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Articolo metodologico

Recupero chirurgico, Isolamento e

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⸱

DOI:

10.3791/51597

⸱

30 aprile 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology, Immunology & Cell Biology, Southern Illinois University School of Medicine, 2Division of Orthopaedics and Rehabilitation, Department of Surgery, Southern Illinois University School of Medicine, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Biomedical Engineering Program, Southern Illinois University Carbondale, 4University of Illinois at Springfield

In questo articolo

Sommario

Per le future applicazioni come una patch per riparare rotture parziali del legamento crociato anteriore (LCA), le cellule derivate ACL umane sono state isolate da tessuti ottenuti durante le procedure ricostruttive, espanse in vitro e coltivati ​​in ingegneria tessutale ponteggi. Adesione cellulare e la morfologia è stata poi eseguita per confermare biocompatibilità sulla superficie patibolo.

Abstract

Lesioni al LCA è un problema comunemente riscontrato nei soggetti attivi. Anche le lacrime parziali di questa intra-articolare del legamento del ginocchio portare a carenze biomeccanici che compromettono la funzione e la stabilità. Le opzioni correnti per il trattamento delle lacrime ACL parziali vanno da incruento, gestione conservativa a molteplici opzioni chirurgiche, come ad esempio: modifica termica, riparazione singolo fascio, ricostruzione completa, e la ricostruzione della parte danneggiata del legamento nativo. Pochi studi, se del caso, hanno dimostrato un metodo unico per la gestione sia costantemente superiore, e in molti casi i pazienti continuano a dimostrare persistente instabilità e di altre comorbidità.

L'obiettivo di questo studio è quello di individuare una fonte cellulare potrebbe ricorrere allo sviluppo di una patch tessutale che potrebbe essere implementata nella riparazione di un ACL parzialmente strappata. Un nuovo protocollo è stato sviluppato per l'espansione di cellule derivate da patienti sottoposti a ricostruzione del LCA. Per isolare le cellule, tessuti HACL macinate ottenute durante la ricostruzione del LCA è stato digerito in una soluzione di collagenasi. Espansione è stata effettuata utilizzando mezzo DMEM/F12 supplementato con 10% di siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina (P / S). Le cellule sono state poi conservati a -80 ° C o in azoto liquido in un mezzo costituito da congelamento DMSO, FBS e il mezzo di espansione. Dopo lo scongelamento, le cellule derivate HACL sono state poi seminate su un ponteggio ingegneria tessutale, plaga (acido lattico-co-glicolico Poly) e il controllo del tessuto della cultura polistirene (TCPS). Dopo 7 giorni, SEM è stata eseguita per confrontare adesione cellulare alla plaga contro il TCPS controllo. Morfologia cellulare è stata valutata mediante immunofluorescenza. SEM (Scanning Electron Microscope) microscopio hanno dimostrato che le cellule crescevano e rispettati su entrambe le superfici plaga e TCP ed erano confluenti su tutta la superficie di giorno 7. Immunofluorescenza mostrava normale, morfologiche non-ha sottolineatoAL modelli su entrambe le superfici. Questa tecnica è promettente per applicazioni nella rigenerazione e ricostruzione del LCA.

Introduzione

Il legamento crociato anteriore (LCA) è un legamento intra-articolare comunemente feriti del ginocchio. Circa 200.000 (ACL) lesioni sono segnalati ogni anno negli Stati Uniti. Oltre il 75% dei pazienti con lesioni ACL optare per la chirurgia ricostruttiva ortopedica 1,2,3,4. L'intervento chirurgico è spesso indicato a causa di un potenziale di guarigione per sé mediocre 3. Ricostruzione del LCA in genere viene eseguita per mezzo di un innesto di osso autologo o allogenico tendine. Autologo e allogenico rappresentano il gold standard per la ricostruzione come si vantano tassi di successo elevati, e la riparazione sutura primaria, l'altra opzione di trattamento, ha mostrato tassi di fallimento fino al 94% 5,6,7.

Rotture parziali della ACL rappresentano il 10% al 28% di tutte le lacrime ACL 8. In uno studio prospettico, Noyes et al. Stima che il 50% dei pazienti con rotture parziali che interessano più della metà del LCA progredito per completare ACL insufficienza dopo la non-trattamento chirurgico 9. Altri studi riportano persistente instabilità e la funzione diminuiti con meno del 30% dei pazienti in grado di tornare alle loro pre-infortunio livello di attività 9,10,11,12,13. Le opzioni di trattamento sono limitate e comprendono le modalità conservative, ritiro termico di rimanere ACL, o ricostruzione del LCA. Recentemente, c'è stato un crescente interesse per la riparazione primaria aumentata. Queste tecniche utilizzano farmaci biologici per migliorare la riparazione di sutura primaria 14. Recenti ricerche hanno tentato di raccogliere mesenchimali come HACL derivato cellule staminali per aggirare le limitazioni innesto, 31,32 ma la validità e l'efficacia di queste cellule è ancora sconosciuta. La fonte cellulare ideale per applicazioni di ingegneria tissutale sembra essere non mesechymal HACL derivato cellule di fibroblasti.

La ricerca attuale si concentra sull'identificazione un materiale di matrice adatto e fonte di cellule per il scaffold ingegnerizzati. Si tratta di una procedura standard per un ACL strappato da scartare come surifiuti rgical durante l'intervento chirurgico di ricostruzione, tuttavia, questo legamento danneggiato può essere una fonte di qualità per l'acquisizione di cellule necessarie per sviluppare e valorizzare un tessuto ideale ingegnerizzato sostituzione ACL. Il nostro laboratorio ha sviluppato un protocollo per l'espansione in vitro di queste cellule derivate HACL raccolte. Utilizzando una matrice 2D di ingegneria infuso con celle HACL derivate, abbiamo progettato una patch che potrebbe potenzialmente aumentare la riparazione ACL parziale e rafforzare legamenti strappati.

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Protocollo

1. Recupero chirurgico

Nota: L'approvazione IRB è stata ottenuta per raccogliere il moncone del LCA durante l'intervento chirurgico di ricostruzione del LCA. Esenzione IRB è stato dato come il moncone ACL utilizzato erano generalmente scartati come rifiuti chirurgico. 20 pazienti sono stati usati per raccogliere il moncone ACL.

  1. Somministrare anestesia generale e antibiotici pre-operatorie come da protocollo dell'ente per il paziente.
  2. Applicare il laccio emostatico e gonfiare 100 mg di sopra della pressione arteriosa sistolica.
  3. Collocare il paziente in posizione supina. Effettuare una incisione antero-laterale orizzontale con il ginocchio in 30-45 ° di flessione per un portale 5 mm e inserire il trocar artroscopica e la macchina fotografica nella borsa sovrarotuleo a 30 °.
  4. Eseguire una artroscopia diagnostica di routine.
  5. Inserisci una tacca e debride sinovia membranosa sul strappato ACL.
  6. Utilizzare un rasoio 4,5 millimetri e ablator per identificare il ceppo ACL.
  7. Utilizzare un ornitorinco dritto amaro per raccogliere spe multiplacimens dei restanti ceppo ACL.
  8. Mantenere il campione in soluzione salina in un contenitore sterile.
  9. Inviare i campioni alla patologia per la decodifica e la consegna finale alla struttura di laboratorio.
  10. Recuperare paziente ed eseguire cure post-operatorie come da protocollo dell'ente.

2. Digestione tessuti e isolamento HACL

  1. Trasferire il tessuto umano ACL ricevuto da patologia a una piastra di Petri con soluzione salina sterile / PBS (tampone fosfato salino).
  2. Tritare il tessuto con le forbici sterili in 1-2 mm 3 pezzi e lavare il tessuto tritato con soluzione fisiologica almeno 3 volte.
  3. Digerire il tessuto tritato con 0,4% collagenasi in DMEM/F-12 (50/50, 1x) medium supplementato con 10% di siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina per 4-6 ore a 37 ° C.
  4. Centrifugare le cellule a 1000 xg per 5 minuti e poi risospendere le cellule in medium.
  5. Lavare le cellule con il mezzo per 2-3 volte e poi seed / cultura in T-25 palloni per 2-3 giorni.

3. Espansione cellulare, congelamento e di scongelamento

  1. Utilizzare un microscopio ottico per visualizzare le cellule in coltura per 2-3 giorni in un pallone T-25.
  2. Mantenere le cellule a 37 ° C in DMEM/F-12 (50/50, 1x) medie supplementato con 10% di siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina (P / S).
    Nota: Cambiare i media quando le cellule mostrano l'aderenza e la morfologia standard. Utilizzare un microscopio ottico per osservare le cellule.
  3. Lavare le cellule confluenti con PBS al giorno 7 (~ 1,3 x 10 6 cellule / boccetta). Aggiungere tripsina (0,5 g / L) e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min. Aggiungere supporti per cellule sospese per neutralizzare la tripsina. Dividere il composto media-cellulare tra tre T-25 palloni.
  4. Lavare le cellule confluenti con PBS, aggiungere tripsina (0,5 g / L), e risospendere in congelamento terreno contenente DMSO, FBS e il mezzo completo (DMEM/F-12 Piano + 10% FBS + 1% P / S) nella rapporto 01:02:07.
  5. Negoziole fiale criogeniche a -80 ° C se verranno utilizzati le cellule entro un mese, e in azoto liquido se saranno conservati cellule per periodi più lunghi.
  6. Scongelare le provette in un bagno d'acqua a 37 ° per il riutilizzo.
    Nota: in genere le cellule 90-95% sopravvivono.

4. Fabbricazione di Tissue Engineered 2-D Poly lattico-co-glicolico acido (plaga) Scaffold

  1. Sciogliere 1 g di plaga in 12 ml di diclorometano in 20 ml di scintillazione flaconcino e agitare la soluzione per 8 ore a velocità costante (800 rpm).
    Nota: Descrizione dettagliata in Gupta et al 15.
  2. Trasferire la soluzione disciolta in un piatto di vetro Petri foderata con carta di protezione fluorurato.
  3. Porre la capsula Petri sotto una cappa di aspirazione per 30 min. Lasciare la piastra di Petri a -20 ° C per una notte e poi a temperatura ambiente. Porre le capsule di Petri in liofilizzatore per garantire la completa evaporazione del solvente per ottenere film sottili di polimero.
  4. Posizionare il fi polimeroLMS in un essiccatore per 24 ore.
  5. Tagliare le pellicole polimeriche in 12 mm di diametro dischi circolari e memorizzarli in un essiccatore fino a quando necessario.

5. Scanning Electron Microscopy (SEM)

  1. Lavare le cellule (50.000 cellule / disk) seminati sul TCPS controllo e il scaffold plaga con PBS 7 giorni successivi semina.
  2. Utilizzare 1,5% glutaraldeide in tampone 0,1 M cacodilato per fissare le cellule e il 2,5% OsO 4 in 0.1 M tampone cacodilato per la post-fissazione.
  3. Lavare le cellule fissate con 0.1 M tampone cacodilato. Essiccare le cellule fissate mediante disidratazione seriale etanolo (50%, 70%, 80%, 90% e 100%) per 15 minuti ciascuno, e in seguito secco in Esametildisilazane (HMDS) durante la notte.
  4. Ventilare la camera di SEM sistema di rivestimento a polverizzazione con valvola a pulsante e sollevare la piastra superiore.
  5. Posizionare i campioni essiccati in camera. Abbassare la piastra superiore.
  6. Accendere la manopola di controllo per pompare per iniziare l'evacuazione della camera.
  7. Valvola di fuga aperta argon. Aspettiper il vuoto scenda a 0,05 mbar.
  8. Cappotto campioni essiccati con uno strato sottile (0,13 nm) di oro / palladio.
  9. Riportare la valvola perdita argon alla sua posizione chiusa.
  10. Accendere la manopola off.
  11. Ventilare la camera con valvola tasto e sollevare la piastra superiore.
  12. Rimuovere i campioni e conservarli in un essiccatore per 24 ore.
  13. Osservare i campioni al microscopio elettronico a scansione.

6. Immunofluorescenza

  1. Lavare le cellule (50.000 cellule / disk) seminati sul TCPS controllo e il scaffold plaga con PBS 7 giorni successivi semina.
  2. Fissare le cellule con 70% di etanolo (freddo) per 10 min.
  3. Incubare le cellule fissate a temperatura ambiente con 1% di sieroalbumina bovina (BSA) in PBS con 0,05% Triton X-100 per 20 min.
  4. Immergere i campioni in 1% Tween a temperatura ambiente per 20 min.
  5. Aggiungi monoclonale anti-β-actina anticorpi (1:400) e incubare le cellule overnight a 4 ° C.
  6. Lavare le cellule con il 0,05% di Tween. Aggiungere anticorpo secondario (capra anti-topo F (ab ') 2 frammento di IgG coniugato con una sonda a fluorescenza, 1:400) alle cellule e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
  7. Lavare le cellule con PBS. Colorare le cellule con colorazione nucleare e montare con l'80% di glicerina.
  8. Osservare le cellule al microscopio confocale.

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Risultati

Il modello di lavoro per il recupero chirurgico, la digestione del tessuto e l'isolamento della persona umana legamento crociato anteriore (HACL) cellule derivate è mostrato in Figura 1. Le cellule migrate dai espianti e aderito alle T-25 palloni. Queste cellule sono state coltivate per 3 giorni e poi sono stati visualizzati sotto un microscopio ottico (Figura 2). Un monostrato confluente stato ottenuto giorno 7. La presenza di cellule vitali, sani ha indicato l'operazione riusc...

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Discussione

L'obiettivo primario di questo studio impalcatura hACL/2D stato quello di utilizzare le cellule ottenute in una patch per aumentare la riparazione primaria di lacrime ACL parziali. Gestione incruento di lacrime ACL parziali possono includere un breve periodo di immobilizzazione, tonificante, un programma di riabilitazione progressiva e regolari valutazioni di follow-up 13,16,17. Tuttavia, molti studi dimostrano che il trattamento conservativo negli atleti è stata associata con scarsi risultati e falliment...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare l'avvio del fondo e il reparto di chirurgia assegno di ricerca presso la Southern Illinois University, School of Medicine; e la concessione Memorial Medical Foundation.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
piastra di PetriFisher Scientific08-757-103C
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Fisher ScientificBP3994
CollagenasiGibco17018-029Conservare a 4 ° C
DMEM/F-12Cellgro10-092-CVNegozio a 4 °C. Caldo in 37 ° C bagnomaria prima dell'uso.
Siero fetale bovino (FBS)Gibco10082Negozio a -80 ° C
Penicillina/StreptomicinaLonza17-602ENegozio a 4 ° C
Provette da centrifuga - 15 mlCorning430790
T-25 palloniBD Falcon3013
Miscela Tripsina-VerseneLonza17-161EConservare a 4 °C. Caldo in 37 ° C bagnomaria prima dell'uso.
DMSOFisher ScientificBP231-100Liquido combustibile. Può causare irritazione alla pelle, agli occhi e alle vie respiratorie.
Fiale criogenicheCorning430489
PLAGAPurac BiomaterialsPurasorb PLG8523Store a -80 ° C
Dischi TCPSFisher Scientific12-545-82
DiclorometanoFisher ScientificAC36423-0010Possibile rischio di cancro. Conservare in un luogo fresco e asciutto.
Bytac paperSaint gobin performance plastics1420652
fiala di scintillazioneFisher Scientific03-339-21G
Siero bovino albumina (BSA)Sigma AldrichA7906Negozio a 4 ° C
TweenFisher ScientificBP337-500
anticorpo anti-beta;-actina nel topo (1° Ab)Sigma AldrichA5441Negozio a -20 ° C
anticorpo capra-anti-topo (2° Ab)Cell Signaling4408Conservare a -20 ° C
Hoechst tinturaSigma Aldrich14530Negozio a -20 ° C
GliceroloFisher ScientificBP229-1
GlutaraldeideFisher ScientificBP2547-1Tossico per inalazione e se ingerito. Provoca ustioni da tutte le vie di esposizione.
EsametildisilazanoFisher ScientificAC43085-1000Liquido e vapore infiammabili. Provoca ustioni da tutte le vie di esposizione.
Forbici steriliMcKesson25-716
CentrifugaEppendorf5804R
Microscopio otticoOlympusCK40
Bagno d'acquaThermo scientific2845
VortexLabnetVX-200
Piastre di Petri in vetrofisher ScientificS31473
Acu-PunchAcuderm Inc.P1225Acu-Punch è stato utilizzato per tagliare dischi da 12 mm Tampone
di cacodilatoSigma Aldrich97068Liquido infiammabile, cancerogeno e irritante.
Tetraossido di osmioSigma Aldrich201030Altamente tossico
Triton X-100Sigma AldrichT8787Nocivo se ingerito
EtanoloDecon Labs2705Tenere lontano da fonti di calore, scintille, fiamme e altre forme di accensione.
Anestesia generale/regionaleFarmaci Amphastar 1% lidocaina, 0,25% bupivacaina, agenti anestetici per induzione e mantenimento
AntibioticiHospira0409-0805-01Ancef 1 g i.v.
Trocar per artroscopiaSmith e Nephew
Telecamera per artroscopiaSmith e Nephew
Pinza artroscopica e rasoio amaroArthrex
da 4,5 mmad interferenza Arthrex
Vitiacciaio inoxArthrex
Sputter CoaterPolaronE5400
Viti in

Riferimenti

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