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Articolo metodologico

In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton

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⸱

DOI:

10.3791/51669

⸱

6 agosto 2014

 ,  , 
1Light Microscopy Core Facility, NHLBI/NIH, 2Hematology Branch, NHLBI/NIH

In questo articolo

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Sommario

Combinatorie 5 proteine ​​fluorescenti marcatura di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche consente il monitoraggio in vivo clonale tramite confocale e microscopia a due fotoni, fornendo approfondimenti midollo osseo emopoietico architettura durante la rigenerazione. Questo metodo permette di mappatura destino non invasiva di cellule HSPCs derivate spettralmente-codificati nei tessuti intatti per lunghi periodi di tempo dopo il trapianto.

Abstract

Abbiamo sviluppato e convalidato un marchio metodologia per il monitoraggio clonale di staminali e progenitrici di cellule ematopoietiche (HSPCs) con alta risoluzione spaziale e temporale per studiare in vivo ematopoiesi con il trapianto di midollo osseo modello sperimentale murino fluorescente. Marcatura utilizzando vettori lentivirali codificanti per proteine ​​fluorescenti (PQ) combinatoria genetica ha permesso la mappatura destino cellulare attraverso avanzate di imaging microscopia. Vettori codificano cinque diversi PQ: Cerulean, EGFP, Venere, tdTomato, e mCherry sono stati usati per trasdurre HSPCs contemporaneamente, creando una tavolozza variegata di cellule di colore marcato. Imaging utilizzando confocale / microscopia a due fotoni ibrido consente la valutazione simultanea alta risoluzione delle cellule marcate in modo univoco e la loro progenie in combinazione con componenti strutturali dei tessuti. Volumetrica analisi su grandi aree rivelano che le cellule HSPC-derivate spettralmente codificati possono essere rilevati in modo non invasivo in vari tessuti intatti, tra cui il midollo osseo (BM), Per lunghi periodi di tempo dopo il trapianto. Studi in diretta conciliano multiphoton di video-rate e confocale time-lapse imaging in 4D dimostrano la possibilità di tracciamento cellulare e clonale dinamica in maniera quantitativa.

Introduzione

La produzione di cellule del sangue, ematopoiesi definito, è gestito da una piccola popolazione di staminali e progenitrici di cellule ematopoietiche (HSPCs). Queste cellule risiedono nel midollo osseo (BM) in una nicchia microambientali complesso costituito da osteoblasti, cellule stromali, tessuto adiposo, e le strutture vascolari, tutti implicati nel controllo di auto-rinnovamento e differenziazione 1,2. Come intatto BM è tradizionalmente inaccessibile alle osservazioni dirette, le interazioni tra HSPC e il loro microambiente rimane in gran parte indefinita in vivo. In precedenza, abbiamo stabilito una metodologia per visualizzare l'architettura 3D della BM intatta utilizzando confocale a fluorescenza e riflessione microscopia a 3. Abbiamo caratterizzato l'espansione di EGFP-marcati HSPCs nel BM, ma l'uso di una sola FP escludessimo analisi di rigenerazione a livello clonale. Molto di recente abbiamo approfittato della lentivirali Gene Ontology (Lego) i vettori che esprimono costitutivamente flproteine ​​uorescenti (FPS) per contrassegnare in modo efficiente le cellule 4,5. Co-trasduzione del HSPC con 3 o 5 vettori genera una tavolozza variegata di colori combinatorie, consentendo il monitoraggio di molteplici singoli cloni HSPC.

Contrassegnato HSPC combinato con nuova tecnologia di imaging permesso di tracciare individuale homing HSPC e attecchimento nel BM di topi irradiati. Vettori lego sono stati usati per marcare HSPC con 3 o 5 diversi fps (da Cerulean, eGFP, Venere, tdTomato, e mCherry) e seguire il loro attecchimento nel tempo nel BM mediante microscopia confocale e 2-fotone, consentendo la visualizzazione chiara delle ossa e di altri strutture a matrice, e la relazione di cloni HSPC ai componenti del loro microambiente. HSPC sono stati purificati come le cellule negative lignaggio da C57Bl / 6 topi BM, trasdotte con vettori lego, e reinfuse tramite iniezione vena della coda in topi congenici mielo-ablato. Monitorando grandi volumi del tessuto sterno BM abbiamo visualizzato attecchimento endostale si verificano primaRigenerazione BM. Gruppi di cellule con spettri di colore diversi apparso inizialmente in prossimità all'osso e progredito a livello centrale nel corso del tempo. È interessante notare che, dopo più di 3 settimane il midollo costituito da ammassi clonali macroscopici, suggerendo diffusione della emopoiesi derivati ​​dalle singole HSPCs contiguo nel midollo, invece di ampia diffusione HSPCs attraverso il flusso sanguigno. C'era meno diversità di colore in momenti in ritardo, suggerendo difficoltà di trasduzione a lungo termine ripopolare le cellule con più vettori.

Inoltre, HSPCs formata cluster nella milza, un organo responsabile anche per emopoiesi nei topi. Singole celle HPSC-derivati ​​potrebbero essere risolti nel timo, linfonodi, milza, fegato, polmoni, cuore, pelle, muscolo scheletrico, tessuto adiposo, e reni pure. Le immagini 3D possono essere valutati qualitativamente e quantitativamente per apprezzare la distribuzione di cellule con perturbazioni minime dei tessuti. Infine, illustriamod la fattibilità di studi dinamici live in 4D, combinando multifotonica scansione di risonanza e confocale time-lapse imaging. Questa metodologia consente non invasiva alta risoluzione, multidimensionale cellula-destino tracciato di spettralmente contrassegnati cellule popolazioni nella loro architettura 3D intatta, fornendo un potente strumento per lo studio della rigenerazione dei tessuti e della patologia.

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Protocollo

Tutti i topi sono stati alloggiati e trattati in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health, e iscritti in un protocollo di cura e uso degli animali NHLBI Comitato approvato. Femmina B6.SJL-Ptprc (d) Pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) e C57BL / 6 topi, 6-12 settimane di vita, sono stati utilizzati come donatore e del ricevente, rispettivamente.

Un elenco di materiali, reagenti e attrezzature sono fornite nella tabella 1.

1 Lego trasduzione del mouse HSPCs e Trapianto di Midollo Osseo

Eseguire le procedure descritte di seguito in un livello di biosicurezza certificata 2 (BSL-2) Armadio (cappa di coltura di tessuti).

  1. Produzione di lego vettori di codifica 5 fps
    1. Utilizzare il lentivirali "Gene Ontology" (Lego) plasmidi vettori, ognuno che codifica per una diversa FP di un forte promotore SFFV costitutivo, tra cui lego-CER2 (Cerulean), lego-G2 (EGFP), lego-V2 (Venere), lego-T2 (tdTomato), e lego-C2 (mCherry) gentilmente fornito dal Dr. Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Amburgo, Germania); ora disponibili anche da Addgene 5-7.
    2. Per produrre vettori LEGO, semi di 5 x 10 6 cellule 293T in 10 piatti cm (utilizzare 12 piatti per ogni vettore) 24 ore prima della trasfezione in 8 ml di I10 supporti (IMDM supplementato con 10% FCS e glutammina / penicillina / streptomicina).
    3. Trasfezione le cellule con fosfato di calcio con le raccomandazioni del kit CAPHOS leggermente modificati:
      1. Per ogni mix piatto 15 mg Lego vettore, 12 mg pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 mg PREV-TAT, e 1 mg plasmidi pMD2.G-VSV-G in presenza di 50 microlitri 2,5 M CaCl 2, e aggiungere acqua per produrre un volume totale di 500 microlitri.
      2. Plasmidi di DNA precipitato con 500 ml di 2x HeBS (HEPES-Buffered Saline) e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente prima di aggiungere ad ogni piatto di cellule 293T.
      3. Incubare le cellule per6 ore a 37 ° C 5% di CO 2 incubatore; rimuovere il supporto e aggiungere fresco cultura mediatica 6 ore dopo la trasfezione.
    4. Raccogliere surnatanti di coltura contenente particelle lentivirali da ogni piatto, ogni giorno, per 3 giorni. Ogni collezione surnatante giorno successivo aggiungere media I10 fresco a ogni piatto.
      1. Filtrare 0,22 micron pori, piscina e concentrarsi surnatanti di ultracentrifugazione su un rotore SW28 per 2 ore a 71.900 xg e 4 ° C.
      2. Risospendere il surnatante in 1 ml di StemSpan media. Aliquota le scorte lentivirali in 200 ml e conservare a -80 ° C.
  2. Titolazione di particelle lentivirali
    Determinare il titolo di particelle vettoriali Lego in surnatanti raccolti attraverso la quantificazione di trasduzione unità / ml utilizzando cellule NIH3T3. I titoli permettono di calcolare il volume di ciascun supernatante vettoriale necessaria per provocare la molteplicità relativa desiderata di infezione (MOI) per porta sperimentalecellule.
    1. Tavola 5 x 10 4 NIH3T3 cellule per pozzetto (12-pozzetti) in 2 ml di mezzi I10 un giorno prima della titolazione.
    2. Preparare diluizioni seriali 5-fold di surnatanti vettoriali in mezzi I10 integrato con solfato di protamina (4 mg / ml è 1,000x).
    3. Rimuovere il supporto dalle cellule, e sostituirlo con 500 ml di diluizioni surnatante contenente l'equivalente di 2, 0,8, 0,32 e 0,128 ml di virus concentrati.
    4. Determinare il numero (n) di cellule per pozzetto presenti al momento della trasduzione, contando pure un controllo.
    5. 6 ore dopo la trasduzione, aggiungere 2 ml di media I10 e incubare per 3 giorni a 37 ° C, 5% di CO 2.
    6. Raccogliere le cellule da ogni pozzetto usando tripsina-EDTA, e determinare la percentuale di cellule fluorescenti (% FP) mediante citometria a flusso.
    7. Calcolare il titolo come segue, la media dei titoli ottenuti per ciascun bene (diluizione) con una conseguente FP% tra il 1 e il 50%: titolo (particelle vettore / ml) = nx% FP / volume di surnatante vettore (ml). Calcolare la media dei titoli ottenuti per ciascuna diluizione se la FP% è compreso tra 1 e 50%.
  3. Raccolta delle cellule del mouse, Purificazione, trasduzione, e Trapianti (schematicamente illustrato in Figura 1A adattato da Malide et al. 4).
    1. Sacrifica topi donatori da una procedura approvata. Raccolta di midollo osseo da anteriore e posteriore degli arti: sezionare omeri, trovarsi femori e tibie, rimuovere completamente tutto muscoli, legamenti e tessuto in eccesso da ossa, tagliare tutta la fine di ogni osso il più vicino possibile al giunto, e lavare il midollo osseo di l'osso utilizzando un ago G 27-0 su una siringa contenente supporti I10.
    2. Agglomerare le intere cellule di midollo osseo per 10 min a 500 xg, a 4 ° C e lisare i globuli rossi due volte con 50 ml di tampone ACK. Risospendere le cellule in 10 ml di mezzi I10.
    3. Purificare (Lin-) cellule progenitrici lignaggio negativi con il kit di lignaggio esaurimento MACS secondo un kit Protoco modificatol:
      1. Utilizzare 30 ml di microsfere anti-biotina invece di 10 ml / 10 7 cellule; completare le fasi di lavaggio con i media I2 (IMDM integrato con il 2% FCS) al posto del tampone.
      2. Inserire una fase di lavaggio tra l'incubazione con Cocktail biotina-anticorpo e l'incubazione con anti-biotina microsfere; ed equilibrare la colonna con I10 posto del tampone.
    4. Culture cellule LIN- per 48 ore ad una densità iniziale di 5 x 10 5 cellule / ml in mezzi StemSpan supplementato con 10 ng / ml di IL-3 murino, 100 ng / ml di IL-11 murina, 100 ng / ml umano Flt-3 ligando, e 50 ng / ml fattore delle cellule staminali murine.
    5. Trasferimento da 1 a 4 x 10 5 cellule a 12 pozzetti piastre rivestite con RetroNectin e trasdurre con surnatanti Lego, ciascuna ad una molteplicità di infezione (MOI) di 6-7 per ottenere il 50% di efficienza di espressione per ogni FP, in presenza di StemSpan media e citochine dettagliati sopra e 4 mg / ml di solfato di protamina.
    6. Trasdurre cellulecon ogni vettore Lego singolarmente come descritto al punto 1.3.5 e mescolare le cellule dopo trasduzione (chiamato Mix) o co-trasdurre cellule con tutti i surnatanti 5 Lego vettoriali contemporaneamente (chiamato Co). Rimuovere le cellule 24 ore più tardi, lavare una volta con StemSpan media senza citochine, e risospendere in mezzi StemSpan senza citochine per il trapianto, o trasferirli su supporti fresco con citochine, e di cultura per ulteriori 96 ore prima di microscopia confocale e citometria a flusso.
      1. Eseguire trapianto di midollo osseo infondendo trasdotte Lin- HSPCs tramite iniezione in vena della coda 11 monodose Gy destinatari pre-irradiati (6-18 ore prima del trapianto) i destinatari, in un volume di 100 l, ad una dose di cellule per topo corrispondente a 1 cellule -4 x 10 5 Lin- originariamente placcato per la trasduzione. In ogni esperimento, trapianto di un'intera coorte di animali con la stessa popolazione di cellule del midollo osseo del donatore trasdotte.
      2. Per la caratterizzazione in vitro di trasdotte HSPC, la cultura le cellule per ulteriori 4-5 giorni in StemSpan completato con citochine e analizzare mediante citometria a flusso per efficienza di trasduzione, e al microscopio per la diversità di colore.
        1. Sacrificio singoli topi e recuperare tessuti e organi per l'imaging, a vari tempo indica fino a 120 giorni post-trapianto.
          1. Spruzzare con etanolo la pelliccia del mouse e incidere la pelle sul lato ventrale evitando capelli diffusione.
          2. Sezionare e accise secondo le procedure standard della milza, linfonodi poplitei, polmoni, cuore, pelle, tessuto adiposo, muscolo scheletrico, rene, fegato, così come la testa di accesso ai calvaria.
          3. In alternativa, utilizzare calvaria o impostare una finestra ossea per l'imaging dal vivo più volte nel corso del tempo 2,8,9 o immagine organi superficiali come i nodi della pelle e linfonodi in animale vivo.
        2. Mettere singoli organi in 35 millimetri piastre di coltura numero 0 copertura in vetro a 50-10056, l PBS per l'imaging intatti, senza sezionamento, fissazione o ulteriore lavorazione come descritto al punto 2.5.
        3. Per l'imaging volumetrico, mantenere gli organi in in PBS freddo fino al momento dell'uso. Per time-lapse imaging procedere immediatamente al di imaging di organi in DMEM, 10% FBS contenenti 20 HEPES mM a 37 ° C

2 confocale e microscopia a due fotoni e Image Analysis

  1. Eseguire immagini di microscopia utilizzando un sistema a cinque canali confocale e multiphoton Leica SP5 dotato di multi-linea Argon, diodo 561 nm, 594 nm HeNe, e HeNe 633 nm laser visibili. Utilizzare in modalità 2-fotone, un femtosecondi pulsata Ti: zaffiro (Ti-Sa) laser, sintonizzabile per l'eccitazione da 680 a 1.080 nm con correzione dispersione. Utilizzare in esperimenti che coinvolgono rosso-spostato PQ (tdTomato e mCherry), un oscillatore parametrico ottico (OPO) laser per estendere la gamma di lunghezze d'onda di uscita fino a 1,030-1,300 nm, in sequenza o simultaneamente con tegli Ti-Sa laser.
  2. Immagine vari tessuti utilizzando una HCX-IRAPO-L 25X / 0,95 NA obiettivo immersione acqua (WD = 2,5 mm), a-PLAPO CS HC-20X / 0,70 obiettivo NA secco (WD = 0.6 mm), o HC-PL-IRAPO 40X /1.1 NA obiettivo di immersione in acqua (WD = 0.6 mm).
  3. Ottenere confocale spettri di fluorescenza di raccolta pile lambda (xyλ) della luce emessa in 5 nm-larghezze di banda dello spettro visibile dalle cellule BM trasdotte con un singolo FP Lego vettore, nonché di controllo, non-trapiantato BM.
    1. Immagini di processo con il software Leica LAS v2.4.1-AF per creare spettri di riferimento di tutti i 5 fps, nonché di autofluorescenza (Figura 2A). Utilizzando l'individuo spettri FP e la differenza di luminosità fluorescenza (espressa in% di EGFP) di Cerulean (79%), Venere (156%), tdTomato (283%) e mCherry (47%) impostato 5 canali di imaging in sequenza come segue: Cerulean (458 / 468-482 nm), EGFP (488 / 496-514 nm), Venere (514 / 523-558 nm), tdTomato (561 / 579-597 nm), e mCherry (594 / 618-670 nm) ( Figura 2B).
    2. Convalidare separazione accurata PQ, come le cellule trasdotte con ogni singolo FP sono visibili solo nel canale corrispondente e assente dal resto (Figura 2C). Inoltre, questo approccio multi-canale definito crea un "colorprint" uniche a 5 canali che consente la successiva analisi del colore e il monitoraggio clonale e ha il vantaggio di ridurre i tempi di acquisizione rispetto alle immagini spettrali.
  4. Emissione di fluorescenza separato, in modalità 2-fotone, da alta efficienza specchi dicroici personalizzato e raccogliere con un quattro canali non descanned rivelatore (NDD) come segue: uno specchio dicroico a 568 nm seguito da uno specchio dicroico a 465 nm, seguita da un filtro di emissione 452/45 nm per SHG o autofluorescenza e cerulea, un filtro 525/40 nm di emissione per EGFP o Venere, e uno specchio dicroico 648 nm e 620/60 nm filtro delle emissioni per tdTomato o mCherry.
    1. Rivelare informazioni strutturali da microscopia a due fotoni isegnale (SHG) da ossa e del collagene fibrillare (eccitato a 920 nm o 860 nm raccolti in una dispersa posteriore imaging contrasto ntrinsic (come descritto sopra) di autofluorescenza dei tessuti da elastina, NADH, (eccitato a 780 nm), e la seconda armonica generati direzione) 10,11.
  5. Per volume rendering 3D, raccogliere le serie di immagini xyz (tipicamente 1 x 1 x 4 micron 3 dimensioni voxel) lungo l'asse z a 5 micron intervalli su una gamma di profondità (150-300 micron) in tutto il midollo osseo e altri tessuti, su vaste regioni utilizzando la funzione piastrella del software per generare automaticamente i volumi cuciti comprendente un intero fossa sterno, circa 2,5 x 1,2 mm 2 (xy) e 300 micron (z) (figure 2D-2E) e Movie 1.
    1. Immagine cranica il midollo direttamente attraverso il cranio, senza sezionamento 2, 8.
    2. Sezione sterno lungo il piano sagittale (bisezione) e poitrasversalmente al giunto tra 2 sternale fossato e immagine attraverso il taglio faccia 3,4,12 (Panoramica Figura 1B adattato da Takaku et al 3).
  6. Per 4D time-lapse imaging, posizionare asportati recentemente poplitea linfonodi, milza, polmone, o campioni calvaria non tagliata da 35 mm piatti della cultura numero 0 coprioggetti, in 50-100 ml DMEM 10% FBS contenente 20 HEPES mM a 37 ° C e utilizzare 2-fotone Ti-Sa di eccitazione (860 nm) combinata con l'eccitazione confocale (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) e Leica scanner di risonanza (8000 Hz / sec), prendendo z-stack (~ 80 micron) ad intervalli di 20 sec per un massimo di 1 ora.
    1. Per simultaneo a tre colori impiego di imaging 2P Ti-Sa sintonizzati a 860 nm contemporaneamente con il laser OPO (sintonizzato a 1.130 nm per tdTomato, o 1.140 nm mCherry) (Movie 2).
  7. Ricostruzione e analisi dei volumi 3D e sequenze temporali 4D
    1. Utilizzare Imaris x64 softwsono dati di cellule fluorescenti all'interno del midollo osseo e diversi tessuti e di esportarle come filmati 3D-rotazione versione 7.6, o pacchetti software alternativi per trasformare i-pile di tegole di immagini grezzi in volume rendering (3D), come descritto in precedenza 3,4 (Film 1) step-by-step esempio:
      1. In Imaris, Aprite l'immagine z-stack; Selezionare "Superare" per visualizzare la visualizzazione volume 3D.
      2. Utilizzare "navigare" per alzare il volume intorno a 360 °.
      3. Selezionare "Animazione" per creare un'animazione; utilizzare fotogrammi chiave per aggiungere viste selezionate, zoom, rotazioni del volume; Visualizzare in anteprima il filmato, modificare come necessario e salvare il file in un formato filmato desiderato (es: avi, mov).
    2. Per la valutazione quantitativa delle cellule e di clone di frequenza 3D, posizioni, dimensioni e distribuzione, ulteriore processo gli z-stack utilizzando i moduli Imaris XT che integrano applicazioni MATLAB spettacolo meas distanzamisurazio- (utilizzando un algoritmo di trasformazione distanza) e cluster analisi, come descritto in precedenza 3,4. Trasforma le sequenze di pile di immagini nel corso del tempo in quattro dimensioni (4D) film volumi rendering con il software x64 Imaris, e utilizzare spot e analisi di superficie per il monitoraggio semiautomatico della motilità cellulare in tre dimensioni utilizzando algoritmi di movimento autoregressivi.
    3. Eseguire l'analisi multispettrale delle cellule come segue: estrarre il multi-colore spot etichettati con l'aggiunta di tutti i 5 canali attraverso il canale aritmetica dei Imaris XT in un nuovo canale; determinare per tutti i punti (celle) l'intensità di fluorescenza media in ciascuno dei canali dei componenti 5. Esportare i valori nel software Excel per tracciare i grafici che mostrano il "colorprint" unico ovvero la relativa% di ogni FP a singola cellula (Figura 2E grafico). Correggere i set di dati per la deriva dei tessuti, e calcolare la velocità delle cellule e lo spostamento nel tempo, le lunghezze delle tracce, percorsi e distanze; I valori di esportazione in Excel software per tracciare grafici. Montare figure composite con Adobe Photoshop software CSS 5.

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Risultati

Whole-mount 3D confocale / 2-fotoni microscopia ricostruzioni del corso sternale tempo il midollo osseo ha rivelato l'attecchimento e l'espansione dei trapiantati co-5fps in un modello con caratteristiche notevoli: cloni apparso chiaramente delineata, omogeneamente contrassegnati con ampia gamma di colori inizialmente e di progresso nel tempo per contenere preferenzialmente cellule principalmente un colore. Installazione di microscopia confocale ed esempi rappresentativi di immagini 5fps-segnato HSPC nel midollo...

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Discussione

Descriviamo qui i dettagli di una potente metodologia recentemente messo a punto per il monitoraggio cellulare clonale, che unisce la grande diversità generata contrassegnando con-5FP codifica vettori Lego e l'imaging confocale con tandem e microscopia a 2 fotoni per ottenere volumetrico e l'imaging dinamico in tessuti vivi combinatorio. Questo ha esteso l'uso della marcatura registrando confocale identità spettrale in 5 "distinti" canali a 8-bit di colore a base di FP. Così il relativo rapporto di...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal Programma di Ricerca Intramurale del National Heart, Lung, Blood Institute del National Institutes of Health. Ringraziamo Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Amburgo, Germania) per aver fornito i cinque plasmidi vettori LeGO; Christian A. Combs e Neal S. Young (NHLBI, NIH) per le discussioni, il supporto e l'incoraggiamento durante questo studio, e Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) per l'assistenza con le iniezioni della vena caudale.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Produzione di virus
LeGO-Cer2Addgene27338Espressione di Ceruleo
LeGO-G2Addgene25917Espressione di eGFP
LeGO-V2Addgene27340Espressione di Venus
LeGO-T2Addgene27342Espressione di tdTomato
LeGO-C2Addgene27339Espressione di mCherry
Calciumm Kit di trasfezione del fosfatoSigmaCAPHOS-1KT
Piatto di coltura tissutaleBD Falcon353003
IMDMGibco, Life Technology12440-053
Siero fetale bovino inattivato al caloreSigmaF4135-500ML
Pen Strep GlutamminaGibco, Life Tecnologia10378-016
Provette per centrifugaBeckman Coulter326823
SW28 UltracentrifugaBeckman CoulterL60
Millex Filtro guidato da siringa Unite (0,22 & micro; m)MilliporeSLGS033SS
Raccolta, purificazione, trasduzione e trapianto di cellule di topo
ACK tampone di lisiQuality Biologicals Inc.118-156-101
Kit di deplezione cellulare di derivazione (topo)Miltenyi Biotec Inc. USA130-090-858
Colonne LS + tubiMiltenyi Biotec Inc. USA130-041-306
Filtri di pre-separazione (30 &; micro; m)Miltenyi Biotec Inc. USA130-041-407
Terreno senza siero StemSpan SFEM per la coltura e l'espansione di cellule ematopoietiche (500 ml)StemCell Technologies Inc 9650
Murine IL-11 CFR & D Systems Inc418-ML-025/CF100 µ g/ml è 1.000x
Divisione RDI SCF murino ricombinantedi Fitzgerald Industries Intl RDI-2503100 &; g/ml è 2.000x
IL-3 murino ricombinanteR & D Systems Inc403-ML-05020 µ g/ml è 2.000x
FLT-3 LigandoMiltenyi Biotec Inc. USA130-096-480100 µ g/ml è 1.000x
piastre a 12 pozzetti, CostarCorning Inc.3527
RetronectinTakara Bio IncT100A/BRisospensione a 50 µ g/ml
Protamina SolfatoSigmaP-40204 µ g/ml è 1.000x
Microscopia confocale e a due fotoni
DMEMLonza12-614F
1 M HepesCellgro, Mediatech Inc.25-060-CI
Piatto di coltura con fondo in vetro P35G-0-20-CMatTek CorporationP35G-0-20-C
Piatto di coltura con fondo in vetro P35G-0-14-CMatTek CorporationP35G-0-14-C
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Vetro di copertura in borosilicato; 4 pozzettiThermo Scientific155383
Vetrini coprioggetti 22 mm No 2Thomas Scientific6662-Q55
Leica TCS SP5 AOBS microscopio confocale e multifotone a cinque canaliLeica Microsystems
Chameleon Vision II -TiSaph portata laser 680-1.080 nmCamaleonte coerente
Gamma laser OPO compatta 1.030-1.350 nm
25X/0,95 NA obiettivo a immersione in acqua coerente (WD=2,5 mm)Leica Microsystems
Obiettivo a secco HC-PLAPO-CS 20X/0,70 NA (WD=0,6 mm)Leica Microsystems
Obiettivo a immersione in acqua HC-PL-IRAPO 40X/1,1 NA (WD=0,6 mm)Leica Microsystems
Imaris versione software 7.6Bitplane
HCX-IRAPO-L

Riferimenti

  1. Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
  2. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
  3. Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
  4. Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
  5. Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
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Errata corrige


Formal Correction: Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

This was corrected in the discussion from:

This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

to:

This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

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Cellule staminali e progenitrici ematopoieticheMarcatura con proteine fluorescentiMicroscopia confocaleMicroscopia a due fotoniTrapianto di midollo osseoTrasduzione con vettori lentiviraliAnalisi del tracciamento clonaleImaging multicoloreTime lapse 4DUnmixing spettrale
In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton
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