Disturbi metabolici sono tra una delle malattie più comuni negli esseri umani. Il modello di organismo geneticamente trattabili D. melanogaster può essere utilizzato per identificare nuovi geni che regolano il metabolismo. Questo documento descrive un metodo relativamente semplice, che permette lo studio del metabolismo in linea misurando la produzione di CO 2.
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Articolo metodologico
Misurazione del tasso metabolico in
In questo articolo
Sommario
Abstract
Disturbi metabolici sono un problema frequente che colpisce la salute umana. Pertanto, la comprensione dei meccanismi che regolano il metabolismo è un compito scientifico fondamentale. Molti geni che causano malattie negli esseri umani hanno un omologo mosca, rendendo Drosophila un buon modello per studiare vie di segnalazione coinvolte nello sviluppo di malattie diverse. Inoltre, la trattabilità di Drosophila semplifica schermi genetici per aiutare a identificare nuovi bersagli terapeutici che possono regolare il metabolismo. Per eseguire tale schermata è necessario un metodo semplice e veloce per identificare le variazioni dello stato metabolico di mosche. In generale, la produzione di anidride carbonica è un buon indicatore di ossidazione del substrato ed il dispendio energetico fornire informazioni sullo stato metabolico. In questo protocollo si introduce un metodo semplice per misurare la CO 2 in uscita dalle mosche. Questa tecnica può potenzialmente aiutare nell'identificazione di perturbazioni genetiche che colpiscono tasso metabolico.
Introduzione
Il ciclo di Krebs biochimico genera ATP attraverso l'ossidazione di acetato derivata dai carboidrati, grassi e proteine che producono CO 2. In Drosophila, O 2 ingresso è direttamente correlata con CO 2 uscita e riflette il livello di metabolismo 1. Così, la misurazione di CO 2 in uscita è stato usato con successo in studi legati all'invecchiamento e metabolismo 2-5. Qui il nostro laboratorio ha modificato apparati sperimentali progettati in precedenza, consente la misurazione della produzione di CO 2 fino a diciotto campioni senza bisogno di attrezzature specializzate. Altri e abbiamo già utilizzato questo metodo per mostrare le differenze nei tassi metabolici in linea che sono carenti nella distrofia muscolare proteina associata, distroglicano (DG) 6-8.
O 2 utilizzati per il metabolismo ossidativo è convertito in CO 2, che viene espulso come rifiuti respiratorio. La costruzionezione respirometri fatti a mano viene descritto che permette la determinazione del tasso di O 2 consumato. Mosche sono posti in un contenitore sigillato con una sostanza che assorbe espulso CO 2, eliminando efficacemente dalla fase gassosa. La variazione di volume di gas (diminuzione della pressione) è misurata dallo spostamento di liquido in un capillare di vetro attaccato alla respirometro chiuso.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri è il costo. Precedenti studi hanno misurato produzione di CO 2 da Drosophila utilizzando analizzatori di gas e sistemi di RESPIROMETRICO tecnicamente avanzati 1,9. Nonostante l'apparecchiatura più complessa, la sensibilità del metodo qui descritto è simile ai valori riportati (Tabella 1). Inoltre, diversi altri gruppi hanno utilizzato varianti di questa tecnica per determinare i tassi metabolici relativi in Drosophila 4-6. Pertanto, questo test può essere utilizzato per generare attendibilile, i dati riproducibili relativi al metabolismo Drosophila, senza l'acquisto di attrezzature specializzate che può essere installato in qualsiasi laboratorio e può essere utilizzato per scopi didattici.
In generale, le tecniche riconosciute per determinare il metabolismo di un organismo è misurare la CO 2 prodotta, l'O 2 consumato, o entrambi 3,4,9. Anche se, si può presumere che un equivalente di O 2 genera un equivalente di CO 2, il rapporto precisa del CO 2 generata dipende sul substrato metabolico utilizzato 10. Così, per determinare con precisione il tasso metabolico in energia è necessario misurare sia O 2 consumato e CO 2 prodotta. A causa di questo, il metodo qui descritto è specificamente rilevante per confrontare le differenze fra CO 2 produzione tra gli animali e non il valore assoluto. La nostra tecnica si integra aerei animale produzione di CO 2 per un periodo di time (1-2 ore) e quindi restituisce una media di attività degli animali. Se non vi è motivo di ritenere che gli animali sperimentali sono meno attivi rispetto agli animali di controllo la misura potrebbe riflettere i diversi livelli di attività e non necessariamente il metabolismo.
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Protocollo
1. Preparazione di Respirometri
- Tagliare la punta della pipetta 1.000 microlitri con una lametta per consentire l'inserimento del capillare micropipetta 50 pl, cercare di ottenere il puntale più diritta possibile.
- Posizionare un pezzo di schiuma nella pipetta e spingerla verso il basso nella punta della pipetta.
- Aggiungere una piccola quantità di CO 2 assorbente e contenere entro un secondo pezzo di schiuma.
- Applicare la colla nel luogo in cui la micropipetta viene inserito nella punta della pipetta.
- Lasciare il respirometro durante la notte per permettere la colla si asciughi.
Uno schema di un respirometro è mostrato nella Figura 1A.
2. Preparazione della camera di misura
- Preparare la soluzione da camera di miscelazione acqua con eosina in un rapporto che si tradurrà in colorazione visibile.
- Versare la soluzione eosina / acqua nella camera.
- Etichettare uno dei lati della camera con una scala centimetro.
3. Inserimento di mosche in Respirometri
- Etichettare le singole respirometri con un pennarello.
- Anestetizzare mosche utilizzando un metodo alternativo di CO 2 e posizionare 3-5 mosche del genotipo desiderato all'interno di ogni respirometro.
- Sigillare le respirometri saldamente in cima utilizzando plastilina stucco.
- Consentire mosche per recuperare da anestesia per circa 15 min.
- Preparare una respirometro senza linea, che sarà utilizzato come controllo atmosferica.
4. Esecuzione dell'esperimento
- Appendere le respirometri nella camera collegando un titolare Eppendorf da 1,5 ml tubo che è aperto nella parte superiore e la parte inferiore alla parte superiore della camera.
- Inserire respirometri con la punta micropipetta giù nella camera che la punta di immergersi nella soluzione colorata.
- Aggiungere vaselina tra il coperchio coperchio e camera per fornire l'isolamento forte dalla temperatura e pressione fluctuations.
- Chiudere il coperchio e lasciare il sistema si stabilizzi per 15 min.
- Prendere una fotografia della camera di fare in modo che il livello di liquido all'interno di ciascuna micropipetta è visibile e quindi è la scala (vedi esempio illustrato nella Figura 1B).
- Dopo 1-2 ore, scattare un'altra foto.
- Quando esperimento è finito, rimuovere le mosche dal respirometri e pesare se desiderato o il trasferimento di nuovo al flaconcino, se necessario ulteriormente.
5. Analisi dei risultati
- Apri immagini acquisite utilizzando il software ImageJ 11.
- Utilizzando la scala in ogni immagine, impostare la scalatura pixel nel software.
- Misurare la distanza (Δd) che il liquido ha viaggiato da un punto di riferimento determinato in immagini scattate all'inizio (d1) e alla fine dell'esperimento (d2). Un esempio schematico è mostrato nella Figura 1C.
- Calcolare la quantità di CO 2 prodotta (ml / h / volo) con la formula:
R = raggio del tubo micropipetta in centimetri
Δd = distanza il liquido è spostato nella micropipetta di campioni di prova misurata in centimetri
Δc = distanza il liquido è spostato nella micropipetta del campione di controllo negativo (senza linea)
n = numero di mosche utilizzati
h = ore
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Risultati
Al fine di dimostrare che il metodo è sensibile abbiamo misurato la produzione di CO 2 da wild type (Oregon R) maschile vola a 18, 25, e 29 ° C e vola mutante per Dg. Mosche sono state sollevate a 25 ° C e poi spostato alla temperatura sperimentale per 5 giorni prima della misura. Come previsto per questa specie ectotermi, la quantità di CO 2 prodotta aumentata con la temperatura (Figura 2). Abbiamo in passato dimostrato che una dieta priva di zucchero riduce il t...
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Discussione
In questo protocollo, si descrive un metodo poco costoso ed affidabile per misurare la produzione di CO 2 in mosche. Abbiamo trovato che questo esperimento è facile, rapida da condurre e genera dati riproducibile che è in accordo con altri studi 1, 6, 9. Il protocollo qui descritto può essere facilmente modificato per adattarsi bilancio e disponibili materiali di qualsiasi laboratorio. La costruzione di ogni singolo respirometro può essere adattato finché la camera rimane chiuso ermeticamente. Tutt...
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Max-Planck Society per finanziare la nostra ricerca.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BlauBrand IntraMark 50 µ l micropipette | VWR | 612-1413 | |
| Soda Lime | Wako | CDN6847 | |
| Eosina | Sigma | 031M4359 | È possibile utilizzare qualsiasi colorante in grado di creare una colorazione visibile del liquido Camera di |
| sviluppo per cromatografia su strato sottile (TLC) | VWR | 21432-761 | Qualsiasi camera in vetro trasparente che può essere chiusa con il coperchio |
| Anestesizzatore, Lull-A-Fly Kit | Flinn | FB1438 | |
| Power Gel Glue | Pritt | ||
| 1 ml puntali per pipetta | Qualsiasi | ||
| Schiuma | Qualsiasi | ||
| Stucco Plaesticine | Qualsiasi | ||
| Bisturi | Qualsiasi | ||
| Pinzetta | Qualsiasi |
Riferimenti
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Physiol. 97, 1915-1922 (2004).
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- van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Selected contribution: long-lived Drosophila melanogaster. lines exhibit normal metabolic rates. J Appl Physiol. 95, 2605-2613 (2003).
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- Khazaeli, A. A., Van Voorhies, W., Curtsinger, J. W. Longevity and metabolism in Drosophila melanogaster: genetic correlations between life span and age-specific metabolic rate in populations artificially selected for long life. Genetics. 169, 231-242 (2005).
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