Articolo metodologico

Transgenici Roditore Assay per quantificare Maschio cellule germinali Mutant Frequenza

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DOI:

10.3791/51576

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6 agosto 2014

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1Environmental Health Science and Research Bureau, Health Canada, Environmental Health Centre

In questo articolo

Sommario

Le mutazioni de novo nella linea germinale maschile possono contribuire a esiti negativi per la salute nelle generazioni successive. Qui descriviamo un protocollo per l'uso di un modello di roditore transgenico per quantificare le mutazioni in cellule germinali maschili indotte da agenti ambientali.

Abstract

Le mutazioni de novo insorgono principalmente nella linea germinale maschile e possono contribuire a esiti avversi per la salute nelle generazioni successive. I metodi tradizionali per valutare l'induzione di mutazioni delle cellule germinali richiedono l'uso di un gran numero di animali, il che li rende poco pratici. Pertanto, la mutagenicità delle cellule germinali viene raramente valutata durante i test chimici e la valutazione del rischio. In questo articolo, descriviamo un test in vivo di mutazione di cellule germinali maschili utilizzando un modello di roditore transgenico basato su una linea guida per i test dell'Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico (OCSE) recentemente approvata. Questo metodo utilizza un saggio di selezione positiva in vitro per misurare le mutazioni indotte in vivo in un vettore λgt10 transgenico recante un gene reporter direttamente nelle cellule germinali dei maschi esposti. Descriviamo ulteriormente come il rilevamento di mutazioni nel transgene recuperato dalle cellule germinali possa essere utilizzato per caratterizzare la sensibilità stadio-specifica dei vari tipi di cellule spermatogeniche all'esposizione mutagena controllando tre parametri sperimentali: la durata dell'esposizione (tempo di somministrazione), il tempo tra l'esposizione e la raccolta del campione (tempo di campionamento) e la popolazione cellulare raccolta per l'analisi. Poiché un gran numero di cellule germinali può essere analizzato da un singolo maschio, questo metodo ha una sensibilità superiore rispetto ai metodi tradizionali, richiede meno animali e quindi molto meno tempo e risorse.

Introduzione

Mutazioni del DNA sporadici nella linea germinale possono portare al successo riproduttivo ridotta e, se ereditata, possono causare malattie genetiche o accresciuta predisposizione al cancro nella prole 1-3. Prova sostanziale dimostra che una grande percentuale di mutazioni de novo sono ereditate dalla linea germinale paterna 4, e che il numero di mutazioni nella progenie è positivamente correlata con l'età paterna al momento del concepimento 5. La percentuale più elevata di mutazioni maschili si crede di essere il risultato della differenza di età durante la gametogenesi tra i sessi, il maggior numero di divisioni cellulari spermatogeniche rispetto al numero di divisioni cellulari oogenic nella linea germinale femminile 2, e un progressivo declino nel DNA ripristinare l'efficienza con l'età nei maschi. Tutti questi fattori contribuiscono ad una maggiore probabilità di errori di replicazione nella linea germinale maschile 6. Tuttavia, l'impatto di esposizione paterna alla Envirofattori nmental sulla frequenza delle mutazioni de novo resta incerto. Tuttavia, un gran numero di agenti ambientali sono noti per indurre mutazioni germinali nei roditori 7, e ci sono prove crescenti che alcuni di questi agenti possono anche influenzare la linea germinale umana 8. Nonostante queste preoccupazioni, i prodotti chimici vengono regolarmente testati per la loro capacità di indurre mutazioni nelle cellule somatiche a fini regolamentari e si presume generalmente che i test somatici sono sufficienti per proteggere la linea germinale. Pertanto, le sostanze chimiche sono solo raramente valutati per la loro capacità di indurre mutazioni delle cellule germinali.

Uno dei motivi di test mutagenicità sulle cellule germinali è stata ampiamente omesso dal processo decisionale normativo è una mancanza di metodologie pratiche. Metodi basati roditori-tradizionali, come ad esempio le dominanti letali 9 e specifiche locus 10 prove, stimano tassi di mutazione delle cellule germinali segnando fenotipi mutanti in embrioni o figli digenitori esposti. Questi test richiedono l'uso di un gran numero di animali, tempo e risorse per acquisire risultati statisticamente significativi.

Anche se di recente sono emersi diversi metodi moderni per quantificare la mutazione della cellula germinale, molti soffrono carenze in termini di praticità, efficienza e rilevanza biologica. Ad esempio, ripetere mutazioni lunghezza alla ampliato semplice tandem repeat (ESTR) loci può essere quantificato in cellule germinali maschili utilizzando una singola molecola PCR approccio 15. Tuttavia, l'esecuzione di questo metodo può essere tecnicamente impegnativo e laborioso, e, a differenza mutazioni puntiformi, il significato biologico e la salute dei cambiamenti nella lunghezza di ripetizione del ESTR loci altamente instabile rimangono poco chiari 16. Intere tecnologie di sequenziamento del genoma moderne in grado di fornire una grande quantità di dati biologicamente significativo quando applicato al problema di mutazioni ereditarie 4,17, ma il costo elevato, i tassi di errore elevati, convalida associati richiestiper confermare le mutazioni, e bioinformatica sfide ancora limitare l'applicazione di routine di questa opzione in un test di capacità di regolamentazione 18.

Qui, descriviamo un metodo pratico per quantificare le mutazioni indotte direttamente nelle cellule germinali di topi maschi transgenici. Questo protocollo è descritto per il modello MutaMouse transgenico, che ha più copie concatenato di un vettore λgt10 fago ricombinante contenente un gene reporter lacZ Escherichia coli integrato in entrambe le copie del cromosoma 3, 19 (Figura 1).

Questo protocollo è rilevante anche per altri (TGR) modelli di roditori transgenici basati sugli stessi principi (BigBlue topi e ratti, topi o lacZ plasmide, ecc.) O leggermente differenti geni reporter (gpt topo e nel ratto delta, modelli TGR recensione in Lambert et al. 20). Questo metodo si basa sul test di mutazione TGR descritto in una recente pubblicazionee rivisto OECD TG 21 e approfondire le considerazioni speciali necessari per ospitare la valutazione delle mutazioni nella linea germinale maschile a causa delle caratteristiche uniche di spermatogenesi. In breve, il test consiste nell'esporre topi maschi transgenici ad una sostanza mutagena, seguito da un tempo di campionamento in cui le lesioni pre-mutazionali sono fissati in mutazioni stabili. Al tempo di campionamento prescelto, i topi sono eutanasia e le cellule germinali sono raccolti sia dal epididimo cauda o tubuli seminiferi. Come discusso in seguito, effetti mutageni nelle diverse fasi della spermatogenesi può essere determinato selezionando il tempo tra l'esposizione e la raccolta del campione. Inserti transgenici, composti da più copie del genoma del fago λ per cella, sono isolati da cellule germinali DNA genomico e confezionati in vuoti capsidi fago λ λ creando infettive particelle fagiche che vengono poi utilizzati per infettare un E. accoglienza coli. I batteri infetti sono coltivate su Selecsupporti tivi in grado di distinguere le cellule contenenti un vettore con una copia mutata del lacZ dalle cellule che ospitano wild-type lacZ. L'effetto mutageno dell'esposizione sulla linea germinale maschile è determinata confrontando la frequenza di transgeni mutanti tra controllo e topi trattati (Figura 2, recensiti in Lambert et al. 20). Un gran numero di cellule germinali può essere dosati da un singolo topo, dando questo test di sensibilità superiore rispetto ai metodi tradizionali, riducendo il numero di animali necessari. E poiché non è necessaria alcuna attrezzature specializzate o di formazione, questo saggio fornisce una soluzione pratica ed efficace per i test di mutazione delle cellule germinali nella maggior parte dei laboratori di biologia molecolare di tossicologia / moderni.

Un requisito essenziale per l'efficace applicazione della TGR saggio di mutazione delle cellule germinali è la comprensione del ciclo di spermatogenesi (Figura 3). Il tempo per le cellule germinali del mouse per passare da stle cellule em nei tubuli seminiferi a spermatogoni, spermatociti, spermatidi, e infine a maturare spermatozoi nell'epididimo (es. spermatogenesi) è di circa 49 giorni. La mutazione può avvenire in varie fasi di questo ciclo e spesso è specifico composto. Due caratteristiche fondamentali che sono di particolare rilevanza per mutagenesi nelle cellule germinali maschili sono la cessazione della sintesi del DNA durante la prima meiosi, e la progressiva perdita della capacità di riparazione del DNA 6 durante la post-meiosi tardi, due processi che sono necessari per l'induzione e la fissazione di maggior parte delle mutazioni.

A causa di queste caratteristiche uniche di spermatogenesi, ci sono tre variabili critiche sperimentali per lo svolgimento della TGR mutazione delle cellule germinali test: (1) il tempo di amministrazione composto in esame; (2) il tempo di campionamento; e (3) la selezione della popolazione di cellule germinali per raccogliere per analisi (Figura 3 e Tabella 1). Tempo di Amministrazione è il experimevariabile ntale che determina come le cellule bersaglio lunghe sono esposti ai composti in esame. La lunghezza del tempo di somministrazione può essere utilizzato anche per esposizioni a tipi o fasi della spermatogenesi cellulari specifici bersaglio. Per esempio, una singola somministrazione giorno potrebbe essere utilizzata per determinare gli effetti di un'esposizione acuta su un particolare tipo di cellula. Allo stesso modo, l'esposizione può essere focalizzata ad un'intera fase della spermatogenesi, per esempio il targeting spermatociti solo meiotically divisione, o mitoticamente dividendo spermatogoni utilizzando un tempo di somministrazione di 2 settimane e un tempo di campionamento appropriato. Tempi di somministrazione cronica e sub-cronica sono utilizzate per valutare gli effetti dell'esposizione a lungo termine, per garantire una sufficiente distribuzione farmacocinetica del composto in esame, o permettere l'accumulo sufficiente di mutazioni da mutageni deboli (per esempio, il tempo di somministrazione 28 giorni raccomandato nella prova OCSE linea guida).

Tempo di campionamento è la variabile cruciale per determinare a qualifase della spermatogenesi cellule bersaglio erano in al momento dell'esposizione. Il tempo di campionamento determina quanto tempo, e quindi quanta più avanti lungo il ciclo di spermatogenesi, le cellule passano attraverso dopo l'esposizione. Ad esempio, per studiare gli effetti di cellule staminali spermatogoni, un tempo di campionamento> 49 giorni sono necessari se la raccolta di sperma completa maturazione, o> 42 giorni se la raccolta di cellule germinali immature dai tubuli seminiferi, al fine di garantire che tutte le cellule raccolte hanno avuto abbastanza tempo per sviluppano da cellule esposte steli. E 'importante notare che un tempo di campionamento di almeno 70 giorni sarebbe preferibile a dimostrare un vero effetto di cellule staminali per fornire il tempo sufficiente per la distribuzione farmacocinetica della sostanza tossica, per l'eliminazione delle cellule esposte a successive fasi della spermatogenesi, e per tenere conto di un periodo di sterilità temporanea che può verificarsi ~ 6 settimane dopo l'esposizione a composti altamente mutageni 22. Allo stesso modo, un tempo di campionamento di 21 giorni dovrebbe garantire che lo sperma colleCTED dall'epididimo cauda avrebbero appena completato la meiosi l'ultimo giorno di esposizione.

Le cellule germinali possono essere raccolti come spermatozoi maturi dal epididimo cauda, ​​o come una miscela di vari tipi di cellule della spermatogenesi dai tubuli seminiferi. Sperma maturo rimangono nel cauda per ~ 3 giorni, rendendo possibile determinare con precisione relativa del tipo di cellula o fase della spermatogenesi da cui lo sperma è nato per un dato disegno sperimentale. Pertanto, l'analisi di cauda sperma permessi altamente indagini sugli effetti delle mutazioni specifiche stadio mirati. D'altra parte, sospensioni di cellule raccolte dai tubuli seminiferi contengono una miscela di vari tipi di cellule germinali in diverse fasi di sviluppo, e quindi offrono una risoluzione più povero della fase spermatogenesi in cui le mutazioni origine. Inoltre, sospensioni cellulari recuperati dai tubuli seminiferi tendono a contenere una rappresentazione over-di spermatidi, seguita da spermatociti, e very pochi spermatogoni e cellule staminali (queste proporzioni sono rappresentate da barre bianche graduate in figura 3). Inoltre, sospensioni preparate dai tubuli seminiferi possono anche contenere varie cellule somatiche. Così, perché così tanti tipi di cellule sono presenti, gli effetti mutazionali possono essere influenzati da una varietà di cellule non bersaglio. Tuttavia, la raccolta di campioni da tubuli seminiferi offre un'opzione economica per lo screening contemporaneamente più tipi di cellule germinali, e la facile integrazione di analisi delle cellule germinali nel protocollo di test OECD standard per mutazione somatica.

Per ribadire, a seconda delle esigenze del ricercatore, tempo di somministrazione, il tempo di campionamento e la popolazione di cellule raccolte può essere regolata per interrogare gli effetti dell'esposizione in vari tipi cellulari e in diverse fasi della spermatogenesi. Selezionando attentamente queste variabili, esperimenti possono essere progettati per studi meccanicistici mirati, o per prova normativo più generalizzatascopi ing.

Per raggiungere competenza nel test, si consiglia l'uso di una somministrazione orale acuta di 100 mg / kg di N-etil-N-nitrosourea (ITA), seguito da un 70 giorni tempo di campionamento di controllo positivo. Analisi della cauda spermatozoi si rivolge così le cellule staminali spermatogoni (Figura 3), che in genere presentano un aumento di 4-5 della frequenza dei mutanti (MF) nel corso dei controlli in seguito questa dose altamente mutageno di ENU. Va notato che questa dose è nota per indurre sterilità sei settimane dopo l'esposizione, quindi non può essere una dose di controllo adatto per tempi di campionamento più brevi. Questa dose produrrà anche un aumento rilevabile in MF nella maggior parte dei tessuti somatici 20. I risultati rappresentativi presentati di seguito sono generate a seguito di un regime acuta +70 esposizione con tre dosi di ENU in finale fino a 100 mg / kg.

Protocollo

Tutti i protocolli che coinvolgono la zootecnia, la manutenzione e la gestione sono state approvate dal comitato per la cura degli animali di Health Canada.

1. esposizioni di animali

  1. Casualmente distribuire transgenici topi maschi (8-12 settimane) per controllare gruppi e gruppi di trattamento (min = 5 per gruppo) topi .Treat con composto in esame e controllo rilevanti per una via di esposizione appropriata per il tempo di amministrazione selezionato. Scegliere il tempo di campionamento appropriata a seconda del tipo di cellula spermatogenesi di interesse (figura 3).
  2. Dopo il tempo di campionamento, eutanasia topi da dislocazione cervicale sotto anestesia isofluorane (o altro metodo appropriato). Disegnare con cura i testicoli da un'incisione nell'addome o nello scroto e asportare le epididimi cauda. (Figura 4, per visualizzare un video dettagliato di raccolta dell'epididimo vedere Duselis et al 24.). In alternativa, raccogliere i testicoli se analizzando tubulo seminiferocellule s. Congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C per un uso successivo.

2 Isolamento e la digestione di Cauda sperma

  1. Sbrinare cauda epididimo su ghiaccio. Trasferimento cauda scongelati ad una piastra di Petri e accuratamente tritate con una lama di bisturi o un rasoio.
  2. Aggiungere 700 ml di temperatura ambiente D-PBS per la piastra di Petri. Utilizzando un ampio tunnel di 1.000 microlitri pipetta punta, il rilascio di sperma dalla cauda disegnando e rilasciando la sospensione fino a che il D-PBS diventa torbida con sperma (circa 10 volte). NOTA: Per preparare wide-bore puntale tagliato 2-3 mm dalla fine di un puntale di plastica.
  3. Sospensione del filtro attraverso un filtro a maglia di acciaio inox in una nuova provetta da 1,5 ml. Lavare la piastra di Petri con altri 700 ml di D-PBS e trasferimento stesso provetta da 1,5 ml attraverso il filtro a rete. Rimuovere maglie, posizionare il tubo in ghiaccio.
  4. Ripetere i passaggi 2,1-2,3 per i campioni rimanenti.
  5. Spin samplesat 11.000 xg per 3 min. Surnatante con attenzione decantare. Evitare di disturbare il pellet.
  6. Aggiungere 1,0 ml di soluzione fisiologica fredda 1x citrato di sodio (SSC). Vortex fino a pellet è completamente ri-sospensione. Questo a volte necessari diversi cicli di vortex.
  7. Aggiungere 15 ml di 10% SDS. Inverti / agitare energicamente per 30 secondi per distruggere cellule non spermatiche. Agitazione troppo delicatamente comporta disagi insufficiente e il pellet non si formerà correttamente nel passaggio seguente.
  8. Spin a 11.000 xg per 2 minuti. Un pellet sciolto, "soffice", è indicativo di interruzione incompleta delle cellule somatiche a causa di insufficiente agitando al punto 2.7. In questo caso, è sufficiente scuotere il campione di nuovo, e respin fino a formare un pellet stretto. Decantare con attenzione il surnatante. Evitare di disturbare il pellet. Brevemente girare di nuovo e rimuovere le restanti surnatante con pipetta 200 microlitri.
  9. Aggiungere 940 ml 0.2x SSC freddo e vortex fino a pellet viene risospeso. Questo pellet può essere molto difficile da ri-sospendere e può richiedere diversi cicli di vortex. A volte ciuffi di sperm sono inevitabili.
  10. Aggiungere 120 microlitri β-mercaptoetanolo, 100 ml 10% SDS, 20 microlitri 0.5M EDTA, pH 8, e 20 ml proteinasi K (60 mg / ml, preparato fresco). Mescolare bene e digerire la notte con rotazione a 37 ° C. Procedere alla estrazione fenolo / cloroformio.

3. fenolo / cloroformio Estrazione del DNA da Cauda sperma

NOTA: Poiché il DNA nucleare in spermatidi fase tardiva e spermatozoi maturi è complessato con protamine, ed è altamente condensato rispetto al DNA delle cellule somatiche, convenzionali metodi di isolamento degli acidi nucleici non generare DNA di resa e purezza sufficiente per il saggio di mutazione di lavorare efficiente. Più estrazioni fenolo-cloroformio dopo una digestione aggressivo sono tenuti a liberare e purificare il DNA dello sperma (sulla base di metodi da 15).

  1. Spermatozoo Trasferimento digerire per un tubo di polipropilene 15 ml.
  2. Aggiungere 2 ml di fenolo: miscela cloroformio (1: 1). Ruotare il tubo a 22 giriper 3 min.
  3. Centrifugare a 1.600 xg per 10 min e trasferire strato superiore acquoso insieme con lo strato di interfaccia fuzzy per una nuova provetta da 15 ml.
  4. Ripetere i punti 3.1.2 e 3.1.3 3x, ma la modifica dei tempi di rotazione per 3 min, 4 min, e 6 min, rispettivamente. Sulla ripetizione finale, evitare di trasferire qualsiasi dello strato di interfaccia "fuzzy".
  5. Dopo il 4 ° estrazione, aggiungere 70 ml di 3M NAAC, pH 5,2 per 1 ml di estratto acquoso e 2 ml di cloroformio: alcool isoamilico (24: 1). Ruotare il tubo a 22 rpm per 12 min.
  6. Centrifugare a 1.600 xg per 10 min e trasferire strato superiore acquosa in una nuova provetta da 15 ml.
  7. Precipitare il DNA con l'aggiunta di 2 volumi di etanolo assoluto e ruotando delicatamente il tubo su un lato con dolce dondolio.
  8. Raccogliere DNA spooling sulla punta di un pascolo pipetta termosaldato. Risciacquare DNA agitando il puntale in etanolo al 70% e asciugare all'aria per 5 min.
  9. Dopo l'estrazione, sciogliere il precipitato di DNA in 40-100 ml Tribuffer di s-EDTA, pH 8 Conservare a 4 ° C. Lasciare che il DNA a sciogliere a 4 ° C per un minimo di due giorni prima di procedere al lacZ saggio di mutazione. Se i problemi di solubilità vengono rilevati, il DNA può essere ulteriormente sciolto a 65 ° C per 15 minuti prima dell'uso. Determinare la concentrazione del DNA con un spectrophotometre in A 260 e verificare che la concentrazione del DNA disciolto è tra 200-2.000 ng / ml.

4 Isolamento e digestione delle cellule germinali da Tubuli seminiferi

  1. Se congelato, scongelare testicolo sul ghiaccio (circa 1 ora). Trasferimento testicolo ad una lastra di vetro a terra.
  2. Tenere una delle estremità del testicolo con un paio di pinze. All'altra estremità del testicolo, perforare un foro nella capsula epiteliale utilizzando un altro paio di pinze o forbici dissezione (Figura 5A). Spremere i tubuli seminiferi attraverso la puntura e gettare la capsula epiteliale (Figura 5B).
  3. Ladd 500 ml di temperatura ambiente D-PBS ai tubuli seminiferi decapsulate.
  4. Angolo di un rullo di tessuto (gomma siliconica strettamente fissato sopra liberamente girevole un tubo diametro di 5 mm in acciaio inossidabile, o apparecchio simile) in modo che una estremità a contatto con la piastra ad un angolo di circa 5-10 ° (Figura 5C). Senza applicare alcuna pressione, spostare delicatamente il rullo avanti e indietro attraverso i tubuli fino a quando non sono appiattite e il D-PBS diventa torbida con le cellule rilasciati (circa 5-10x).
  5. Aggiungere altri 500 ml di D-PBS sui tubuli e rotolare delicatamente sopra i tubuli un paio di volte aggiuntivi.
  6. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml, riducendo al minimo la quantità di tubuli staccati essere trasferito (Figura 5D).
  7. Ripetere i passaggi 4,5-4,6 per raccogliere più celle, se necessario.
  8. Lasciare 1 - 2 min per eventuali tubuli accidentalmente raccolte di depositarsi sul fondo della provetta. Trasferire il D-PBS per un fresh 1,5 ml tubo lasciandosi alle spalle i tubuli costante (circa 100 ml di D-PBS). Una piccola aliquota di questa sospensione può essere controllato al microscopio (contrasto di fase) per valutare la composizione della popolazione cellulare.
  9. Centrifugare le cellule a 11.000 xg per 30 sec. Decantare con attenzione il sopranatante senza disturbare il pellet. Il pellet cellulare può essere congelato a -80 ° C, a questo punto, se necessario.
  10. Scongelare le cellule, se necessario. Trasferimento a 15 ml tubolare e risospendere in polipropilene in 5 ml di tampone di lisi (10 mM Tris pH 7,6, EDTA 10 mM, NaCl 100 mM, 1 mg / ml di proteinasi K, 1% SDS). Digest notte in incubatrice con rotazione a 37 ° C.
  11. Procedere alla estrazione fenolo / cloroformio.

5. fenolo / cloroformio Estrazione del DNA da cellule tubulo seminifero Germ

NOTA: Una estrazione meno aggressiva viene utilizzato per isolare il DNA delle cellule dei tubuli seminiferi germinale, dal momento che questi tipi di cellule non hanno ancora progredito attraverso ncondensa ucleare.

  1. Aggiungere 5 ml di fenolo: miscela cloroformio (1: 1) per tutta la notte seminifero digestione delle cellule dei tubuli. Ruotare il tubo a 22 rpm per 20 min.
  2. Centrifugare a 1.600 xg per 10 min e trasferire strato superiore acquoso, evitando lo strato di interfaccia "fuzzy", ad una nuova provetta da 15 ml.
  3. Aggiungere 100 ml di NaCl 5 M per 5 ml di estratto acquoso (di solito 5 ml viene recuperato)
  4. Aggiungere 5 ml di cloroformio: isoamylalcohol (24: 1). Ruotare il tubo a 22 rpm per 12 min.
  5. Centrifugare a 1.600 xg per 10 min e trasferire strato superiore acquosa in una nuova provetta da 15 ml.
  6. Precipitare il DNA aggiungendo 2 volumi di etanolo assoluto e delicatamente rotante e invertendo i tubi.
  7. Raccogliere DNA spooling sulla punta di una sigillata pascolo pipetta. Risciacquare DNA agitando il puntale in etanolo al 70% e asciugare all'aria per 5 min.
  8. Sciogliere DNA in 40-100 microlitri di buffer Tris-EDTA, pH 8 Conservare a 4 ° C. Lasciare DNA a sciogliere a 4 ° C per un minimo di duegiorni prima di procedere al lacZ test di mutazione (vedi punto 3.9). Se i problemi di solubilità vengono rilevati, il DNA può essere ulteriormente sciolto a 65 ° C per 15 minuti prima dell'uso. Determinare la concentrazione del DNA con un spectrophotometre in A 260 e verificare che la concentrazione è compresa tra 200 e 2.000 ng / ml.

6. LacZ mutazione Assay

La contaminazione batterica o fungina può interferire con l'efficienza di imballaggio, nonché la crescita della placca e di punteggio. E 'quindi fondamentale per eseguire il test lacZ utilizzando le adeguate misure asettiche per prevenire la contaminazione della reazione imballaggi, la cultura e la crescita di accoglienza dei media.

  1. Giorno Prima del test: Preparare inferiore Agar e Cultura Pernottamento
    1. Otto piastre (4 piastre di segnare mutanti, 4 piastre di contare titolo) contenente 8 ml di agar ogni fondo sono tenuti per campione (es., 64 ml per campione). L'agar fondo è identica per entrambile piastre di conteggio mutanti e del titolo. Preparare fondo sufficiente agar per il numero di campioni in fase di elaborazione. Asetticamente versare in 90 millimetri piastre di Petri (8 ml per piastra) e lasciare solidificare l'agar. NOTA: piastre di agar inferiori possono essere preparati fino a 1 settimana di anticipo.
    2. In una provetta da 50 ml si aggiungono 10 ml di brodo LB, 100 ml di soluzione di maltosio 20%, 25 ml ampicillina (20 mg / ml) e 20 ml kanamicina (5 mg / ml). Seminare con E. coli (lacZ - / GALE -) 25 e crescere overnight a 37 ° C con agitazione a 240 rpm.
  2. Giorno 1: Cellule sub-cultura
    1. Cellule sub-cultura di preparare una diluizione 1: 100 della cultura pernottamento in LB fresco (antibiotici). È necessario un volume di 8 ml di sottocultura per campione. Incubare a 37 ° C con agitazione a 240 rpm per circa 3,5 ore fino a OD 600 = 1.
    2. Quando OD 600 = 1, sospensione divisione cellulare uniformemente in provette da 50 ml e centrifugare a 1300 xga 15 ° C per 10min. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in metà del volume originale (ad esempio., 4 ml per campione) di LB contenente 10 mM MgSO 4. Mettete da parte le cellule fino al momento [punto 6.2.4.3].
  3. Giorno 1: Imballaggio DNA in fago lambda particelle
    1. Riscaldare un bagno d'acqua a 30 ° C.
    2. Utilizzando un ampio tunnel 10 microlitri pipetta punta, trasferimento 4 microlitri di DNA in una provetta da 1,5 ml. NOTA: Questo passaggio può essere eseguito un giorno o più in anticipo per ridurre i tempi di preparazione.
    3. Scaldare il primo tubo (rosso) da un kit di estratto di imballaggio fago (1 tubo per ogni 2 campioni). Brevemente girare per raccogliere estratto sul fondo della provetta.
    4. Trasferire 4.8 ml di estratto di imballaggio dal primo tubo al campione di DNA e mescolare agitazione gentile con la punta della pipetta. Brevemente spin down campioni in tubi. Incubare per 1,5 ore a 30 ° C bagnomaria.
    5. Riscaldare il tubo secondo (blu) estratto di imballaggio (1 tubo per ~ 15 campioni). Brevemente girare per raccogliere estratto in bassodi tubo.
    6. Trasferire 4.8 ml di estratto di imballaggio dal secondo tubo al campione di DNA e mescolare delicatamente agitazione. Brevemente spin down campioni in tubi. Incubare per un ulteriore 1,5 ore a 30 ° C bagnomaria.
    7. Risospendere particelle fagiche confezionati in 500 microlitri di buffer SM e mescolare facendo ruotare per 30 min a 20 rpm.
    8. Dopo la rotazione, i campioni brevemente vortex e centrifugare a 11.000 xg per 30 secondi per raccogliere campioni nella parte inferiore dei tubi. Particelle fagiche sono pronti per l'infezione [punto 6.2.4].
  4. Giorno 1: Preparare Top Agar
    1. Preparare agar top separata per i piatti di titolo e le piastre di selezione mutanti. Ogni campione richiede 4 piastre di titolo, e 4 piastre mutanti. Ogni piatto richiede 8 ml top agar. Aggiungere l'agente selettivo fenil-β-D-galattopiranoside (P-Gal) all'inizio selezione mutante agar solo. Preparare entrambe le top agar in anticipo (giorno di test) e mantenere a 50 ° C prima di aggiungere MgSO 4 per entrambi i top agar, e PGal di mutanti selezione agar.
  5. Giorno 1: Celle infettare con Phage confezionato e placcatura
    1. Etichettare due provette da 50 ml per campione: 1 "mutante" provetta per campione e 1 "titolo" provetta per campione
    2. Label 8 piastre di agar per campione: 4 "mutanti" piastre per campione e 4 "titolazione" lastre per campione
    3. Aliquota 2 ml di cellule risospese [dal punto 6.2.1.2] ad ogni provetta.
    4. Aggiungere 500 ml di particelle fagiche confezionati [dal punto 6.2.2.8] su "mutante" tubo da 50 ml (contenenti cellule). Miscelare delicatamente e lasciar particelle fagiche di infettare le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente.
    5. Dopo 30 minuti, brevemente vortice cellule infettate e trasferire 15 ml di cellule infettate con il tubo da 50 ml appropriate "titolo" (contenente cellule).
    6. Per piatto del campione titolo, aggiungere 30 ml di acqua calda (50 ° C) superiore agar "titolo" (non contenente P-Gal) per "titolo" tubo da 50 ml. Immediatamente distribute miscela agar / cella tra i 4 piatti "titolazione" (~ 8 ml per piastra). Lavorare velocemente in modo che la parte superiore agar non si raffredda nelle pipette, e cercare di non introdurre bolle d'aria.
    7. Piastra i campioni "mutanti" successivo. Assicurarsi P-Gal viene aggiunto "selezione mutante" top agar. Aggiungere 30 ml di agar caldo "selezione dei mutanti" (contenente P-Gal) a tubo "mutante" 50 ml. Immediatamente distribuire la miscela agar / cella tra i 4 piatti "mutanti" (~ 8 ml per piastra).
    8. Lasciare le piastre a solidificare (~ 15 min) poi invertono e incubare a 37 ° C durante la notte.
  6. Giorno 2: Piastre Conteggio
    1. Dopo incubazione overnight, contare il numero di placche sulle piastre mutanti e titolazione. Per gran numero di placche, contare soltanto una porzione della piastra di stimare il conteggio totale (ad es., Spesso ¼ della piastra titolo avrà tra 100-200 placche). Un minimo di 100 placche deve essere conteggiato per piastra quando counting una porzione della piastra.
    2. Calcolare il numero di unità formanti placca (PFUs) per ml di cellule. Questo viene fatto dividendo il numero di placche sulle piastre "titolazione" dal volume delle cellule placcato (15 microlitri).
    3. Utilizzare il numero di PFUs / ml per stimare il numero totale di PFUs nel volume totale delle cellule infette placcato sulle piastre "mutanti" (PFUs / ml * [2 ml cellule + 0,5 ml confezionati particelle fagiche - 15 microlitri per lastre di titolo] ).
    4. Stimare il MF dividendo il numero totale di placche mutanti contati sulle 4 "mutanti" piatti per il numero totale stimato di PFUs nel volume totale delle cellule infette determinato dalle piastre "di titolo".
  7. Quando la spontanea lacZ MF è dell'ordine di 3 x 10 -5 nel gruppo di controllo, come per le cellule germinali MutaMouse, la linea guida OECD raccomanda un minimo di 125.000 a 300.000 PFUs non mutanti per animale essere schermatacato per mutazione in modo da ottenere un segnale di riferimento affidabile. Altri modelli transgeniche può essere inferiore spontanea MF, nel qual caso sarebbe necessario un numero maggiore di PFUs. Un test statistico potenza può essere eseguita per determinare il numero minimo di PFUs e animali necessario per ottenere la risoluzione desiderata. I dati provenienti da più repliche possono essere raggruppati per soddisfare questo requisito minimo PFU, a condizione che non producono significativamente diverse frequenze mutanti.

7. Statistiche

L'unità sperimentale per l'analisi è il mouse. I dati ottenuti da questa analisi sono generalmente non distribuiti normalmente. Come tale, selezionare il metodo statistico di analisi basato sulla caratteristica distribuzione dei dati.

NOTA: analisi parametriche standard (. Esempio, ANOVA) può essere impiegato se del caso la trasformazione dei dati è applicata per pareggiare la varianza della risposta su tutta la gamma di Observazione. Poisson o analisi di regressione binomiale sono spesso più appropriate. Analisi non parametrica può anche essere impiegato. Noi abitualmente utilizziamo regressione di Poisson utilizzando la procedura di modello lineare generalizzato (ad esempio., Proc GENMOD) in SAS v.9.2 (SAS Institute, Cary, NC), come descritto da Lemieux et al 26.

Risultati

Con un conteggio medio targa di 200.000 targhe per animale, di solito osserviamo uno sfondo MF media di circa 2,8 x 10 -5 nelle cellule germinali maschili, con una deviazione standard di 1.7 x 10 -5 nei nostri gruppi di controllo (sulla base di dati provenienti da otto indipendente esperimenti). Con questo numero di targa, il livello e la varianza sfondo, gruppi di dosaggio con n = 5 animali ciascuno sono sufficienti per rilevare un aumento di 2 volte in MF con potenza> 0.8.

I risultati sono in genere riportati in formati tabellari o grafici. Tabella 2 e Figura 6 mostrano risultati rappresentativi di cauda sperma dei maschi MutaMouse (n = 5 per gruppo) esposto ad una dose singola orale acuta di 0, 25, 50 e 100 mg / kg N-etil-N-nitrosourea (ENU) seguito da un tempo di campionamento 70 giorni. Questo periodo di 70 giorni permette la misurazione di eventi mutazionali che si sono verificati in sperma che erano cellule staminali spermatogoni al tempo di esposizione (Figura 3). Densità di placca tipici piatti mutanti e di titolo sono mostrati in figura 7. Come illustrato nella Tabella 2 e Figura 6, l'esposizione acuta ENU ha indotto un aumento dose-dipendente significativo nella MF delle cellule staminali spermatogoni. La dose bassa ha indotto un significativo aumento di 2,6 volte nel corso dei controlli, che aveva una linea di base MF di 2,6 x 10 -5. Induzione massima si è verificato nella dose elevata, che ha suscitato un aumento di 4,4 sui controlli.

Un esempio di questo test eseguiti su cellule germinali tubulo seminiferi in cui si trovano Douglas et al. 27, dove MF è stata determinata in cellule germinali tubulo a vari intervalli di tempo successivi una ripetizione iniezione intraperitoneale 5 giorni a 50 mg / kg ENU. In questo studio, la frequenza dei mutanti nelle cellule seminiferi sono aumentate fino a 15 giorni dopo il trattamento e sono rimasti costanti in seguito.

Expocerto regime Tessuto raccolti Tipo di cellule raccolte (cella di destinazione) Fase di cellula bersaglio all'inizio dell'esposizione Fasi passati durante l'esposizione
Acuta + 70 Cauda Sperma maturo Cellule staminali Cellule staminali
14 + 21 Cauda Sperma maturo Spermatogoni Spermatide
14 + 35 Cauda Sperma maturo Cellule staminali Spermatocita
28 + 3 Cauda Sperma maturo Spermatocita Spermatocita
Spermatide
Sperma maturo
Tubuli Cellule staminali Cellule staminali Cellule staminali
Spermatogoni Spermatogonia Spermatogoni
Spermatocita Spermatocita
Spermatide Spermatide
28 + 49 Cauda Sperma maturo Cel staminali Cellule staminali
Tubuli Cellule staminali
Spermatogoni
Spermatocita
Spermatide 		Cellule staminali Cellule staminali

Tavolo 1. tipi di cellule e fasi della spermatogenesi che sono indirizzate dal transgenico mutazione roditore test da vari disegni sperimentali.

Gruppo Dose Animal # Mutant PFU Totale PFU MF (x10 -5) Media MF (x 10 -5) Cambiamento Fold p-value
Controllo 1 5 180245 2.8 2.6 1.0 -
2 4 137.835 2.9
3 11 385.672 2.9
4 2 431.396 0.5
5 6 152413 3.9
25 mg / kg 6 17 162.353 10.5 6.9 2.6 0.0002
7 14 150.094 9.3
8 4 154.401 2.6
9 9 154.401 5.8
10 12 196.978 6.1
50 mg / kg 11 17 155.727 10.9 9.3 3.6 <0,0001
12 11 135847 8.1
13 25 193.499 12.9
14 12 133859 9.0
15 14 252807 5.5
100 mg / kg 16 26 170968 15.2 11.5 4.4 <0,0001
17 28 234.584 11.9
18 10 145.289 6.9
19 35 292.236 12.0
20 22 190.848 11.5

Tabella 2 La frequenza di mutanti lacZ in cauda sperma del maschio transgenico mghiaccio esposto acutamente a ENU quando erano spermatogoni staminali (tempo di amministrazione = 1 giorno, tempo di campionamento = 70 giorni). PFU = Unità formando la placca, MF = frequenza dei mutanti.

figure-results-1
Figura 1 Una rappresentazione schematica del costrutto λgt10 fago.

figure-results-2
Figura 2 Un profilo del roditore transgenico germe saggio di mutazione delle cellule.

figure-results-3
Figura 3 Un diagramma schematico della spermatogenesi nel topo ei tipi di cellule e PHAES che sono indirizzate dal transgenico mutazione roditore test da vari disegni sperimentali. NOTA: Le barre bianche laureati rappresentano la proporzione relativa dei tipi di cellule presenti in sospensioni cellulari preparate dai tubuli seminiferi (cioè spermatidi> spermatociti> spermatogoni> cellule staminali). prego clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4 Raccolta del dell'epididimo topo cauda. A) Fare un'incisione nell'addome verso lo scroto. B) Identificare il dell'epididimo grasso pad. C) Tirare delicatamente il cuscinetto adiposo per disegnare i testicoli e dell'epididimo. D) Individuare e asportare la epididimo cauda.

figure-results-5
Figura 5 Preparazione della sospensione di cellule germinali dai tubuli seminiferi. A) L'incisione viene fatta nella capsula epiteliale del testicolo, esponendo i tubuli seminiferi. B) I tubuli seminiferi sono spremuti fuori dalla capsula. C) Un rullo di tessuto viene delicatamente passato sopra i tubuli con un angolo di 5-10 ° a rilasciare le cellule germinali contenute all'interno. D) La sospensione di cellule germinali sono raccolti per la successiva elaborazione.

figure-results-6
Figura 6 Rappresentazione grafica di lacZ frequenza dei mutanti in MutaMouse sperma esposto acutamente come le cellule staminali per ENU (n = 5). Ciascuntriangolo rappresenta la MF di un animale. * p <0,05 come determinato dalla regressione di Poisson.

figure-results-7
Figura 7 piastre di agar Rappresentante del transgenico roditore saggio di mutazione con placche formate su un prato di E. batteri ospitanti coli. A) Le piastre "mutanti" avranno poche placche (contrassegnati con frecce), in particolare nei gruppi di dosaggio di controllo, che di tanto in tanto avere zero placche su alcuni piatti. B) Le piastre "titolazione" possono avere centinaia di placche.

Discussione

Rispetto ai metodi tradizionali, la TGR saggio di mutazione delle cellule germinali fornisce un mezzo più veloce, più economico e più sensibili di quantificare indotto mutazioni di cellule germinali in vivo. Valutando transgene MF direttamente nello sperma, in contrasto con prole, il numero di animali, il tempo e le risorse necessarie per valutare la mutagenicità germinale di ogni singolo composto è notevolmente ridotto. In termini di sensibilità, siamo stati in grado di rilevare un significativo 2,6 volte maggiore di cellule staminali spermatogoni MF a seguito di esposizione a 25 mg / kg ENU utilizzando solo 5 animali per gruppo di dosaggio. Al contrario, il test locus specifico è stato in grado di rilevare qualsiasi cambiamento significativo in MF a questa stessa dose usando> 3.000 topi nel gruppo esposto e> 500.000 topi di controllo 28.

Oltre alla sua idoneità per entrambe le inchieste meccanicistici e regolamentari, questo metodo offre l'opportunità per gli studi comparativi tra somatico e germinale linea mutatisui tassi. Prove recenti suggeriscono che per alcuni agenti mutazioni delle cellule germinali possono essere indotte ad una concentrazione inferiore a quella richiesta per mutazione somatica. Ad esempio, l'esposizione prolungata a N-hydroxymethylacrylamide, un metabolita del cibo cancerogeno acrilamide 12, aumenta la frequenza di mutazioni dominanti cellule germinali letali nei topi senza influenzare la frequenza di micronuclei nei globuli rossi, una misura tradizionale di cellule somatiche danno citogenetico 13. Inoltre, l'esposizione di topi a entrambe le frequenze di mutazione tradizionali e sidestream fumo di tabacco cause elevati in tandem repeat loci del DNA nello sperma a dosi che non aumentano la frequenza di micronuclei nel sangue 14. Questi risultati mettono in discussione l'assunto che il test di genotossicità somatica è sempre protettivo della linea germinale, e rafforzano la richiesta di un mezzo più efficiente e conveniente per quantificare la frequenza di mutazione germinale delle cellule. Tuttavia, le prove per mutagene sulle cellule germinali preferenziali è ancora debole, In gran parte a causa della mancanza di dati disponibili per confrontare i tassi di mutazione nei tessuti di cellule somatiche e germinali. Il test di mutazione TGR permette test in parallelo e confronto dei tassi di mutazione indotta in più tessuti utilizzando lo stesso transgene. Così, mutazione test comparativo con il saggio TGR contribuirebbe a colmare le lacune di dati che circondano la possibilità di effetti cellule germinali preferenziali.

La valutazione simultanea di mutazione delle cellule somatiche e germinali a fini regolamentari inoltre migliorare l'efficienza riducendo il numero di animali necessari. Le linee guida OECD per mutazione somatica raccomanda un tempo di somministrazione 28 giorni, seguita da un tempo di rilevamento di tre giorni (28 + 3). Analisi della cauda sperma può offrire scarsa sensibilità a questo punto di tempo, dal momento che si rivolge cellule esposte per lo più durante le fasi spermatocita e spermatidi di spermatogenesi (Figura 3). Le cellule in queste fasi non sintetizzano DNA e perdono progressivamente la loro capacità di riparazione del DNA 6 </ Sup>. Inoltre, il campionamento cauda sperma a questo punto di tempo non riuscirebbe a rilevare le mutazioni che si verificano nelle cellule staminali spermatogoni e. Così, per l'integrazione nel 28 + 3 disegno, la linea guida OCSE raccomanda la raccolta di cellule germinali dai tubuli seminiferi. Questa popolazione mista contiene cellule derivate da sintesi del DNA e tipi cellulari riparazione abile, comprese le cellule staminali, e sono esposti in tutta la maggior parte delle fasi spermatogenesi. Tuttavia, a causa della natura mista di tali cellule, analisi delle cellule tubuli seminiferi non fornisce informazioni specifiche fasi. Inoltre, si teme che la presenza di cellule non bersaglio può influenzare la MF osservata (ad esempio falsi positivi chiamate mutagena sulle cellule germinali a causa di contaminazione di cellule somatiche mutate, o la diluizione di un segnale cellula germinale mutato da cellule germinali riparazione del DNA-deficienti) . Attualmente non ci sono dati sufficienti per concludere se i risultati a partire da cellule tubuli seminiferi a 28 + 3 offrono la stessa sensibilità e la specificità di uns cauda sperma in momenti successivi. Il nostro laboratorio sta attualmente confrontando campi magnetici indotti nelle cellule tubuli seminiferi e cauda spermatozoi raccolti dopo diversi tempi di campionamento per affrontare questo punto. Notiamo che la linea guida OCSE suggerisce un tempo di campionamento alternativo di 28 giorni per i tessuti lentamente dividono come il fegato, che può anche essere adatto per l'analisi delle cellule germinali. Tuttavia, i dati disponibili sono ancora insufficienti e siamo attualmente in grado di raccomandare un singolo disegno sperimentale per l'analisi simultanea di cellule somatiche e cellule germinali utilizzando il test di mutazione TGR per il test normativo.

Una caratteristica di questo test che dovrebbe essere notato è che gli eventi mutazionali sono valutati su un transgene non murino. Tuttavia, ci sono ampie prove che suggeriscono che il transgene risponde alle mutageni ambientali in modo simile ai geni endogeni 20. Inoltre, poiché le origini precise di eventi mutazionali indipendenti sono difficili darisolvere, i risultati sono generalmente riportati come una frequenza mutante (in contrasto con una frequenza di mutazione). La frequenza effettiva mutazione può essere risolto se i risultati sono corretti per l'espansione clonale (cioè. Divisione e moltiplicazione di una singola cella mutato che può contribuire alla frequenza osservata di mutanti transgene) dal sequenziamento del DNA. Sequenziamento dei transgeni mutante può essere effettuata per caratterizzare le mutazioni lacZ, e identificare mutanti che possono derivare da eventi espansione clonale, anche se questo aumenta sensibilmente i tempi ei costi delle analisi. Oltre al gene lacZ, theλgt10 vettore transgenico ospita una temperatura dipendente alternativa mutazione gene reporter: una variante del gene λ cII, che è più breve (294 bp vs il 3021 bp lacZ, Figura 1) e più facile da sequenziare 29. Sequencing consente anche l'analisi dello spettro di mutazione indotta, permettono di approfondire la mutatiomeccanismo finale del composto in questione. Un esempio estremo di espansione clonale è la presenza di una mutazione "jackpot" (cioè., Mutazioni transgene in una fase molto precoce dello sviluppo di un organo che contribuiscono ad una drammaticamente elevata MF, a volte centinaia di migliaia di volte superiori a sfondo). Animali o tessuti con una mutazione "jackpot" dovrebbe essere rimosso dall'analisi.

Il test che abbiamo descritto è ampiamente applicabile ad altri modelli TGR come mouse BigBlue e ratto, e il mouse plasmide lacZ, ognuno dei quali porto simili vettori mutazione Reporter (recensiti 20). La stragrande maggioranza degli studi sulle cellule germinali condotti fino ad oggi che impiegano metodi simili si sono concentrati quasi esclusivamente sul mutageni ben caratterizzati, come ENU e la radiazione (rivisto nel 30). Si prevede che con il recente rilascio di orientamenti dell'OCSE per il test TGR, questo test saràsempre più popolare per lo screening chimico e valutazione regolamentare. Integrazione della TGR cellula germinale test di mutazione in una batteria di test normativo colmare il divario esistente, consentendo la valutazione efficiente di induzione mutazione nelle cellule germinali 11. Inoltre, questo test può essere utilizzato per misurare MF in praticamente qualsiasi tessuto, fornendo un mezzo idoneo per confrontare le relative sensibilità delle cellule somatiche e cellule germinali per l'induzione di mutazioni da agenti ambientali a endpoint genetici identici.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata finanziata dal Canadian Regulatory System for Biotechnology (CRSB) e dalle iniziative del Chemicals Management Plan (CMP).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
MutaMouseCovance-
E. coli (lacZ-/galE-)Covance-Vediriferimento 25 nel manoscritto
CloroformioCaledon3001-2-40
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (D-PBS)Gibco14190-250
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,5 M, pH 8Sigma-Aldrich03690 FLUKA
Alcool isoamilicoCaledon2/10/7900
Lennon LB base per brodoInvitrogen12780-029
Filtro a rete in acciaio inossidabileSigma-AldrichS3770
Transpack estratto di imballaggioAgilent Technologies200220
β-mercaptoetanoloSigma-AldrichM3148
Alcool etilico, anidro (EtOH)Alcolicommerciali-Ampicilina
Gibco11593-027preparare 20 mg/ml in dH2O
KanamicinaGibco11815-024preparare 5 mg/ml in dH2O
FenoloInvitrogen15509-097Saturare in 0,1 M Tris-HCl secondo le indicazioni del produttore
Fenil-β-D-galattopiranoside (P-Gal)Sigma-AldrichP6501sciogliere 3 g per 10 ml di dimetilformammide
Proteinasi KInvitrogen25530-031preparare 60 mg/ml di soluzione dH2O appena prima dell'uso, 20 &; l per campione
Acetato di sodio (NaAc)Fisher ScientificBP333-500preparare una soluzione 3 M, pH 5,2
Sodio dodecil solfato (SDS)Sigma-AldrichL4390preparare una soluzione al 10% in dH2O
1 M MgSO424,6 g di MgSO4· 7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, conservare a temperatura ambiente fino a 1 anno
LB Brodo5,0 g LB base, 6,4 g NaCl per 1 L dH2O. Autoclave e soluzione salina fredda
15 mM di citrato trisodico, pH 7,0
SM Tampone5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO4· 7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 5,0 ml di gelatina (2% p/v), per 1 L dH2O, autoclave, conservare a temperatura ambiente fino a 1 anno
tampone10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8
Citrato di sodio (SSC)150 mM NaCl, TE

Riferimenti

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