Questo protocollo descrive una procedura per il campionamento seriale del midollo osseo femorale (BM) senza richiedere il sacrificio di topi. Questa procedura facilita gli studi longitudinali della composizione del midollo osseo dei topi nel tempo e fornisce un accesso seriale alle cellule all'interno del midollo osseo per studi ex vivo e di trapianto.
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Articolo metodologico
Femorale aspirazione del midollo osseo in Live Mice
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il campionamento seriale della composizione cellulare del midollo osseo (BM) è una procedura di routine fondamentale per l'ematologia clinica. Questo protocollo descrive una dettagliata procedura tecnica passo-passo per una procedura analoga in topi vivi che consente la caratterizzazione seriale delle cellule presenti nel midollo osseo. Questa procedura facilita gli studi volti a rilevare la presenza di cellule somministrate esogenamente all'interno del midollo osseo dei topi, come ad esempio negli studi sugli xenotrapianti. Inoltre, questa procedura consente il recupero e la caratterizzazione di cellule arricchite nel midollo osseo come le cellule staminali ematopoietiche e le cellule progenitrici (HSPC) senza sacrificare i topi. Dato che la composizione cellulare del sangue periferico non riflette necessariamente le proporzioni e i tipi di cellule staminali e progenitrici presenti nel midollo, le procedure che forniscono l'accesso a questo compartimento senza richiedere l'interruzione dei topi sono molto utili. L'uso dell'aspirazione del midollo osseo femorale è illustrato qui per l'analisi citologica delle cellule del midollo, la caratterizzazione citofluorimetrica del compartimento staminale/progenitore ematopoietico e la coltura di HSPC selezionate ottenute mediante aspirazione del midollo osseo femorale rispetto al prelievo convenzionale del midollo.
Introduzione
Tutte le cellule del sangue derivano da cellule staminali ematopoietiche (HSC). Le procedure che consentono l'accesso al midollo osseo (BM), la sede della stragrande maggioranza delle HSC nei topi e negli uomini, senza richiedere il sacrificio di animali, forniscono una risorsa per monitorare la fonte dell'emopoiesi in modo seriale. L'obiettivo generale della procedura qui descritta è quello di fornire un protocollo dettagliato per il campionamento di cellule midollari dal femore di topi vivi che fornisca materiale rappresentativo delle cellule che verrebbe recuperato dalla raccolta convenzionale di cellule midollari attraverso il sacrificio dei topi. Il vantaggio di questa procedura rispetto alla raccolta convenzionale di cellule BM è che questa procedura non richiede il sacrificio dei topi e quindi consente lo studio longitudinale del compartimento del midollo osseo dei topi nel tempo.
Sebbene questa procedura di aspirazione del midollo osseo murino sia stata utilizzata in numerosi studi e descritta in precedenza (vedi Sundberg et al. Per una rassegna storica1), le procedure formali passo-passo che illustrano questa tecnica non sono state pubblicate in precedenza. Questo protocollo consente il campionamento seriale di routine del midollo osseo per scopi quali la valutazione dell'attecchimento nel midollo osseo di cellule introdotte esogenamente nel topo (come verrebbe fatto negli studi sugli xenotrapianti, ad esempio2,3), l'analisi del chimerismo nel midollo spinoso per il confronto con quello del sangue periferico (dove i risultati non sono necessariamente congruenti), il monitoraggio dell'abbondanza di specifici tipi di cellule normalmente arricchite nel midollo come le cellule staminali ematopoietiche e le cellule progenitrici, e recupero di cellule BM per coltura ex vivo e/o trapianto. Inoltre, la valutazione del contenuto del midollo può essere molto utile nei modelli murini di malattia ematologica poiché l'aspirazione è utile per valutare il carico di malattia ematologica in momenti in cui la malattia potrebbe non essere evidente nel sangue periferico3-5. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata per valutare la risposta della malattia ematologica nel midollo ai farmaci somministrati in studi terapeutici. Pertanto, la procedura qui descritta è ideale per i ricercatori che desiderano ottenere l'accesso alle cellule ematopoietiche del midollo osseo dai topi per l'analisi citologica, l'analisi citofluorimetrica, la coltura in vitro e/o gli studi di trapianto in vivo senza richiedere sacrifici o danni ai topi.
Il protocollo per il campionamento del midollo osseo qui descritto è abbastanza simile alla tecnica utilizzata per l'iniezione intra-femorale di materiale direttamente nella cavità midollare3,6. La differenza fondamentale è che questo protocollo descrive in dettaglio la procedura per la rimozione delle cellule dal midollo invece di instillare il materiale direttamente nello spazio della cavità del midollo come avviene con l'iniezione intrafemorale.
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Protocollo
Tutte le procedure sugli animali descritti in questo protocollo sono state condotte in conformità con le Linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dalla cura degli animali ed uso Comitato Istituzionale (IACUCs) al Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
1. Aspirazione del midollo osseo (BM) Cellule del femore
- Anestetizzare il mouse che subirà femorale aspirazione del midollo osseo con isoflurano (1-4%), somministrato con un vaporizzatore di precisione. Profondità dell'anestesia deve essere controllata ogni 5-10 minuti durante tutta la procedura osservando che non vi è alcun cambiamento nella frequenza respiratoria associata manipolazione chirurgica e / o l'orecchio, punta e coda pinch. L'anestesia viene indotta con isoflurano e inoltre mantenuto durante tutta la procedura con isoflurano. Una dose pre-procedurale preventivo di buprenorfina alla dose di 0,05-0,1 mg / kg per via sottocutanea ogni 6-12 ore può essere utilizzato per prevenire il dolore associato alla procedura come aggUNCTAD al Carprofene.
- Applicare pomata oftalmica agli occhi del topo dopo induzione di anestesia per evitare l'essiccazione della cornea.
- La pelliccia viene accuratamente ritagliato da una zona di pelle circa il 150% più grande dell'area del sito aspirazione previsto. Pelliccia sciolto viene rimosso con una garza umida. Si prega di tenere il mouse su un tappetino acqua calda circolante o altro cassaforte superficie controllo termostatico per evitare l'ipotermia durante la procedura.
- Disinfettare tutta la gamba contenente il femore, che sarà oggetto di aspirazione con tre serie di scrub alternati (alternati sia con un povidone-iodio (Betadine) o clorexidina (clorexidina) scrub e il 70% di alcool isopropilico o etanolo al 70% imbevuto spugne garza).
- Bagnate un 0,5 ml tubercolina siringa (volume: 0,5 cc; calibro: 27,5 G) con sterile tampone fosfato salino (PBS) prima di aspirare il BM. Riempire la siringa con 200-500 ml di PBS ed espellere immediatamente la PBS. Ripetere questa procedura 2-3 tIME.
- Mantenere la tibia piegato dal femore spingendo la tibia o con il dito anulare o il quinto dito. Verificare che un aereo anestetico adatto è stato raggiunto. La siringa viene tenuto con il pollice e il dito indice. Questo permette ai condili esposto e facilita l'inserimento dell'ago.
- Dopo la bagnatura dei siringa inserire l'ago attraverso il tendine rotuleo modo che l'ago è presentata in modo sicuro tra i due condili del femore. Mantenendo il diafisi vicino alla epifisi del femore con il pollice e l'indice, l'ago viene inserito facilmente nel pozzo del femore.
- Ruotare l'ago verso l'esterno e verso l'alto in modo da essere parallela all'albero del femore. Questa azione facilita il recupero del contenuto di midollo osseo dall'albero femore.
- Girare l'ago in senso orario e antiorario mentre si spinge lentamente nella cavità midollare del femore. Confermare il corretto posizionamento dell'ago spostando delicatamente il syRinge lateralmente.
- Estrarre delicatamente il pistone dell'ago, creando una pressione negativa, mentre si muove l'ago avanti e indietro all'interno della cavità BM. Nota: Il volume di BM aspirato sarà di circa 5 ml, che in genere corrisponde a 0,4-0,8 x 10 6 cellule mononucleari. Aspirazione successo sarà confermata visivamente dalla comparsa di sangue nel superiore dell'ago nella base della siringa. Se nessun sangue è visto nella siringa è probabile che un piccolo frammento osseo o tessuto viene bloccato nell'ago. Questo può essere rimosso dall'ago spostando lo stantuffo su e giù in PBS (questa è una delle ragioni per cui la siringa deve essere riempito con PBS prima aspirazione del BM). Se il tessuto non poter essere rimosse dalla siringa, utilizzare un nuovo ago e siringa (bagnare nuovamente la siringa con 200-500 ml di PBS).
- Una volta BM viene aspirato con successo dal femore, rimuovere l'ago e la siringa dal femore e il mouse.
- Spostare aspirato BM per un pr provetta per microcentrifugaefilled con 500 microlitri di PBS. Per la maggior parte delle applicazioni, le cellule BM devono poi essere tenuti in ghiaccio fino a ulteriore lavorazione, se possibile.
- A seguito del completamento della procedura, somministrare analgesici con carprofene 5 mg / kg per via sottocutanea. Quindi rimuovere mouse dalla anestesia e mettere su un tappetino riscaldato fino pienamente recuperato. NOTA: Non ci dovrebbero essere complicazioni o disagio vissuto seguendo la procedura di aspirazione, se fatto correttamente.
- Prima di tornare topi per la zona abitativa, verificare che siano in grado di deambulare e raggiungere cibo e acqua. Osservare il mouse per segni di sofferenza o di procedura di post infezione nella prossima 24 ore. I segni includono: emorragia costante, anemia, letargia. Se uno qualsiasi di questi segni sono visti procedura di post, l'animale (s) deve essere eutanasia. Nota: BM aspirazione / campionamento può essere ripetuto ma la procedura di ripetizione deve essere eseguita sul femore opposto per evitare traumi ripetuti alla stessa gamba. Ci sono poche informazioni disponibili in merito alla frequency che l'aspirazione BM può essere eseguita. Femorale aspirazione del midollo osseo è generalmente ripetuta non più spesso di una volta ogni due settimane.
2. Valutazione del contenuto cellulare in cellule Aspirato BM
- Cellule pellet recuperati da BM di aspirazione e posto in una provetta per microcentrifuga per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C o RT.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 500 ml di ACK rosso sangue tampone di lisi cellulare ("ammonio-cloruro di potassio" tampone di lisi).
- Incubare le cellule in tampone di lisi dei globuli rossi per 10 min e poi aggiungere 1 ml di PBS e centrifugare la miscela di nuovo a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C o RT. Nota: Il pellet lisato globuli rossi ora consiste di cellule mononucleate BM. Questi possono essere risospese per FACS colorazione, conteggio delle cellule, il trapianto, l'analisi cytospin e / o di ogni altro uso (come sarebbero stati utilizzati cellule midollari raccolte da topi sacrificati).
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Risultati
Femorale BM aspirazione di un topo C57/B6 vivo è stato utilizzato per ottenere cellule mononucleate BM seguono convenzionale raccolto BM del mouse stesso dopo il sacrificio. Cellule mononucleate BM ottenuti con i due metodi sono stati poi analizzati mediante (1) analisi citologica delle cellule BM, (2) determinare la frequenza relativa di cellule staminali / progenitrici ematopoietiche (HSPCs), e (3) ex vivo di cultura HSPCs ordinati. Nel secondo esperimento, lignaggio negativo SCA1 + c-KIT + (LSK) sono state f...
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Discussione
Serial BM aspirazione è una procedura di routine fondamentale per indagine clinica dei disturbi ematologici negli esseri umani. La possibilità di eseguire un campionamento seriale analogo di BM in topi per la caratterizzazione della composizione cellulare e costituenti di BM tutta esperimenti lunghi è anche molto importante. Questa procedura è utile per la caratterizzazione di HSPC, senza perdere il mouse ma anche per rilevare la presenza di tipi cellulari aggiuntivi nel BM nei casi in cui il contenuto del sangue perife...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
O.A.-W. è supportato da un NIH K08 Clinical Investigator Award (1K08CA160647-01), da un U.S. Department of Defense Postdoctoral Fellow Award in Bone Marrow Failure Research (W81XWH-12-1-0041), dal Josie Roberston Investigator Program, e da un Damon Runyon Clinical Investigator Award con il supporto della Evan's Foundation.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| PBS | PAA | H15-002 | |
| Albumina sierica bovina | PAA | K41-001 | |
| ACK tampone di lisi | Fatto in casa | in 1 L. Regolare il pH 7,2 ~ 7,4 e filtrare sterile con 0,22 μ m filtro sottovuoto. | |
| 8,3 g Cloruro di ammonio | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 1 g Bicarbonato di potassio | Fisher Scientific | P184-500 | |
| 200 μ l 0,5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0,5 ml Siringa per tubercolina 27,5 G | Becton Dickinson | 305620 | |
| Filtro per cellule sterili 70 μ m | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Isoflurano, USP | Attane | NDC:66794-014-25 | |
| Ago con estremità smussata | Stemcell Technologies | 28110 | |
| Ago PrecisionGlide 23 G | Becton Dickinson | 305193 | |
| Siringa da 3 ml Punta Luer-Lok | Becton Dickinson | 309657 | |
| Piastra trattata con coltura non tissutale, 6 pozzetti | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 x 75 mm 5 ml tubi | Colorazione FACS Becton Dickinson | 352054 | |
| 12 provette da 5 ml da 75 mm con tappo | Becton Dickinson | 352235 | colorazione FACS |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | ||
| Ly-6G e Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-Cy7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-Cy7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | ||
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16/32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | Per coltura di metocellulosa |
| Carprofene | Crescent Chemical Azienda | C11045850 | 1 dose (5 mg/kg) |
| Citometro a flusso, LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Puralube unguento veterinario (unguento oftalmico sterile per petrolatino) | Dechra-US | 17033-211-38 |
Riferimenti
- Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
- Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
- Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
- Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance. Blood. 116, 5268-5279 (2010).
- Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
- Nolta, J. A. The gold standard improves: a better assay for HSCs. Blood. 106, 1141-1142 (2005).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Purton, L., Scadden, D. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).
- Dykstra, B., et al. Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo. Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).
- Jordan, C., Lemischka, I. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & development. 4, 220-232 (1990).
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- Hess, D. A., et al. Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood. 107, 2162-2169 (2006).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9, 959-963 (2003).
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