Attivazione Monitoraggio del Pattern Recognition antivirale recettori RIG-I E PKR By limitata proteasi Digestione e PAGE Native

Sommario

Difese innate alle infezioni virali sono attivati ​​da recettori di pattern recognition (PRR). I due PRRs citoplasmatici RIG-I e PKR legano a RNA virali firma, il cambiamento di conformazione, oligomerize, e attivare la segnalazione antivirale. Metodi sono descritti che consentono di tenere sotto controllo la commutazione conformazionale e l'oligomerizzazione di questi PRRs citoplasmatici.

Abstract

Difese dell'ospite all'infezione da virus dipendono da una rapida individuazione da parte dei recettori pattern recognition (PRR) del sistema immunitario innato. Nel citoplasma, i PRRs RIG-I e PKR legano a specifici ligandi di RNA virale. Questa prima media commutazione conformazionale e oligomerizzazione e quindi permette l'attivazione di una risposta interferone antivirale. Mentre i metodi per misurare l'espressione genica ospite antivirale sono ben stabiliti, i metodi per monitorare direttamente gli stati di attivazione del RIG-I e PKR sono solo parzialmente e meno ben stabilite.

Qui, descriviamo due metodi per monitorare RIG-I e PKR stimolazione al momento dell'infezione, con un induttore di interferone stabilita, il virus della febbre della Rift Valley clone mutante 13 (Cl 13). Tripsina digestione limitata permette di analizzare alterazioni nella sensibilità proteasi, indicando cambiamenti conformazionali delle PRRs. Tripsina digestione dei lisati da finte infetti cellule si traduce in una rapida degradazione di RIG-I e PKR, whereas Cl 13 infezione porta alla nascita di un RIG-I frammento resistente alle proteasi. Anche PKR mostra una resistenza parziale virus-indotto a digestione con tripsina, che coincide con la sua caratteristica fosforilazione in Thr 446. La formazione di RIG-I e oligomeri PKR ha convalidato nativo elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE). Al momento dell'infezione, vi è un forte accumulo di RIG-I e PKR oligomeri, che queste proteine ​​sono rimasti come monomeri in campioni infetti finto.

Digestione proteasi Limited e PAGE nativo, entrambi accoppiati ad analisi Western Blot, consentono una misurazione sensibile e diretto di due diverse fasi di RIG-I e l'attivazione PKR. Queste tecniche sono relativamente facili e veloci da eseguire e non richiedono attrezzature costose.

Introduzione

Un evento cruciale nella difesa ospite antivirale è il rapido rilevamento del patogeno da parte dei cosiddetti recettori pattern recognition (PRR) ^1,2. Rilevamento intracellulare di infezione da virus RNA dipende da due elicasi RNA citoplasmatici, RIG-I (acido retinoico gene inducibile I) e md5 se si usano (differenziazione melanoma associato proteine ​​5) ^3-5. RIG-I è composto di due domini N-terminali caspasi assunzione (CARDs), un tipo DECH-box dominio RNA elicasi centrale, e un dominio C-terminale (CTD) ^4,6. Considerando che il CTD e il dominio elicasi sono necessari per il riconoscimento del non-self (RNA virale), le carte mediar....

Protocollo

1. Semina di cellule A549 per infezione

1. Coltivare una fiasca T75 di cellule A549 a 37 ° C e 5% di CO ₂ nel terreno di coltura (DMEM supplementato con 10% FCS, 526,6 mg / l di L-glutammina, 50.000 U / l di penicillina e 50 mg / l di streptomicina).
2. Prima di iniziare a raccogliere le cellule, scaldare mezzo di coltura cellulare, PBS e 0,05% tripsina-EDTA riscaldata a bagnomaria a 37 ° C.
3. Rimuovere il terreno e lavare le cellule con 10 ml di PBS. Togliere nuovamente il PBS.
4. Aggiungere 3 ml di tripsina-EDTA e distribuire equamente nel pallone. Trasferire la beuta in un incubatore con 37 ° C e 5% di CO _2.

Risultati

Il riconoscimento di un agonista virale RIG-I o PKR trigger switching conformazionale ^6,17,30 e oligomerizzazione ^6,18,27. Abbiamo analizzato questi due marcatori di attivazione da parte limitato la digestione della proteasi e nativo elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE), rispettivamente.

Cellule umane A549 sono state infettate con virus della febbre della Rift Valley clone 13 (Cl 13), che è caratterizzata da una mutazione dell'antagonista IFN NSs ^35,36.

Discussione

Percependo la presenza di virus e l'attivazione del tipo antivirale IFN sistema sono cruciali per il successo delle risposte immunitarie innate ^22. Rilevamento di virus viene così mediata da recettori di riconoscimento dei patogeni (PRR) come RIG-I e PKR, consentendo una risposta rapida e l'attivazione dei meccanismi di difesa antivirale. Qui, descriviamo due metodi per valutare direttamente lo stato di attivazione di RIG-I e PKR.

Digestione proteasi limitata come strument.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Coltura cellulare
Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (DMEM)	Gibco	21969-035
OptiMEM	Gibco	31985-47
L-glutammina	PAA	25030-024
Penicillina-streptomicina	PAA	15070-063
Siero fetale di vitello (FCS)	PAA	10270
0,05% Tripsina-EDTA	Gibco	25300-054
Chemicals
L-1-tosylamido-2-feniletiltil clorometil chetone trattato (TPCK) tripsina	Sigma Aldrich	T1426
Antibodies
Mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1)	Enzo Life Sciences	ALX-804-849-C100	WB: 1:500 in 1% di latte scremato in TBS
Mouse monoclonale anti-PKR (B10)	Santa Cruz	sc-6282	WB: 1:500 in 1% di latte scremato in TBS
Coniglio monoclonale anti-P-PKR (Thr446)	Epitomica	1120-1	WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS
Coniglio policlonale anti-IRF-3	Santa Cruz	sc-9082	WB: 1:500 in 1% di latte scremato in TBS
Coniglio monoclonale anti-P-IRF-3 (Ser386)	IBL	og-413	WB: 1:100 in 1% di latte scremato in TBS
Siero iperimmune anti-RVFV di coniglio "C2" (MP-12)	Gentilmente fornito da Alejandro Brun CISA-INIA		WB: 1:2.000 in latte scremato all'1% in TBS
Anti-beta-actina monoclonale di topo (8H10D10)	Segnalazione cellulare	3700	WB: 1:1.000 in latte scremato all'1% in TBS
Capra coniugata con perossidasi policlonale anti-coniglio	Thermo Fisher	0031460 1892914	WB: 1:20.000 in latte scremato all'1% in TBS
Thermo Fisher 0031430 1892913 WB di capra coniugato con perossidasi policlonale coniugata			in TBS