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Articolo metodologico
Derivazione libero-Feeder della cresta neurale progenitrici Cellule pluripotenti da cellule staminali umane
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule umane staminali pluripotenti (hPSCs) hanno un grande potenziale per lo studio dello sviluppo embrionale umano, per modellare malattie umane nel piatto e come fonte di cellule trapiantabili per applicazioni rigenerative dopo malattie o incidenti. Cresta (NC), le cellule neurali sono i precursori per una grande varietà di cellule somatiche adulte, come le cellule del sistema nervoso periferico e glia, melanociti e cellule mesenchimali. Essi sono una preziosa fonte di cellule per studiare gli aspetti dello sviluppo embrionale umana, inclusa la specificazione destino delle cellule e la migrazione. Ulteriore differenziazione delle cellule progenitrici NC in tipi di cellule terminalmente differenziate offre la possibilità di modellare malattie umane in vitro, studiare meccanismi di malattia e di generare cellule per la medicina rigenerativa. Questo articolo presenta l'adattamento di un protocollo vitro attualmente disponibile nella differenziazione per la derivazione di cellule NC da hPSCs. Questo nuovo protocollo richiede 18 giorni di differentiation, è facilmente scalabile e altamente riproducibile tra cellule staminali embrionali umane (hESC) linee così come cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) linee privo di alimentatore. Entrambi i protocolli vecchi e nuovi producono celle NC di uguale identità.
Introduzione
Le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSC) hanno mostrato un potenziale immenso, in particolare per la ricerca e il trattamento futuro delle malattie umane per i quali sono disponibili né modelli animali buoni né i tessuti primari. Esempi di applicazione per la tecnologia hESC / hiPSC sono i seguenti: Celle di particolare interesse possono essere generati da hESC / hiPSCs per la medicina rigenerativa in quantità illimitata 1. Le cellule possono essere prodotti da pazienti portatori di una malattia specifica e usati per stabilire in modelli di malattia vitro 2,3. Tali m....
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Protocollo
1. Preparazione della Cultura Media, piatti rivestiti e manutenzione di hPSCs
Preparazione 1.1 supporti
Nota: Filtrare tutti i media per la sterilizzazione e conservare a 4 ° C al buio per un massimo di due settimane. Numeri nomi dei reagenti, della società e catalogo sono elencati nella tabella dei materiali.
- % FBS DMEM/10: Unire 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep e 5 ml di L-glutammina.
- HES-medio: Combine 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml di L-glutammina, 5 ml Pen / Strep, 10 ml di MEM minimo di soluzione aminoacidi essenziali, 1 ml β-mercaptoetanolo. Aggiungere 10 ....
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Risultati
I due più importanti miglioramenti del protocollo R-NC tramite il protocollo MS5-R-NC 11 sono le condizioni differenziazione definite libero-feeder e la riduzione complessiva del requisito tempo. Cellule di alimentazione MS5 13 sono di midollo osseo cellule stromali derivate murine che hanno dimostrato di sostenere differenziamento neurale da hESC 14. HESCs coltivati su cellule di alimentazione MS5 presso le strutture epiteliali bassa densità di forma e rosette neurali 15, a.......
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Discussione
Per la differenziazione di successo di cellule R-NC da hESC / hiPSCs devono essere effettuate le seguenti considerazioni. E 'fondamentale per lavorare in condizioni di coltura sterili in ogni momento. In particolare, è importante testare culture HPSC per contaminazione micoplasma regolarmente, poiché questa contaminazione ostacolerà differenziazione successo, ma non può essere facilmente rilevata visivamente in culture HPSC. La differenziazione R-NC deve essere iniziato al 90-100% della densità cellulare; densità ce.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi in conflitto da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio per ricercatori avanzati dal Fondo nazionale svizzero e attraverso sovvenzioni NYSTEM (C026446, C026447) e l'iniziativa di cellule staminali Tri-istituzionale (Starr Foundation).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Siero di sostituzione knockout | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Il lotto deve essere testato |
| L-Glutammina | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinilina/Streptomicina | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| Soluzione minima di aminoacidi essenziali MEM | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoetanolo | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | tossico |
| FGF umano ricombinante di base (FGF2) | R& D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 polvere | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucosio | Sigma | G7021 | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma | S5761 | |
| APO transferrina umana | Sigma | T1147 | |
| Insulina umana | Sigma | I2643 | |
| Putriscina dicloridrato | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrice Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Poli-L Ornitina bromidrato Sigma | P3655 | ||
| Mouse Laminin-I | R& Amp; D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectina | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispasi nella soluzione salina bilanciata di Hank 5 U / ml | Tecnologie delle cellule staminali | 7013 | |
| Tripsina-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dicloridrato | Tocris-R& D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R& D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Acido ascorbico | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R& D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R& D Systems | 423-F8 | |
| Porcospino sonico ricombinante di topo (SHH) | R& D Systems | 464SH | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| EGF ricombinante umano | R& D Systems | 236EG | |
| gelatina (PBS senza Mg/Ca) | in casa | ||
| Anticorpi: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM Sigma | C6680-100TST | lotto dovrebbe essere testato | |
| Anti-p75 mIgG1 (recettore del fattore di crescita nervoso) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lotto dovrebbe essere testato |
| APC ratto anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lotto dovrebbe essere testato |
| AlexaFluor 488 capra anti-topo IgG1 | Il lotto Invitrogen | A21121 | deve essere testato |
| Anti Oct4 mIgG2b (usato alla diluizione 1:200) | Il lotto Santa Cruz | sc-5279 | deve essere testato |
| Materiale/Attrezzatura: | |||
| Fibroblasti embrionali di topo (7 milioni di cellule/fiala) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Piastre per colture cellulari: piastre da 10 cm e 15 cm, provette da centrifuga, provette FACS, pipette, pipette Ematocitometro | |||
| in vetro | |||
| Centrifuga | |||
| Incubatore per colture cellulari (CO2, umidità e temperatura controllate) | |||
| Cappa a flusso laminare per colture cellulari con microscopio | |||
| Cappa | di biosicurezza per colture cellulari | ||
| Selezionatrice cellulare, i.e.i. MoFlo | |||
| Microscopio | |||
| Siringa TB da 1 ml 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Sollevatore cellulare Polietilene | Corning Incorporated | 3008 |
Riferimenti
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature.
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Ristampe e permessi
