Per le future applicazioni come una patch per riparare rotture parziali del legamento crociato anteriore (LCA), le cellule derivate ACL umane sono state isolate da tessuti ottenuti durante le procedure ricostruttive, espanse in vitro e coltivati in ingegneria tessutale ponteggi. Adesione cellulare e la morfologia è stata poi eseguita per confermare biocompatibilità sulla superficie patibolo.
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Articolo metodologico
Recupero chirurgico, Isolamento e
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lesioni al LCA è un problema comunemente riscontrato nei soggetti attivi. Anche le lacrime parziali di questa intra-articolare del legamento del ginocchio portare a carenze biomeccanici che compromettono la funzione e la stabilità. Le opzioni correnti per il trattamento delle lacrime ACL parziali vanno da incruento, gestione conservativa a molteplici opzioni chirurgiche, come ad esempio: modifica termica, riparazione singolo fascio, ricostruzione completa, e la ricostruzione della parte danneggiata del legamento nativo. Pochi studi, se del caso, hanno dimostrato un metodo unico per la gestione sia costantemente superiore, e in molti casi i pazienti continuano a dimostrare persistente instabilità e di altre comorbidità.
L'obiettivo di questo studio è quello di individuare una fonte cellulare potrebbe ricorrere allo sviluppo di una patch tessutale che potrebbe essere implementata nella riparazione di un ACL parzialmente strappata. Un nuovo protocollo è stato sviluppato per l'espansione di cellule derivate da patienti sottoposti a ricostruzione del LCA. Per isolare le cellule, tessuti HACL macinate ottenute durante la ricostruzione del LCA è stato digerito in una soluzione di collagenasi. Espansione è stata effettuata utilizzando mezzo DMEM/F12 supplementato con 10% di siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina (P / S). Le cellule sono state poi conservati a -80 ° C o in azoto liquido in un mezzo costituito da congelamento DMSO, FBS e il mezzo di espansione. Dopo lo scongelamento, le cellule derivate HACL sono state poi seminate su un ponteggio ingegneria tessutale, plaga (acido lattico-co-glicolico Poly) e il controllo del tessuto della cultura polistirene (TCPS). Dopo 7 giorni, SEM è stata eseguita per confrontare adesione cellulare alla plaga contro il TCPS controllo. Morfologia cellulare è stata valutata mediante immunofluorescenza. SEM (Scanning Electron Microscope) microscopio hanno dimostrato che le cellule crescevano e rispettati su entrambe le superfici plaga e TCP ed erano confluenti su tutta la superficie di giorno 7. Immunofluorescenza mostrava normale, morfologiche non-ha sottolineatoAL modelli su entrambe le superfici. Questa tecnica è promettente per applicazioni nella rigenerazione e ricostruzione del LCA.
Introduzione
Il legamento crociato anteriore (LCA) è un legamento intra-articolare comunemente feriti del ginocchio. Circa 200.000 (ACL) lesioni sono segnalati ogni anno negli Stati Uniti. Oltre il 75% dei pazienti con lesioni ACL optare per la chirurgia ricostruttiva ortopedica 1,2,3,4. L'intervento chirurgico è spesso indicato a causa di un potenziale di guarigione per sé mediocre 3. Ricostruzione del LCA in genere viene eseguita per mezzo di un innesto di osso autologo o allogenico tendine. Autologo e allogenico rappresentano il gold standard per la ricostruzione come si vantano tassi di successo elevati, e la riparazione sutura primaria, l'altra ....
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Protocollo
1. Recupero chirurgico
Nota: L'approvazione IRB è stata ottenuta per raccogliere il moncone del LCA durante l'intervento chirurgico di ricostruzione del LCA. Esenzione IRB è stato dato come il moncone ACL utilizzato erano generalmente scartati come rifiuti chirurgico. 20 pazienti sono stati usati per raccogliere il moncone ACL.
- Somministrare anestesia generale e antibiotici pre-operatorie come da protocollo dell'ente per il paziente.
- Applicare il laccio emostatico e gonfiare 100 mg di sopra della pressione arteriosa sistolica.
- Collocare il paziente in posizione supina. Effettuare una incisione an....
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Risultati
Il modello di lavoro per il recupero chirurgico, la digestione del tessuto e l'isolamento della persona umana legamento crociato anteriore (HACL) cellule derivate è mostrato in Figura 1. Le cellule migrate dai espianti e aderito alle T-25 palloni. Queste cellule sono state coltivate per 3 giorni e poi sono stati visualizzati sotto un microscopio ottico (Figura 2). Un monostrato confluente stato ottenuto giorno 7. La presenza di cellule vitali, sani ha indicato l'operazione riusc.......
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Discussione
L'obiettivo primario di questo studio impalcatura hACL/2D stato quello di utilizzare le cellule ottenute in una patch per aumentare la riparazione primaria di lacrime ACL parziali. Gestione incruento di lacrime ACL parziali possono includere un breve periodo di immobilizzazione, tonificante, un programma di riabilitazione progressiva e regolari valutazioni di follow-up 13,16,17. Tuttavia, molti studi dimostrano che il trattamento conservativo negli atleti è stata associata con scarsi risultati e falliment.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare l'avvio del fondo e il reparto di chirurgia assegno di ricerca presso la Southern Illinois University, School of Medicine; e la concessione Memorial Medical Foundation.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| piastra di Petri | Fisher Scientific | 08-757-103C | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| Collagenasi | Gibco | 17018-029 | Conservare a 4 ° C |
| DMEM/F-12 | Cellgro | 10-092-CV | Negozio a 4 °C. Caldo in 37 ° C bagnomaria prima dell'uso. |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco | 10082 | Negozio a -80 ° C |
| Penicillina/Streptomicina | Lonza | 17-602E | Negozio a 4 ° C |
| Provette da centrifuga - 15 ml | Corning | 430790 | |
| T-25 palloni | BD Falcon | 3013 | |
| Miscela Tripsina-Versene | Lonza | 17-161E | Conservare a 4 °C. Caldo in 37 ° C bagnomaria prima dell'uso. |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | Liquido combustibile. Può causare irritazione alla pelle, agli occhi e alle vie respiratorie. |
| Fiale criogeniche | Corning | 430489 | |
| PLAGA | Purac Biomaterials | Purasorb PLG8523 | Store a -80 ° C |
| Dischi TCPS | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Diclorometano | Fisher Scientific | AC36423-0010 | Possibile rischio di cancro. Conservare in un luogo fresco e asciutto. |
| Bytac paper | Saint gobin performance plastics | 1420652 | |
| fiala di scintillazione | Fisher Scientific | 03-339-21G | |
| Siero bovino albumina (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Negozio a 4 ° C |
| Tween | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| anticorpo anti-beta;-actina nel topo (1° Ab) | Sigma Aldrich | A5441 | Negozio a -20 ° C |
| anticorpo capra-anti-topo (2° Ab) | Cell Signaling | 4408 | Conservare a -20 ° C |
| Hoechst tintura | Sigma Aldrich | 14530 | Negozio a -20 ° C |
| Glicerolo | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glutaraldeide | Fisher Scientific | BP2547-1 | Tossico per inalazione e se ingerito. Provoca ustioni da tutte le vie di esposizione. |
| Esametildisilazano | Fisher Scientific | AC43085-1000 | Liquido e vapore infiammabili. Provoca ustioni da tutte le vie di esposizione. |
| Forbici sterili | McKesson | 25-716 | |
| Centrifuga | Eppendorf | 5804R | |
| Microscopio ottico | Olympus | CK40 | |
| Bagno d'acqua | Thermo scientific | 2845 | |
| Vortex | Labnet | VX-200 | |
| Piastre di Petri in vetro | fisher Scientific | S31473 | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc. | P1225 | Acu-Punch è stato utilizzato per tagliare dischi da 12 mm Tampone |
| di cacodilato | Sigma Aldrich | 97068 | Liquido infiammabile, cancerogeno e irritante. |
| Tetraossido di osmio | Sigma Aldrich | 201030 | Altamente tossico |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | Nocivo se ingerito |
| Etanolo | Decon Labs | 2705 | Tenere lontano da fonti di calore, scintille, fiamme e altre forme di accensione. |
| Anestesia generale/regionale | Farmaci Amphastar 1 | % lidocaina, 0,25% bupivacaina, agenti anestetici per induzione e mantenimento | |
| Antibiotici | Hospira | 0409-0805-01 | Ancef 1 g i.v. |
| Trocar per artroscopia | Smith e Nephew | ||
| Telecamera per artroscopia | Smith e Nephew | ||
| Pinza artroscopica e rasoio amaro | Arthrex | ||
| da 4,5 mm | ad interferenza Arthrex | ||
| Viti | acciaio inox | Arthrex | |
| Sputter Coater | Polaron | E5400 |
Riferimenti
- Johnson, R. J. The anterior cruciate ligament: A dilemma in sports medicine. Int J Sports Med. 3, 71-79 (1982).
- Owings, M. F., Kozak, L. F. Ambulatory and inpatient procedures in the United States, 1996. Vital Health Stats. 13, 1-119 (1998).
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Ristampe e permessi
