Combinatorie 5 proteine fluorescenti marcatura di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche consente il monitoraggio in vivo clonale tramite confocale e microscopia a due fotoni, fornendo approfondimenti midollo osseo emopoietico architettura durante la rigenerazione. Questo metodo permette di mappatura destino non invasiva di cellule HSPCs derivate spettralmente-codificati nei tessuti intatti per lunghi periodi di tempo dopo il trapianto.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton
In questo articolo
Avviso di errata corrige
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Sommario
Abstract
Abbiamo sviluppato e convalidato un marchio metodologia per il monitoraggio clonale di staminali e progenitrici di cellule ematopoietiche (HSPCs) con alta risoluzione spaziale e temporale per studiare in vivo ematopoiesi con il trapianto di midollo osseo modello sperimentale murino fluorescente. Marcatura utilizzando vettori lentivirali codificanti per proteine fluorescenti (PQ) combinatoria genetica ha permesso la mappatura destino cellulare attraverso avanzate di imaging microscopia. Vettori codificano cinque diversi PQ: Cerulean, EGFP, Venere, tdTomato, e mCherry sono stati usati per trasdurre HSPCs contemporaneamente, creando una tavolozza variegata di cellule di colore marcato. Imaging utilizzando confocale / microscopia a due fotoni ibrido consente la valutazione simultanea alta risoluzione delle cellule marcate in modo univoco e la loro progenie in combinazione con componenti strutturali dei tessuti. Volumetrica analisi su grandi aree rivelano che le cellule HSPC-derivate spettralmente codificati possono essere rilevati in modo non invasivo in vari tessuti intatti, tra cui il midollo osseo (BM), Per lunghi periodi di tempo dopo il trapianto. Studi in diretta conciliano multiphoton di video-rate e confocale time-lapse imaging in 4D dimostrano la possibilità di tracciamento cellulare e clonale dinamica in maniera quantitativa.
Introduzione
La produzione di cellule del sangue, ematopoiesi definito, è gestito da una piccola popolazione di staminali e progenitrici di cellule ematopoietiche (HSPCs). Queste cellule risiedono nel midollo osseo (BM) in una nicchia microambientali complesso costituito da osteoblasti, cellule stromali, tessuto adiposo, e le strutture vascolari, tutti implicati nel controllo di auto-rinnovamento e differenziazione 1,2. Come intatto BM è tradizionalmente inaccessibile alle osservazioni dirette, le interazioni tra HSPC e il loro microambiente rimane in gran parte indefinita in vivo. In precedenza, abbiamo stabilito una metodologia per visualizzare l'archite....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti i topi sono stati alloggiati e trattati in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health, e iscritti in un protocollo di cura e uso degli animali NHLBI Comitato approvato. Femmina B6.SJL-Ptprc (d) Pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) e C57BL / 6 topi, 6-12 settimane di vita, sono stati utilizzati come donatore e del ricevente, rispettivamente.
Un elenco di materiali, reagenti e attrezzature sono fornite nella tabella 1.
1 Lego trasduzione del mouse HSPCs e Trapianto di Midollo Osseo
Eseguire le procedure descrit....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Whole-mount 3D confocale / 2-fotoni microscopia ricostruzioni del corso sternale tempo il midollo osseo ha rivelato l'attecchimento e l'espansione dei trapiantati co-5fps in un modello con caratteristiche notevoli: cloni apparso chiaramente delineata, omogeneamente contrassegnati con ampia gamma di colori inizialmente e di progresso nel tempo per contenere preferenzialmente cellule principalmente un colore. Installazione di microscopia confocale ed esempi rappresentativi di immagini 5fps-segnato HSPC nel midollo.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Descriviamo qui i dettagli di una potente metodologia recentemente messo a punto per il monitoraggio cellulare clonale, che unisce la grande diversità generata contrassegnando con-5FP codifica vettori Lego e l'imaging confocale con tandem e microscopia a 2 fotoni per ottenere volumetrico e l'imaging dinamico in tessuti vivi combinatorio. Questo ha esteso l'uso della marcatura registrando confocale identità spettrale in 5 "distinti" canali a 8-bit di colore a base di FP. Così il relativo rapporto di.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Programma di Ricerca Intramurale del National Heart, Lung, Blood Institute del National Institutes of Health. Ringraziamo Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Amburgo, Germania) per aver fornito i cinque plasmidi vettori LeGO; Christian A. Combs e Neal S. Young (NHLBI, NIH) per le discussioni, il supporto e l'incoraggiamento durante questo studio, e Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) per l'assistenza con le iniezioni della vena caudale.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Produzione di virus | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Espressione di Ceruleo |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Espressione di eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Espressione di Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Espressione di tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Espressione di mCherry |
| Calciumm Kit di trasfezione del fosfato | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Piatto di coltura tissutale | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Siero fetale bovino inattivato al calore | Sigma | F4135-500ML | |
| Pen Strep Glutammina | Gibco, Life Tecnologia | 10378-016 | |
| Provette per centrifuga | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifuga | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Filtro guidato da siringa Unite (0,22 & micro; m) | Millipore | SLGS033SS | |
| Raccolta, purificazione, trasduzione e trapianto di cellule di topo | |||
| ACK tampone di lisi | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Kit di deplezione cellulare di derivazione (topo) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| Colonne LS + tubi | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Filtri di pre-separazione (30 &; micro; m) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| Terreno senza siero StemSpan SFEM per la coltura e l'espansione di cellule ematopoietiche (500 ml) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| Murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | 100 µ g/ml è 1.000x |
| Divisione RDI SCF murino ricombinante | di Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | 100 &; g/ml è 2.000x |
| IL-3 murino ricombinante | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | 20 µ g/ml è 2.000x |
| FLT-3 Ligando | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | 100 µ g/ml è 1.000x |
| piastre a 12 pozzetti, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | Risospensione a 50 µ g/ml |
| Protamina Solfato | Sigma | P-4020 | 4 µ g/ml è 1.000x |
| Microscopia confocale e a due fotoni | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1 M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Piatto di coltura con fondo in vetro P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Piatto di coltura con fondo in vetro P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Vetro di copertura in borosilicato; 4 pozzetti | Thermo Scientific | 155383 | |
| Vetrini coprioggetti 22 mm No 2 | Thomas Scientific | 6662-Q55 | |
| Leica TCS SP5 AOBS microscopio confocale e multifotone a cinque canali | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph portata laser 680-1.080 nm | Camaleonte coerente | ||
| Gamma laser OPO compatta 1.030-1.350 nm | |||
| 25X/0,95 NA obiettivo a immersione in acqua coerente (WD=2,5 mm) | Leica Microsystems | ||
| Obiettivo a secco HC-PLAPO-CS 20X/0,70 NA (WD=0,6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Obiettivo a immersione in acqua HC-PL-IRAPO 40X/1,1 NA (WD=0,6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris versione software 7.6 | Bitplane |
Riferimenti
- Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
A correction was made to In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
