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Articolo metodologico

Attivazione Monitoraggio del Pattern Recognition antivirale recettori RIG-I E PKR By limitata proteasi Digestione e PAGE Native

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⸱

DOI:

10.3791/51415

⸱

29 luglio 2014

 , 
1Institute for Virology, Philipps-University Marburg

In questo articolo

Sommario

Difese innate alle infezioni virali sono attivati ​​da recettori di pattern recognition (PRR). I due PRRs citoplasmatici RIG-I e PKR legano a RNA virali firma, il cambiamento di conformazione, oligomerize, e attivare la segnalazione antivirale. Metodi sono descritti che consentono di tenere sotto controllo la commutazione conformazionale e l'oligomerizzazione di questi PRRs citoplasmatici.

Abstract

Difese dell'ospite all'infezione da virus dipendono da una rapida individuazione da parte dei recettori pattern recognition (PRR) del sistema immunitario innato. Nel citoplasma, i PRRs RIG-I e PKR legano a specifici ligandi di RNA virale. Questa prima media commutazione conformazionale e oligomerizzazione e quindi permette l'attivazione di una risposta interferone antivirale. Mentre i metodi per misurare l'espressione genica ospite antivirale sono ben stabiliti, i metodi per monitorare direttamente gli stati di attivazione del RIG-I e PKR sono solo parzialmente e meno ben stabilite.

Qui, descriviamo due metodi per monitorare RIG-I e PKR stimolazione al momento dell'infezione, con un induttore di interferone stabilita, il virus della febbre della Rift Valley clone mutante 13 (Cl 13). Tripsina digestione limitata permette di analizzare alterazioni nella sensibilità proteasi, indicando cambiamenti conformazionali delle PRRs. Tripsina digestione dei lisati da finte infetti cellule si traduce in una rapida degradazione di RIG-I e PKR, whereas Cl 13 infezione porta alla nascita di un RIG-I frammento resistente alle proteasi. Anche PKR mostra una resistenza parziale virus-indotto a digestione con tripsina, che coincide con la sua caratteristica fosforilazione in Thr 446. La formazione di RIG-I e oligomeri PKR ha convalidato nativo elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE). Al momento dell'infezione, vi è un forte accumulo di RIG-I e PKR oligomeri, che queste proteine ​​sono rimasti come monomeri in campioni infetti finto.

Digestione proteasi Limited e PAGE nativo, entrambi accoppiati ad analisi Western Blot, consentono una misurazione sensibile e diretto di due diverse fasi di RIG-I e l'attivazione PKR. Queste tecniche sono relativamente facili e veloci da eseguire e non richiedono attrezzature costose.

Introduzione

Un evento cruciale nella difesa ospite antivirale è il rapido rilevamento del patogeno da parte dei cosiddetti recettori pattern recognition (PRR) 1,2. Rilevamento intracellulare di infezione da virus RNA dipende da due elicasi RNA citoplasmatici, RIG-I (acido retinoico gene inducibile I) e md5 se si usano (differenziazione melanoma associato proteine ​​5) 3-5. RIG-I è composto di due domini N-terminali caspasi assunzione (CARDs), un tipo DECH-box dominio RNA elicasi centrale, e un dominio C-terminale (CTD) 4,6. Considerando che il CTD e il dominio elicasi sono necessari per il riconoscimento del non-self (RNA virale), le carte mediare segnalazione a valle che porta alla creazione di uno stato di ospite antivirale.

Se RIG-I è nello stato silenzioso, cioè in assenza di uno specifico ligando di RNA, la seconda carta interagisce con il dominio elicasi centrale e mantiene RIG-I in un auto-inibitrice conformazione 7-11. RIG-I si lega a breve doppiofilamento (ds) RNA recante un 5'-trifosfato (5'PPP), lungo dsRNA, e poliureta / UC-ricchi RNA, strutture firma classici che sono presenti sui genomi di molti virus a RNA 12-16. Due importanti caratteristiche di attivazione RIG-I sono un passaggio a una conformazione chiusa 6,17 e omo-oligomerizzazione 6,18,19. L'interruttore conformazionale migliora RNA vincolante, espone le schede per la segnalazione a valle, e ricostituisce un sito ATPasi attivo 8,9,11,20. La formazione di oligomeri RIG-I porta ad una maggiore assunzione di molecole adattatrici segnalazione a valle per formare una piattaforma per antivirale trasduzione del segnale 11. La catena di segnalazione RIG-I-regolato casualmente attiva il fattore di trascrizione IRF-3 per up-regolazione di interferone (IFN-alpha/beta) geni e quindi l'espressione del gene dell'interferone stimolato geni (ISGS) per una completa risposta antivirale 21,22 . Uno dei migliori caratterizzato ISGS è la protei RNA-activatedn chinasi (PKR) 23. PKR appartiene alla famiglia delle eucariotico traduzione iniziazione fattore alfa 2 (eIF2α chinasi) ed è composto da un doppio filamento RNA dominio di legame N-terminale e un dominio chinasi C-terminale. Il dominio di chinasi costituisce l'interfaccia dimerizzazione cruciale per l'attivazione PKR e svolge le funzioni catalitiche della proteina. Il legame di PKR a dsRNA virale porta al suo cambiamento conformazionale che consente dimerizzazione e auto-fosforilazione in Thr 446 tra gli altri residui. PKR poi media fosforilazione di eIF2α, bloccando così la traduzione di mRNA virale 23-27.

Entrambi RIG-I e PKR subisco grandi riarrangiamenti strutturali, formare complessi oligomerici e sono post-traduzionali modificato dalla fosforilazione / defosforilazione e di ubiquitinazione 10,11,19,23,24,26-29. Per una migliore comprensione dei quali strutture di RNA virali stanno attivando RIG-I e PKR (e in quale fase antagonisti virali potrebbe be interferenza), è importante determinare con precisione lo stato di attivazione. Per entrambi PRR è stato descritto in precedenza che l'attivazione porta alla nascita di frammenti proteici tripsina-resistente 6,17,30 e oligomeri di ordine superiore 6,18,19. Tuttavia, data la ricchezza di letteratura su questi fattori chiave della risposta dell'ospite antivirale 1,2,24, applicazione di metodi diretti sembra relativamente rari. Nella speranza di stimolare l'utilizzo più ampio, forniamo protocolli convenienti e sensibili per analizzare con fermezza gli stati di attivazione del RIG-I e PKR. L'IFN competente A549 linea cellulare umana è stato infettato da un attivatore consolidata di RIG-I e PKR, la attenuato virus della febbre della Rift Valley clone mutante 13 (Cl 13) 31,32. Dopo una semplice procedura di lisi, gli estratti di cellule infette sono testati dalla limitata tripsina digestione / Western Blot per valutare switching conformazionale, e blu elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo (PAGINA) / Analys Western Blotè quello di misurare la formazione di oligomeri.

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Protocollo

1. Semina di cellule A549 per infezione

  1. Coltivare una fiasca T75 di cellule A549 a 37 ° C e 5% di CO 2 nel terreno di coltura (DMEM supplementato con 10% FCS, 526,6 mg / l di L-glutammina, 50.000 U / l di penicillina e 50 mg / l di streptomicina).
  2. Prima di iniziare a raccogliere le cellule, scaldare mezzo di coltura cellulare, PBS e 0,05% tripsina-EDTA riscaldata a bagnomaria a 37 ° C.
  3. Rimuovere il terreno e lavare le cellule con 10 ml di PBS. Togliere nuovamente il PBS.
  4. Aggiungere 3 ml di tripsina-EDTA e distribuire equamente nel pallone. Trasferire la beuta in un incubatore con 37 ° C e 5% di CO 2.
  5. Quando tutte le cellule vengono staccate, aggiungere 7 ml di mezzo di coltura cellulare, risospendere le cellule, e trasferire la sospensione cellulare in un tubo Falcon da 15 ml.
  6. Centrifugare le cellule a 800 xg per 5 min a temperatura ambiente, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 10 ml di mezzo di coltura cellulare fresca.
  7. Contare le cellule con una camera di conteggio.
  8. Aggiungere 2,5 x 10 6 cellule in 5 ml di terreno di coltura in due fiasche T25 ciascuno. Incubare per 16 ore a 37 ° C e 5% di CO 2. Una beuta serve per il controllo finto e uno per l'infezione Cl 13.

2. L'infezione da febbre della Rift Valley Virus Clone 13 (Cl 13)

  1. NOTA: Cl 13 è un mutante virus attenuato che in Germania può essere gestito in BSL-2 condizioni. Si prega di fare riferimento alle relative linee guida nazionali. Altri induttori tipici IFN sarebbero virus Sendai (ceppo Cantell) o del virus della malattia di Newcastle.
  2. , Terreno privo di siero pre-riscaldare PBS, e mezzo di coltura cellulare contenente 5% FCS.
  3. Preparare 1,25 x 10 7 PFU / ml di Cl 13 in terreno privo di siero per infettare 2,5 x 10 6 cellule A549 con una molteplicità di infezione (MOI) di 5. Preparare una leggera (circa 10%) quantità maggiore di quella necessaria per tenere conto errori pipetta.
  4. Lavare le cellule con PBS come descritto al punto 1.3.
  5. Aggiungere 1 ml della diluizione Cl 13 odi mezzo privo di siero (controllo non infetto, finto) alle cellule e incubare per 1 ora a 37 ° C e 5% di CO 2. Spostare il pallone con attenzione ogni 15 min per assicurare un'equa distribuzione delle Cl 13 diluizione e mezzo privo di siero, rispettivamente.
  6. Dopo 1 ora di infezione, rimuovere l'inoculo, aggiungere 5 ml di pre-riscaldato terreno di coltura cellulare con 5% FCS, e incubare per 5 ore a 37 ° C e 5% di CO 2.

3. Preparazione dei lisati cellulari

  1. Preparare PBS / 0,5% Triton X-100 a 4 ° C. Non aggiungere inibitori della proteasi serina.
  2. Lavare le cellule con PBS freddo e aggiungere 10 ml di PBS fresco.
  3. Raschiare le cellule fuori, trasferire la sospensione cellulare in un tubo Falcon, e centrifugare a 800 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
  4. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 30 microlitri di PBS / 0,5% Triton X-100. Trasferire il lisato in una fiala da 1,5 ml ed incubare per almeno 10 minuti a 4 ° C.
  5. Centrifugare il lisato alle 10.000 xg per 10 min a 4 ° C e trasferire il lisato chiarificato (surnatante) in una nuova provetta.
  6. Determinare la concentrazione proteica mediante saggio Bradford come descritto altrove 33.
  7. Conservare a -20 ° C o procedi alla digestione tripsina (4.1) o PAGE nativo (5.1).

4. Determinazione dei conformazionale cambiamenti di Pattern Recognition Recettori

  1. Trattamento TPCK-tripsina dei lisati cellulari
    1. Diluire L-1-tosylamido-2-feniletile clorometil chetone trattati (TPCK) tripsina in PBS ad una concentrazione finale di lavoro di 2 mg / mL.
    2. Regolare in due nuovi tubi una concentrazione proteica finale di 25 mg di ciascun lisato (finto o Cl 13) di proteine ​​in un volume finale di 9 ml con PBS. Quindi, dovrebbe essere quattro tubi con 25 mg lisato ciascuna, due volte finte e due volte Cl 13 infezione. Una impostato come controllo di input (non trattato) e un set per il trattamento con TPCK-tripsina.
    3. Aggiungere 1 ml di PBS (non trattato)o 1 ml di 2 mg / mL TPCK-tripsina (concentrazione finale: 0,2 mg / mL) per i lisati cellulari e mescolare le reazioni pipettando. NON congelare e scongelare aliquote TPCK-tripsina, perché compromette l'efficienza della digestione.
    4. Incubare lisati a 37 ° C per 25 min. Arrestare la reazione aggiungendo 5x denaturazione tampone campione (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% glicerolo, 25% β-mercaptoetanolo, 0,5% blu di bromofenolo) e facendo bollire per 5 min a 95 ° C. È importante NON estendere il tempo di incubazione tripsina. Nel caso nessun frammento resistente alle proteasi sono rilevabili, il tempo di digestione con tripsina deve essere accorciata.
    5. Dopo la bollitura, i campioni possono essere conservati a -20 ° C.
  2. SDS poliacrilammide gel elettroforesi (PAGE) e Western Blotting
    1. Caricare i campioni su un dodecil solfato di sodio (SDS) gel di poliacrilammide contenente un impilamento 5% su un gel risolvere 12%. Separare le proteine ​​a 25 mA per gel finoil blu di bromofenolo esaurisce.
    2. Attiva una fluoruro di polivinilidene (PVDF) membrana per 30 secondi con metanolo e metterla in tampone di trasferimento (Tris 48 mM, glicina 39 mM, SDS 1,3 mM, 20% metanolo).
    3. Preparare la blotting con un sistema blotting semisecco e consentire il trasferimento delle proteine ​​a 10 V per 1 ora. Prendere la membrana fuori, sciacquare brevemente con acqua e lasciare asciugare.
    4. Riattivare la membrana da poco il trasferimento in metanolo. Lavare per 5 minuti con TBS. Bloccare con il 10% di latte scremato in TBS per 1 ora a RT o a 4 ° CO / N. Lavare il 3x membrana per 5 minuti ciascuno con TBS.
    5. Preparare la diluizione anticorpo come indicato nella Tabella 1 e incubare la membrana per 1 ora a temperatura ambiente oa 4 ° CO / N.
    6. Lavare 3x membrana per 10 minuti ciascuno con TBS-T. Aggiungere l'anticorpo secondario appropriato accoppiato con perossidasi di rafano alla diluizione 1:20.000 in 1% di latte scremato in TBS. Incubare 45 minuti a temperatura ambiente.
    7. Lavare 3x membrana per 10 minuti ciascuno con TBS-T e otempo supplementare ne con TBS.
    8. Per il rilevamento del segnale utilizzando un kit commerciale chemiluminescense e un sistema di imaging gel digitale.
  3. Blu brillante Coomassie G-250 Colorazione
    1. Eseguire SDS-PAGE come descritto al punto 4.2.1. Caricare i campioni su un gel di poliacrilammide SDS ed eseguire il gel a 25 mA per gel fino bromofenolo blu si esaurisce.
    2. Eseguire Coomassie Brilliant colorazione blu G-250 a RT. Fate tutte le incubazioni sotto costante agitazione.
    3. Trasferire il gel alla soluzione di fissaggio contenente il 40% di metanolo e acido acetico 10% per 30 min.
    4. Scambiare il buffer di soluzione decolorante (25% etanolo e acido acetico all'8%) e incubare per 5 min.
    5. Macchiare il gel con 0,2% Coomassie Brillant blu G-250 in 40% metanolo e acido acetico 10% per 1 ora.
    6. Destain gel con la soluzione decolorante e scambiare buffer dopo 10 min, 30 min e 60 min.
    7. Conservare il gel in 25% di etanolo, acido acetico all'8% e 4% glicerolo a 4 ° C.
    8. Eseguire l'imaging e di analisi come descritto al punto 4.2.8.

5. Analisi della oligomeriche membri di Pattern Recognition recettori

  1. PAGINA Native
    1. Preparare 50 pg di lisato cellulare in un volume finale di 10 ml con PBS e aggiungere 5 × tampone nativo campione (250 mM Tris-HCl pH 6.8, 1% desossicolato di sodio, 50% glicerolo, 0,5% blu di bromofenolo) ad una concentrazione finale di 1x.
    2. Caricare immediatamente i campioni su un gel di poliacrilammide nativo con 5% come impilabile e 8% come risolvere gel. Qualsiasi ritardo si tradurrà in una perdita di complessi nativi 34.
    3. Attivare il gel a 20 mA per gel a 4 ° C con 50 mM Tris-NaOH pH 9,0, 384 mM glicina come come anodo e 50 mM Tris pH 8,3, 384 mM glicina, 1% sodio desossicolato come tampone catodo. Dopo 1,5-2 ore (blu di bromofenolo band ha lasciato il gel circa 45 min prima) l'elettroforesi è finito.
  2. Western blotting
    1. Attivare un polyvinylidene fluoruro (PVDF) membrana per 30 secondi con metanolo e metterla in tampone Towbin (Tris 25 mM, glicina 192 mM, 0,1% SDS, 20% metanolo).
    2. Assemblare una camera di macchia umido secondo le istruzioni del produttore e riempire il serbatoio con il tampone Towin.
    3. Eseguire il blotting con 250 mA per 1,5 ore a 4 ° C.
    4. Quando assorbente è finito procedere come descritto da 4.2.3 a.

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Risultati

Il riconoscimento di un agonista virale RIG-I o PKR trigger switching conformazionale 6,17,30 e oligomerizzazione 6,18,27. Abbiamo analizzato questi due marcatori di attivazione da parte limitato la digestione della proteasi e nativo elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE), rispettivamente.

Cellule umane A549 sono state infettate con virus della febbre della Rift Valley clone 13 (Cl 13), che è caratterizzata da una mutazione dell'antagonista IFN NSs 35,3...

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Discussione

Percependo la presenza di virus e l'attivazione del tipo antivirale IFN sistema sono cruciali per il successo delle risposte immunitarie innate 22. Rilevamento di virus viene così mediata da recettori di riconoscimento dei patogeni (PRR) come RIG-I e PKR, consentendo una risposta rapida e l'attivazione dei meccanismi di difesa antivirale. Qui, descriviamo due metodi per valutare direttamente lo stato di attivazione di RIG-I e PKR.

Digestione proteasi limitata come strument...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

Ringraziamo Alejandro Brun dal CISA-INIA per la fornitura di anti-febbre della Rift Valley Virus sieri. Il lavoro nei nostri laboratori è supportato da Forschungsförderung gioiello. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, il Leibniz Graduate School per le malattie virali emergenti (EIDIS), la DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, e la DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Coltura cellulare
Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (DMEM)Gibco21969-035
OptiMEMGibco31985-47
L-glutamminaPAA25030-024
Penicillina-streptomicinaPAA15070-063
Siero fetale di vitello (FCS)PAA10270
0,05% Tripsina-EDTAGibco25300-054
Chemicals
L-1-tosylamido-2-feniletiltil clorometil chetone trattato (TPCK) tripsinaSigma AldrichT1426
Antibodies
Mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1)Enzo Life SciencesALX-804-849-C100WB: 1:500 in 1% di latte scremato in TBS
Mouse monoclonale anti-PKR (B10)Santa Cruzsc-6282WB: 1:500 in 1% di latte scremato in TBS
Coniglio monoclonale anti-P-PKR (Thr446)Epitomica1120-1WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS
Coniglio policlonale anti-IRF-3Santa Cruzsc-9082WB: 1:500 in 1% di latte scremato in TBS
Coniglio monoclonale anti-P-IRF-3 (Ser386)IBLog-413WB: 1:100 in 1% di latte scremato in TBS
Siero iperimmune anti-RVFV di coniglio "C2" (MP-12)Gentilmente fornito da Alejandro Brun CISA-INIAWB: 1:2.000 in latte scremato all'1% in TBS
Anti-beta-actina monoclonale di topo (8H10D10)Segnalazione cellulare3700WB: 1:1.000 in latte scremato all'1% in TBS
Capra coniugata con perossidasi policlonale anti-coniglioThermo Fisher0031460 1892914WB: 1:20.000 in latte scremato all'1% in TBS
Thermo Fisher 0031430 1892913 WB di capra coniugato con perossidasi policlonale coniugatain TBS

Riferimenti

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