata (retrovirus e adenovirus) ^3, non virus mediata (sistema BAC e vettori di transfezione) ⁴ trasduzioni gene, e di sistema di consegna di proteine ^​​5-7.

Sebbene una consegna di geni del virus-mediata può garantire un certo livello di efficienza, vettori virali potevano lasciare impronta genetica, perché integrano nei cromosomi ospite per esprimere geni riprogrammazione in modo incontrollato. Anche quando integrazione virale di fattori di trascrizione può attivare o inattivare geni ospite ^8, può causare un'aberrazione genetica inattesa e il rischio di tumorigenesi ^5,9. D'altra parte, l'introduzione diretta di proteine ​​o RNA in cellule somatiche sono stati segnalati, ma hanno alcuni svantaggi, come intensità di lavoro, trasf ripetutaezione, e basso livello di riprogrammazione ^7,10. Anche episomale e non integranti adenovirus, virus adeno-associati, e vettori plasmidici sono ancora relativamente meno efficienti ^11. Per queste ragioni, è plausibile scegliere non-integrazione metodi di riprogrammazione con elevata efficacia della generazione iPSC e un minor numero di anomalie genetiche. In questo studio, usiamo una riprogrammazione basata Sendai-virus. Questo metodo è noto per essere non integrata nel genoma dell'ospite e produce costantemente iPSCs umani senza integrazioni transgene.

Protocol

1. Preparazione di cellule e dei media (1 ° giorno)

1. Cultura ed espandere fibroblasti umani con i media DMEM contenente 10% FBS.
2. Piastre fibroblasti umani (Figura 1) su una piastra da 24 pozzetti alla densità appropriata per pozzetto il giorno prima trasduzione.
   NOTA: Le seguenti diluizioni seriali sono raccomandati (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K e 6.25K), perché diversi tipi di cellule hanno diverse capacità di attacco.
3. Incubare le cellule per un giorno a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore, assicurando le cellule hanno pienamente aderito ed esteso.

2. Eseguire trasduzione (Day 2)

1. Il giorno di trasduzione, controllare la densità cellulare e scelto pozzetti densità più efficienti (Figura 2). E 'meglio scegliere tre diverse densità: alta (80 ~ 90%), medio (50 ~ 70%) e bassa (20 ~ 40%).
2. Almeno 1 ora prima di trasduzione, aspirare il fibroblsupporti AST dalle cellule e modificare nuovi 300 ml di mezzo fibroblasti.
3. Rimuovere un set di 4 diversi tubi di virus Sendai dal -80 ° C di stoccaggio. Scongelare ogni provetta allo stesso tempo in un bagno d'acqua a 37 ° per alcuni secondi, e poi le valvole fuori dal bagno di acqua. Dopo di che, scongelare a temperatura ambiente; provette da centrifuga a 6000 xg per 10 sec e disporli sul ghiaccio fino all'uso. Non ricongelare e scongelare il virus dal momento che i titoli non manterrà.
4. Aggiungere i volumi di ciascuna delle quattro tubi virus Sendai (OCT-4, Klf-4, c-Myc e Sox-2) indicati al tubo micro-centrifuga. Assicurarsi che la soluzione viene mescolata ben pipettando delicatamente.
   Ad esempio, se 50K cellule / pozzetto di una 24-pozzetti lookwell per trasduzione:
   (Titer sulla base del certificato di analisi di Life Technologies, può essere diverso da lotto a lotto)
   Tubo hOct-4 = 6,0 x 10 ⁷ CIU, 3 MOI = 5 ml
   Tubo hSox-2 = 6,5 x 10 ⁷ CIU, 3 MOI = 4.6 μ; L
   Tubo hKlf-4 = 6,3 x 10 ⁷ CIU, 3 MOI = 4.8 ml
   Tubo hc-Myc = 7.8 x 10 ⁷ CIU, 3 MOI = 3,8 microlitri
   Totale = 18.2 ml di quattro fattori virali miscela / uno così (50K celle) della piastra da 24 pozzetti
5. A seconda densità cellulari; aggiungere 2X, 1X, 0.5X e volume della miscela virus nel pozzo. Agitare delicatamente la piastra anteriore alla parte posteriore, a sinistra ea destra (2X: 36.4 ml di miscela di virus, 1X: 18,2 microlitri e 0.5X: 9.1 ml).
6. Mettere le cellule a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore e incubare una notte.

3. Sostituzione della Cultura Media (Day 3 & Day 5)

1. 24 ore dopo la trasduzione, sostituire il mezzo con 500 microlitri media fibroblasti fresco.
2. Il giorno 5, cambiare il Piano con i media fibroblasti fresca.

4. Preparare piatti MEF per il Co-cultura (Giorno 8)

1. Preparare cellule MEF in 60 millimetri capsule di Petri con il 10% FBS conteneva DMEM uno day prima passaging fibroblasti trasdotte sul feeder cellule MEF.
   Nota: Stiamo usando 5 x 10 ⁵ del MEF in ogni piatto 60 millimetri.

5. Avvio co-coltura con cellule trasdotte Feeder MEF (Giorno 9)

1. Prima di placcatura cellule trasdotte, aspirare il 10% FBS conteneva DMEM supporto dai piatti alimentatore MEF e aggiungere fresco del 10% FBS conteneva DMEM.
2. Rimuovere il terreno dai fibroblasti trasdotti che sono 24 pozzetti e lavare le cellule una volta con D-PBS. Aggiungere 200 ml di 0,25% tripsina / EDTA nelle cellule di fibroblasti inthe 24-pozzetti. Dopo meno di 5 minuti di incubazione con tripsina / EDTA, quando le cellule iniziano a staccarsi dalla piastra, raccogliere le cellule con mezzo di coltura in tubo da 15 ml. Poi si centrifuga a 6000 g per 4 min.
   NOTA: Pooling 2X, 1X, e il virus 0.5X è raccomandato fibroblasti trasdotte.
3. Rimuovere il mezzo surnatante e lavare per risospendereil pellet cellulare con 4-5 ml di terreno fresco fibroblasti di neutralizzazione da tripsina. Poi centrifugare a 135 g per 4 min.
4. Cellule Piastra come densità diluizione seriale e iniziare a co-coltura di fibroblasti con i media sul MEF: come 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 e 1/128 a 60 mm piatto. A seconda del tasso di morte delle cellule durante la prima settimana di trasduzione, non si può avere bisogno di diluire a 1/2 o 1/128 densità. Mettere da parte cellule rimanenti per estrarre l'RNA totale come controllo positivo per Transgene RT-PCR.
5. Porre 60 millimetri piatti 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore durante la notte.

6. Feed Cellule Staminali embrionali umane a medio e Controllo delle Cellule (Giornata 10)

1. Il giorno dopo, cambiare i media fibroblasti ai media ES umana con 10 pM Y-27632. Dopo di che, cambiare medio giornaliero con terreno ES umana: 800 ml DMEM/F12 + 200 ml Knockout siero sostituzione + 10 ml di L-Glutammina + 10 ml di 10 mM MEM aminoacidi non essenziali minimi+ 1 ml di 2-mercaptoetanolo + 10 ng / ml di fattore base di crescita dei fibroblasti.
2. Fare un cambiamento dei media ogni giorno con mezzi freschi umane ES. Dopo una settimana, controllare i piatti una volta ogni 2 ~ 3 giorni sotto un microscopio per la formazione di grumi di cellule ES colonia-like. A seconda del tipo di cellula, la cultura vorrà più o meno tempo prima colonie si trovano.

7. Picking staminali pluripotenti indotte colonie di cellule ed espandere la Cells (giorno 20 ~)

1. Tre settimane dopo la trasduzione, le colonie dovrebbero apparire cresciuto correttamente per la raccolta.
2. Il giorno prima di prendere le colonie, preparare alimentatore MEF a 24 pozzetti.
   NOTA: Stiamo usando 12,5 x 10 ⁵ del MEF in una piastra da 24 pozzetti.
3. Il giorno dopo, cambiare mezzo di piatti MEF dai media fibroblasti a supporto ES umana con 10 pM Y-27632. Scegliere manualmente una colonia in ogni tempo sotto il microscopio alla raccolta-cappuccio e macchie più piccole pipettando e trasferirlisulla nuova preparati MEF dishes.Try di scegliere diversi cloni.
4. Passaggio ed espandere l'ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti di una piastra inizialmente 6 bene. Poi da un 6-pozzetti a 60 mm piatti prima di ulteriore moltiplicazione.

8. Caratterizzazione di iPSCs umano (dopo 10 passaggi)

1. Immunofluorescenza
   1. Piatto iPSCs umani in lamiera e della cultura 24 pozzetti durante 4-5 giorni con cambio giornaliero dei media.
   2. Per avviare test immunofluorescenza, lavare la piastra con D-PBS volta. Poi fissare le cellule immediatamente nello 0,4% paraformaldeide per 30 min. Dopo che lavare tre volte in D-PBS per 5 min.
   3. Trattare cellule fissate con 0.1% Triton X-100 in PBS soluzione per 15 minuti a temperatura ambiente.
   4. Aspirare la soluzione permeablization (0,1% triton X-100 soluzione), poi aggiungere BSA soluzione bloccante 0,5% per 1 ora a temperatura ambiente.
   5. Eseguire una rilevazione di Nanog, Oct-4, SSE (antig embrionale stadio-specificait) e TRA-1-81 (tumore rifiuto antigene) utilizzando un anticorpo anti-umano in soluzione BSA allo 0,5% (controllare la tabella materiale per tasso di diluizione di anticorpi). Incubare anticorpo primario per 2 ore a temperatura ambiente. Quindi lavare tre volte in D-PBS per 5 minuti ciascuno.
   6. Verificare usando la microscopia a fluorescenza dopo 1 ora di incubazione con Alexa Fluor 488 di capra anti-topo IgG come 2 ^° anticorpi, che vengono diluiti in soluzione 1:2.000 BSA 0,5% a temperatura ambiente. Colorare tutti i nuclei di ogni MEF cellule feeder e hiPSCs con DAPI.
2. RT-PCR di Transgene Conferma
   1. Estrarre mRNA totale di pellet cella utilizzando reagenti di estrazione di RNA.
   2. Fare una trascrizione inversa su aliquote (1 mg) di RNA totale e il cDNA risultante per l'amplificazione PCR da trascrittasi inversa.
   3. Preparare le miscele PCR per contenere 2 ml di cDNA, 10 ml di 2X PCR master mix, 2 ml di 2 pmol di primer(Avanti: 1 ml e reverse: 1 ml) e 6 ml di DW. Per rilevare l'espressione genica, apportare la RT-PCR con i primer elencati nella Tabella 1.
   4. Eseguire la RT-PCR con gene GAPDH come controllo per l'efficienza delle reazioni di amplificazione. Visualizzare e analizzare prodotto di PCR dell'1% elettroforesi su agarosio-gel.

Results

Fibroblasti solito infette non mostrano cambiamenti morfologici in diversi giorni dopo la trasduzione del virus Sendai, ma cinque giorni dopo, cominciano ad avere forme diverse (Figura 1). Come descritto in un pannello di destra della figura 1, le cellule non hanno tipica morfologia fibroblasto più. Hanno una forma rotonda e più grande nucleo di citoplasma. Anche quando trasduzione viene eseguita nel 80% di confluenza cellulare, sembra che siano meno confluenti nel pozzo dopo cominciano...

Discussion

Riprogrammazione delle cellule somatiche umane per hiPSCs detiene promesse senza precedenti nella biologia di base, medicina personale, e il trapianto ^12. In precedenza, le generazioni IPSC umane necessarie virus a DNA che ha il rischio di integrazione nel genoma dell'ospite, che può creare mutazioni genetiche indesiderabili che limitano ulteriori applicazioni cliniche quali sviluppo di farmaci e terapie di trapianto ^13. Con questa ragione, molti studi sono stati riportati per generare-vettore ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit di riprogrammazione CytoTune-iPS	Invitrogen	A1378002
CF-6, MEF, resistente alla neomicina, trattato con mitomicina C.	Stelo globale	GSC-6105M	5 x 105/6 cm o 12,5 x 105/piastra a 24 pozzetti
Tripsina EDTA 0,25% Tripsina con EDTA 4Na 1X	Invitrogen	25200114
DMEM/F-12 medio	Invitrogen	11330-032
Piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti, fondo piatto con coperchio	BD	353935
Y-27632	TOCRIS	1254	10 μ M (Stock: 10 mM)
fattore di crescita dei fibroblasti basici	LIFE TECHNOLOGIES	PHG0263	10 ng (Stock: 100 ug)
Siero sostitutivo knock-out	Gibco	10828028
Dulbecco' s Medium Eagle modificato (D-MEM, DMEM) (1X), liquido (ad alto contenuto di glucosio)	Invitrogen	11965118
Siero fetale bovino	Thermo Scientific Fermentas	SH30071,03
L-Glutammina-200 mM (100X), liquido	GIBCO	25030-081	1/100
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali, 100X	LIFE TECHNOLOGIES		1/100
2-Mercaptoetanolo (1.000X),	liquido GIBCO	21985023	1/1.000
Hausser Emocitometri a contrasto di fase	Hausser Scientific	02-671-54
EmbryoMax 0,1% Soluzione di	gelatina Millipore	ES-006-B
SSEA-4	DSHB	MC-813-70	1/200
anti-Tra-1-81	Segnalazione cellulare	4745S	1/200
anticorpo monoclonale di topo Oct4	Santa Cruz	SC-5279	1/1.000
Nanog R	& D	AF1997	1/1.000
Alexa Flouor 488 capra anti-topo	Invitrogen	948492	1/2.000
DPBS (Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato), 1X senza calcio & magnesio	Cellgro	21-031-CV
Kit di trascrizione inversa QuantiTect	QIAGEN	205313
PCR Master Mix [2X]	Thermo Scientific Fermentas	K0171
Trizol	Invitrogen	15596018
cappa di prelievo	NuAire	NU-301
cannocchiale di dissezione	Nikon	SMZ745