Qui si descrive un adattamento dei protocolli usati per indurre plasticità omeostatica nei neuroni per lo studio della plasticità dei recettori accoppiati a proteina G astrociti. Utilizzati di recente per esaminare i cambiamenti nel gruppo astrociti I mGluRs nei topi giovani, il metodo può essere applicato per misurare il ridimensionamento di diversi GPCR astrocitiche, in tessuto dai topi adulti in situ e in vivo, e di ottenere un migliore apprezzamento della sensibilità dei recettori astrocitici a cambiamenti nell'attività neuronale.
Vicino a due decenni di ricerca ha stabilito che gli astrociti in situ e in vivo esprimono numerosi recettori accoppiati alla proteina G (GPCR) che possono essere stimolati da trasmettitore neuronally rilasciato. Tuttavia, la capacità dei recettori astrocitici esporre plasticità in risposta ai cambiamenti nell'attività neuronale ha ricevuto scarsa attenzione. Qui si descrive un modello di sistema che può essere usato per scalare a livello globale su o giù gruppo astrocitaria I metabotropici recettori del glutammato (mGluRs) in fettine di cervello acuto. Incluso sono metodi su come preparare fettine di ippocampo parasagittali, costruire camere adatte fetta di incubazione a lungo termine, bidirezionale manipolare azione neuronale potenziale di frequenza, astrociti carico e processi astrociti con fluorescente Ca 2 + indicatore e misurare le variazioni di astrociti attività Gq GPCR per la registrazione astrociti spontanea ed evocata Ca 2 + eventi utilizzando la microscopia confocale. In sostanza, un "calcio roadmap "è previsto come misurare la plasticità del astrocitiche GPCR Gq. Applicazioni della tecnica per lo studio di astrociti sono discussi. Avere una comprensione di come la segnalazione del recettore astrociti è influenzato da cambiamenti nell'attività neuronale ha importanti implicazioni sia per la normale funzione sinaptica, così come i processi sottostanti disturbi neurologici e malattie neurodegenerative.
Gli astrociti rispondono pochi secondi alla stimolazione dei neuroni o assoni neuronali con aumenti in citoplasmatica di Ca 2 + derivanti quasi esclusivamente dalla attivazione di astrocitiche GPCR Gq. Ad esempio, i recettori muscarinici 1, recettori dei cannabinoidi 2, α 1A recettori adrenergici 3, 4, e il gruppo I mGluRs (vedi sotto) sono tutti astrociti sottotipi Gq GPCR che acutamente rispondono all'attività neuronale. Attivazione del gruppo astrociti I mGluRs è stata dimostrata più ampiamente, in seguito a stimolazione di afferenze neuronali glutammatergici in situ (come fettine ippocampali acute) 5-7, nonché in adulto corteccia topo in vivo dopo stimolazione sensoriale 8. L'esito di attivazione di astrociti Gq GPCR segnalazione sulla biologia e fisiologia degli astrociti, neuroni, astrociti o interazioni dei neuroni è stato oggetto di dibattito 9-12. Sarà some tempo prima che la funzione di segnalazione dei recettori dei neuroni-to-astrociti è pienamente apprezzato.
Mentre è chiaro che i neuroni possono attivare i recettori astrociti utilizzando protocolli sperimentali, ci sono aspetti della comunicazione neurone recettore-to-astrociti che rimangono poco conosciute. In primo luogo, la quantità effettiva di attività neuronale necessaria per attivare astrociti Gq GPCR non è ben definito, e in secondo luogo, la capacità dei recettori astrocitiche di esporre uso-dipendente plasticità ha ricevuto scarsa attenzione. Per cominciare a rispondere a queste domande, abbiamo recentemente sviluppato un protocollo per indurre scala bidirezionale di gruppo astrociti I mGluRs in fettine di ippocampo giovanili acute in risposta a cambiamenti a lungo termine nel potenziale d'azione neuronale (AP)-dipendente l'attività sinaptica. Analogamente a quanto è stato scoperto per bidirezionale plasticità omeostatica delle neuronali recettori del glutammato ionotropici 13, 14, gruppo astrociti I mGluRs scalare following blocco dei potenziali d'azione neuronali e scala verso il basso quando l'azione neuronale potenziale frequenza è aumentata 15. Questi cambiamenti compensativi recettori astrociti possono essere misurati registrando spontanea e evocate astrociti Ca 2 + transitori e confrontando le proprietà di questi eventi a quelli di astrociti in condizioni di controllo. In questo manoscritto, si descrive la metodologia completa per l'utilizzo di questo protocollo, compresa la preparazione di fettine di ippocampo, condizioni acute di incubazione di indurre scala recettore astrociti, astrociti Ca 2 + colorante indicatore di carico, Ca 2 + tecniche di imaging utilizzando la microscopia confocale, e degli effetti attesi su astrociti attività Gq GPCR. Effetti prevedibili sulla astrociti Ca 2 + proprietà di segnalazione – che corrispondono a quelli registrati in precedenza in cellule in coltura trasfettate con diversi livelli di espressione di GPCR Gq – fornire una "roadmap" che può essere usato in studi futuri per eseguire il test per le modifiche comeespressione GPCR trocytic. Le ramificazioni e potenziali applicazioni per l'uso di questa tecnica contribuiranno alla nostra comprensione delle interazioni astrociti-neuroni nel cervello sano e malato.
I modelli di scala descritti rappresentano metodi pratici per la ricerca di plasticità a lungo termine del gruppo astrocitica I mGluRs. Imaging spontanei ed evocati Ca 2 + eventi offre un test sensibile per variazioni di astrociti attività Gq GPCR di misura, come prova ditta è stato stabilito che astrociti Ca 2 + aumenti si verificano a seguito di rilascio da IP 3 negozi R-sensitive valle di Gq GPCR attivazione di 10, 12, 17, 18. La percentuale degli astrociti nella popolazione risposta al gruppo I mGluR agonista e il modello di tali Ca 2 + risposte segnalano cambiamenti nel gruppo I mGluRs dagli astrociti.
La tecnica specifica utilizzata per caricare astrociti con Ca 2 + indicatore è una considerazione importante nella progettazione di esperimenti per cercare variazioni di astrociti attività Gq GPCR. Bolo-carico o-bulk caricare più astrociti, o patch-clamp carico dei singoli astrociti può essere utilizzato per immagine Ca 2 + transitori negli astrociti. Ogni approccio offre alcuni vantaggi e svantaggi. Direttamente riempiendo astrociti con Ca 2 + indicatore tramite patch clamp consente l'identificazione univoca della cella come astrociti, senza bisogno di un marcatore secondario, come SR-101. Consegna Patch-clamp dell'indicatore permette anche la registrazione di Ca 2 + attività da piccoli scomparti astrociti comprese le folte processi sottili, potenzialmente più profonde nella sezione in cui le cellule sono più sani e con più interazioni intatti con sinapsi (a seconda della potenza del laser disponibile). Tuttavia, patch-clamp loading soffre di bassa capacità, come i dati sono raccolti una cella alla volta. Caricamento di massa, al contrario, permette un gran numero di astrociti deve essere caricato con Ca 2 + indicatore e ripreso simultaneamente. Tuttavia, solo gli astrociti in prossimità della superficie (<20 micron) della sezione vengono caricati, con preoccupazione associatas sulla salute delle cellule e sinapsi intatti.
Il protocollo bolo-loading contropressione qui presentata offre una via di mezzo, con relativamente elevato throughput e la possibilità di monitorare Ca 2 + attività più profondo all'interno della fetta (40-75 micron). Un aumento significativo della percentuale di astrociti spontaneamente attivi con la tecnica bolo-loading si osserva rispetto al caricamento di massa, suggerendo che le connessioni tra sinapsi neuronali ei processi astrociti sono più completi 15. Con un buon carico, spesso si possono monitorare Ca 2 + attività nelle principali processi di astrociti (dati non riportati) o potenzialmente anche compartimenti più piccoli usando la microscopia a 2 fotoni. Tuttavia, la cura dovrebbe essere esercitata nei assegnare i processi più piccoli ad una particolare astrociti, in quanto i confini si fondono con la colorazione di fondo aspecifica. Un ulteriore problema con l'utilizzo di procedure bulk-caricamento o bolo-caricamento è la necessità di un mar secondariaker per l'identificazione degli astrociti. Mentre è noto da molti anni che gli astrociti preferenzialmente occupano AM estere Ca 2 + indicatori, il marcatore secondario SR-101 è spesso usato per verificare le cellule caricate come astrociti. SR-101 può di per sé modificare l'eccitabilità intrinseca dei neuroni 29. Uso di SR-101 conferma la necessità di eseguire tutte astrociti Ca 2 + misurazioni in TTX per limitare possibili SR-101 effetti sulla eccitabilità neuronale. Supponendo che sia il controllo e gruppi sperimentali includono SR-101, il marcatore di per sé non dovrebbe tener conto degli effetti osservati negli astrociti Ca 2 + segnalazione seguenti manipolazione a lungo termine dei potenziali d'azione neuronali. SR-101 può essere più di una preoccupazione in alto K + esperimenti, tuttavia, come si può ridurre la differenza tra K mM + 2,5 vs 5.0 mM K + se il tasso di cottura basale non è alterata in proporzione.
Un approccio molto promettente per fornire Ca 2 + </sup> Indicatore di astrociti è emerso recentemente che offre una valida alternativa agli approcci più tradizionali utilizzando Ca 2 + coloranti. Progressi significativi sono stati compiuti nel corso degli ultimi anni, con indicatori di calcio geneticamente codificati (GECIS) mirati al astrociti 30-32. GeCIS può essere spedito a astrociti in vivo microiniezione di vettori virali adeno-associati in una regione del cervello di interesse come l'ippocampo. Espressione di GECIS si raggiunge dopo circa due settimane dopo l'infezione virale 32. Ci sono numerosi vantaggi presentati dall'uso di GeCIS negli astrociti. In primo luogo, i vettori sono mirati ad astrociti utilizzando un promotore specifico astrociti, in modo che le cellule marcate sono astrociti 32. In secondo luogo, il rapporto segnale-rumore-ora sembra paragonabile a quello ottenibile utilizzando consegna patch-clamp di colorante, ma senza l'invasività di aver avuto una pipetta di patch sulla cella 32. In terzo luogo, gli indicatori possono essere delivered ed espresso in tessuti adulti, che è problematico utilizzando metodi di consegna caricamento di massa. Inoltre, l'espressione è mosaico, offrendo la possibilità di differenziare tra più astrociti. Così, molti astrociti possono potenzialmente essere esposte contemporaneamente, mentre anche la registrazione nel soma e ramoscelli sottili allo stesso tempo. Pertanto, potenzialmente una singola tecnica potrebbe essere utilizzata in luogo di tre tecniche separate (caricamento di massa, bolo-carico, e patch-clamp carico) per registrare scalatura attività di astrocitici GPCR Gq, aumentando notevolmente l'efficienza.
Un potenziale svantaggio di utilizzare consegna virale-mediata di Ca 2 + indicatori astrociti è il possibile effetto sulla fetta di salute 32. I vettori virali adeno-associati di erogazione dei GeCIS hanno dimostrato in precedenza di causare gliosi reattiva di astrociti 33. Preparazione di fette di cervello in generale probabilmente inizia fasi iniziali della patologia, tra cui il rilascio di inflammatory molecole 10. Pertanto, in combinazione con i tempi di incubazione lunghi necessari per indurre scalatura dei recettori astrociti, uso di GeCIS forniti mediante vettori virali avrebbe bisogno di ricevere ulteriori considerazione nel contesto della salute fetta in questi tipi di esperimenti.
Quando impiegando questo protocollo, è importante tenere presente che il tempo di applicazione di agonista per produrre una risposta varierà in funzione della disponibilità recettore. Per una data concentrazione di agonista, il tempo di applicazione dovrà essere più lungo se recettori hanno ridimensionato, e più breve se recettori sono scalati, per il farmaco di raggiungere un'adeguata concentrazione nel tessuto per attivare recettori sufficiente per produrre un Ca 2 + risposta. Pertanto, tempi di applicazione della droga, e, potenzialmente, le loro concentrazioni, possono essere adattate a seconda della direzione prevista del ridimensionamento. Ad esempio, la concentrazione di agonista può essere necessario ridurre in case di TTX per evitare la saturazione risposte e aumentato dopo incubazione fette in alto K + a vedere anche una risposta. In particolare, la concentrazione DHPG stato spostato 5-15 mM dopo il trattamento TTX a 30-50 mM dopo il trattamento 5,0 mM K + per studiare Ca 2 + modelli di risposta, come 5-15 um era spesso troppo bassa per produrre risposte affidabili in astrociti dopo il ridimensionamento del gruppo I mGluRs.
Registrazione di astrociti Ca 2 + attività fornisce alcuna prova diretta di inserimento recettore o di internalizzazione da o verso la membrana plasmatica. Tuttavia, sulla base della notevole somiglianza dei dati con i dati provenienti da studi precedenti in vitro che hanno esaminato la relazione diretta tra livelli di espressione Gq GPCR e spontanea ed evocata Ca 2 + transitori 21-24, l'interpretazione più logica delle variazioni di Ca 2 + segnalazione è che i livelli di espressione del recettore di superficie astrociti hannocambiato. Un approccio complementare può essere una considerazione importante se si vuole fornire prove aggiuntive sul locus dell'effetto di Ca 2 + attività. Una strategia che abbiamo usato è stato quello di esaminare l'effetto della TTX incubazione in fettine di ippocampo di topi astrocitiche MrgA1R. Questi topi transgenici esprimono un Gq GPCR estera (MrgA1R) soltanto negli astrociti. Perché questo recettore non è nativo al cervello, non c'è neurotrasmettitore endogeno presente per cambiare i suoi livelli di attività. Il lavoro precedente ha suggerito che questo recettore impegna stesso intracellulare molecole di segnalazione come gruppo endogeno I mGluRs nelle stesse astrociti 34. Dopo incubazione a lungo termine di fette di topi MrgA1R in TTX, differenze nelle risposte MrgA1R agonisti evocata rispetto al controllo littermate incubata fette fornirebbe la prova che l'effetto sulla astrociti Ca 2 + attività è dovuta alle variazioni localizzate al recettore di superficie, in particolare se le risposte gruppo I mGluR sono ancora significativamente migliorato nelle stesse astrociti. Un'alternativa, se la strategia forse più coinvolti sarebbe isolare astrociti dalle fette per analisi Western blot, finché una frazione di membrana potrebbe essere analizzato per modifiche nei livelli di espressione del recettore di superficie. Fluorescence Activated cell sorting (FACS) o citometria a flusso possono essere utili qui.
Le possibili applicazioni di questa tecnica per lo studio dei neuroni, astrociti e interazioni astrociti-neuroni sono molti. Nei nostri esperimenti, unico gruppo DHPG evocato I mGluR astrociti Ca 2 + risposte sono state studiate, in isolati fettine di ippocampo acuti di topi giovani. Questa preparazione non solo le afferenze intatti (garanzie reali di Schaffer), ma anche i neuroni che danno origine a loro (cellule piramidali CA3), che permette di manipolare i tassi di cottura di questi neuroni glutamatergici sulle cellule post-sinaptiche (cellule piramidali CA1) e astrociti nello strato radiatum cui processi assoE Con queste sinapsi. La fetta dell'ippocampo acuta può non essere la migliore preparazione per manipolare i tassi di cottura di altri tipi di neuroni, tuttavia, come molte afferenze sono separabili dai neuroni che danno origine a loro. Tuttavia, può essere possibile in taluni preparati fetta di osservare la plasticità di altre astrocitiche sottotipi Gq GPCR. Ad esempio, le fette possono essere preparati con prosencefalo basale neuroni colinergici e le proiezioni per Hippocampus intatto. L'incubazione di queste fette in TTX o elevata K + inciderebbe tassi di cottura basali dei neuroni colinergici, che porta alla scala di mAchRs negli astrociti di Oriens falda, che ricevono una parte significativa degli input colinergici 1. Un approccio alternativo ancora testato per studiare scalatura recettore astrocitaria all'interno di una specifica area del cervello, con tutti i collegamenti intatti mentre si verifica scalatura, potrebbe essere quella di utilizzare un modello in vivo in cui un rilascio prolungato di TTX è ottenuta per impiantazione di un Plastic polimero Elvax 40W sopra la regione di interesse 35. Questo approccio è stato utilizzato in precedenza in uno studio su scala neuronale, ma dovrebbe essere applicabile anche a scala astrociti. Infine, con la giusta lettura, studi futuri potrebbero esaminare altre famiglie GPCR, comprese le variazioni di G s e G I GPCR. Si potrebbe prevedere astrociti GABA B G i GPCR di essere colpiti in seguito l'inibizione di sparare nel proiettare a livello locale interneuroni GABA all'interno di qualsiasi preparazione fetta. Sviluppo di nuovi indicatori di targeting altre molecole di segnalazione, come un indicatore in tempo reale del secondo messaggero cAMP, aprirebbe una nuova area di ricerca sulla comunicazione del recettore neurone-to-astrociti.
Scalatura bidirezionale di mGluRs astrocitici dalla manipolazione dei tassi neurone cottura basali fornisce una misura della sensibilità degli astrociti di rilascio AP-mediata di neurotrasmettitore. Gli astrociti possono apparentemente percepire AP spontanee e glutamarilascio di te a Schaffer collaterale-CA1 sinapsi delle cellule piramidali anche quando extracellulare K + è all'interno di un range fisiologico. Mentre l'applicazione acuta di TTX non riduce la frequenza di astrociti spontanea Ca 2 + attività 18, 36, 37, il Ca 2 + attività tra gli astrociti nella popolazione diventa decorrelati 36, fornendo la prova che i recettori astrociti sono rilevatori AP. Questo suggerisce che gli astrociti percepiscono AP neuronali spontanee senza incidere sulla loro attività complessiva Ca 2 +. E 'ampiamente accettato che le concentrazioni intracellulari di IP 3 devono raggiungere un livello di soglia per stimolare IP 3 R in misura sufficiente a portare ad un rilevabile Ca 2 + elevazione. Potrebbe AP neuronali spontanee attivare GPCR astrociti senza produrre misurabili Ca 2 + elevazioni? Studi futuri potrebbero utilizzare Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) o un tecn simile ique (come BRET) per esaminare la relazione tra proteina G accoppiamento al recettore (una misura di attivazione del recettore) e Ca 2 + rilascio dai depositi interni. BRET è stato ampiamente utilizzato in vitro per rilevare G accoppiamento 38 proteina-to-GPCR, anche se può essere un po 'di tempo prima che questa tecnologia sarà disponibile per l'utilizzo nelle preparazioni dei tessuti intatti. E 'possibile che astrociti GPCR Gq vengono attivati molto più frequentemente di quanto può essere registrato utilizzando gli strumenti di Ca 2 + di imaging attualmente disponibili. Oltre a rilevare potenziali d'azione, astrociti GPCR Gq possono anche essere in grado di rilevare in miniatura rilascio quantico di neurotrasmettitori come riportato in un recente studio 39. Il metodo di scala bidirezionale qui descritto può essere usato in studi futuri per fornire una misura del grado in cui GPCR astrociti Gq rilevano quantale rilascio vescicolare del neurotrasmettitore, includendo bafilomycin A1 nel protocollo incubazione.
S copi "> Finora, sono solo stati utilizzati i protocolli di scala in fettine di ippocampo di topi giovanile (p12-p18). Pertanto, è attualmente noto se il ridimensionamento del recettore astrociti potrebbe anche essere indotta nei tessuti ottenuti da topi adulti. Un recente studio interessante suggerisce che il gruppo espressione che mGluR negli astrociti diminuisce notevolmente dopo la prima settimana di età e continua a diminuire fino all'età adulta, con bassi livelli di espressione del recettore negli astrociti adulti 40. Sarebbe pertanto interessante per determinare se mGluRs astrociti scala a seguito del lungo- inibizione termine di firing neuronale in adulti fettine di ippocampo di topo a livelli prossimi a quelli osservati negli astrociti dei topi giovani. Questa scoperta suggerisce che l'espressione del recettore astrociti non è statica ad una certa età, ma può cambiare rapidamente a seconda dei livelli di attività neuronale. In contrasto ridotta espressione del gruppo I mGluRs in topi adulti, la prova sta emergendo che i recettori adrenergici, tra cui & #945; 1A, 2A α, β e 1 sottotipi, sono prevalentemente espressi dagli astrociti nel cervello adulto 3, 4. Il adrenergico α 1A Gq GPCR può essere un bersaglio attraente per i futuri studi di comunicazione neurone-to-astrociti, tra questi se questi recettori sono sensibili alle variazioni dei tassi neurone cottura adrenergici.The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare il Centro di UC Riverside per Gliali-neuronali Interazioni prezioso per la discussione dei protocolli di scala e dati. Gli autori desiderano anche per dare un ringraziamento sincero a Abcam per sponsorizzare la pubblicazione del loro lavoro.
Chamber Supplies | |||
Brinkmann pipette storage container | Fisher Scientific | 03-491 | Use the drawer portion as the incubation chamber |
Electrical drill | |||
Flexible tubing | Tygon | R-3603 | |
Silicone seam sealant | Also called aquarium seam sealer | ||
Gas tank | 95% oxygen, 5% carbon dioxide | ||
Natural beveled pipette tip | USA Scientific | 1111-1000 | Cut-to-fit to connect oxygenate lines |
One-to-six lines manifold | Warner Instruments | 64-0210 (MP-6) | For the microloader-manifold apparatus |
Eppendorf microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit |
Floating Bubble Rack | Bel Art Scienceware | F18875-0400 | For slice holder |
600 micron Sefar Nitex nylon mesh | ELKO filtering Co. | 06-600/51 | For slice holder |
Krazy Glue | For slice holder | ||
Reagent | |||
Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
NaCl | Fisher | S271-3 | |
KCl | Fisher | P333-500 | |
CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
MgCl2 | Fisher | M33-500 | |
NaH2PO4 | Fisher | S369-500 | |
NaHCO3 | Fisher | S233-500 | |
Glucose | Fisher | Fisher | |
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Acros Organics | 53188-07-1 | |
Ascorbic acid | Acros Organics | 401471000 | |
Tetrodotoxin citrate (TTX) | Ascent Scientific | Asc-055 | |
Sulforhodamine 101 (SR-101) | Sigma-Aldrich | 284912 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
Pluronic Acid F-127 | Invitrogen, Molecular Probes | P6867 | |
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging) | Invitrogen, Molecular Probes | O6807 | |
(RS)-3,5-DHPG | Ascent | Asc-020 | |
Histamine | Sigma-Aldrich | H7125 | |
Carbamoylcholine chloride (Carbachol) | Sigma-Aldrich | C4382 | |
Adenosine 5’-ATP disodium (Na-ATP) | Sigma-Aldrich | A7699 | |
Dissection Tools | |||
Single-edge razor blade | GEM | 62-0161 | For bisection |
Double edge razor blade | TED PELLA, INC. | 121-6 | For cutting slices |
Mayo Scissors, supercut | WPI | 14010-15 | For decapitation |
Fine iris scissors, straight | Fine Science Tools | 14094-11 | For cutting the skull |
Iris forceps, curved | WPI | 15915 | To remove the skin and skull |
Small spatula | To remove/transfer the brain | ||
Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | For hippocampus dissection |
Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20B | For transferring brain slices |
Pasteur pipette rubber bulb | Fisher | 03-448-22 | For transferring brain slices |
Polystyrene 100-mm tissue culture dishes | Corning | 25020 | |
Equipment | |||
Vibratome | Leica | VT 1200S | |
Water bath | Fisher | ISOTEMP 210 | For warm incubation |
Micropipette puller | Narishige | PC-10 | For bolus-loading pipette |
Confocal microscope | Olympus | Olympus Fluoview 1000 | |
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform | Warner Instruments | RC-26GLP | diamond bath with low profile |
Borosilicate glass pipette | World Precision Instruments | TW150F-4 | For bolus-loading pipette |
Micromanipulator | Sutter instrument | ROE-200 | For bolus-loading pipette |
Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 µm cellulose acetate | Costar | 8161 |