Al fine di comprendere i meccanismi cellulari e molecolari alla base neotissue formazione e lo sviluppo di stenosi in ingegneria tessutale valvole cardiache, è stato sviluppato un modello murino di trapianto di valvole cardiache eterotopico. Una valvola cardiaca polmonare è stato trapiantato al destinatario utilizzando la tecnica di trapianto di cuore eterotopico.
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Articolo metodologico
Il trapianto di valvola polmonare Utilizzando un modello murino di trapianto cardiaco eterotopico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Valvole cardiache di ingegneria tessutale, valvole soprattutto decellularized, stanno iniziando a guadagnare slancio in uso clinico di chirurgia ricostruttiva con risultati alterni. Tuttavia, i meccanismi cellulari e molecolari dello sviluppo neotissue, ispessimento della valvola, e lo sviluppo stenosi non sono studiati estesamente. Per rispondere a queste domande, abbiamo sviluppato una valvola cardiaca modello murino di trapianto eterotopico. Una valvola cardiaca è stato raccolto da un topo donatore valvola e trapiantato in un topo donatore di cuore. Il cuore con una nuova valvola è stato trapiantato heterotopically ad un mouse destinatario. Il cuore trapiantato ha mostrato il proprio battito cardiaco, indipendente battito cardiaco del destinatario. Il flusso di sangue è stato quantificato usando un sistema a ultrasuoni ad alta frequenza con un Doppler pulsato. Il flusso attraverso la valvola polmonare impiantata mostrato flusso in avanti con rigurgito minimo e il picco di flusso era vicino a 100 mm / sec. Questo modello murino di trapianto di valvola cardiaca è highly versatile, in modo che possa essere modificato e adattato per fornire diversi ambienti emodinamici e / o può essere usato con vari topi transgenici per studiare lo sviluppo neotissue in una valvola cardiaca ingegneria tessutale.
Introduzione
Difetti cardiovascolari congenite sono una delle principali cause di mortalità infantile del 1,2 mondo occidentale. Tra questi, la stenosi valvolare polmonare e premolari difetti valvolari aortici sono una forma che si verificano di frequente 3. Intervento di sostituzione della valvola cardiaca è una scelta di routine di chirurgia ricostruttiva; Tuttavia, le complicanze, tra cui la stenosi e calcificazione della valvola cardiaca, e la dipendenza per tutta la vita su anticoagulanti sono una fonte significativa di malattie croniche e morte 4-7. Inoltre, la mancanza di potenziale di crescita richiede interventi di revisione, che aumenta ulteriormente la mortalità di questi pazienti giovani 4,8,9.
Nel tentativo di sviluppare una valvola cardiaca sostituzione funzionale con potenziale di crescita, le cellule autologhe seminati Shinoka et al. Su una valvola cardiaca sintetico biodegradabile 8. La valvola sintetico trasformato in una valvola cardiaca nativa come la struttura con la crescita potenziometroal. Preliminari studi su animali di grandi dimensioni hanno dimostrato la possibilità di utilizzare questa metodologia per creare una valvola cardiaca funzionale 10. Tuttavia, gli studi di impianto lungo termine hanno dimostrato scarsa durata a causa del progressivo ispessimento della neotissue valvola con conseguente restringimento della valvola cardiaca. Lavorare da Sodian et al. Utilizzata la metodologia Shinoka, ma alla fine sostituito matrice PGA con un elastomero biodegradabile, che ha le proprietà biomeccaniche della valvola di ingegneria tessutale costruire un profilo più fisiologico 9,11,12. Nello studio in vivo, nonostante il successo del l'impianto, un rivestimento delle cellule endoteliali confluenti non era formata che potrebbe limitare il successo a lungo termine di questo ponteggio 12.
Al fine di progettare razionalmente una migliore valvola cardiaca sintetico di seconda generazione, un modello murino di trapianto di valvole cardiache è stato creato per studiare i meccanismi cellulari e molecolari underlyinformazione g neotissue, ispessimento della valvola, e lo sviluppo di stenosi. Modelli murini offrono una vasta gamma di reagenti molecolari, tra cui transgenici, che non sono facilmente disponibili in altre specie 7. In questo cuore modello di trapianto di valvole, un ex vivo singenico sostituzione della valvola cardiaca polmonare è stata eseguita prima; e poi il cuore con la valvola cardiaca impiantato è stato impiantato heterotopically in un ospite singenici utilizzando una tecnica microchirurgica. Questo modello permette la sostituzione della valvola cardiaca senza la necessità di bypass cardiopolmonare.
In questo lavoro, una spiegazione dettagliata di un raccolto valvola cardiaca, preparazioni cuore del donatore, il trapianto di valvole cardiache, e il trapianto di cuore eterotopico è descritto. I risultati hanno mostrato un battito cardiaco continuo dal cuore del donatore, che era indipendente dal battito cardiaco destinatario. Il flusso sanguigno attraverso la valvola polmonare impiantato è stata misurata usando un sistema a ultrasuoni ad alta frequenza con onda pulsata Fareppler.
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Protocollo
Nota: Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dalla Hospital Institutional Animal Care ed uso Comitato dei Bambini di Nationwide.
1. Polmonare valvola cardiaca raccolta da un donatore Valvola cardiaca mouse
- Sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici prima della chirurgia: 1x forbici sottili, 3x micro pinze, pinze vascolari micro 2x, 1x morsetto pinze applicano, porta-aghi micro 1x, forbici primavera 1x, 1x divaricatore.
- A 6-8 settimane di età femmina C57BL / 6 mouse viene utilizzato come donatore valvola cardiaca polmonare. Rimuovere il mouse dalla gabbia e si pesa, poi eutanasia con un cocktail di ketamina / xylazina (ketamina, 200 mg / kg e xylazina, 20 mg / kg, IP) overdose.
- Agganciare la zona del torace e posizionare il mouse in una posizione prona dorsale su un taccuino. Poi fare la toracotomia. Esporre il cuore, fare un piccolo taglio sul atrio destro e profumato il ventricolo sinistro con ghiaccio soluzione fisiologica fredda.
- Senza mezzi termini sezionare l'arteria polmonare (PA) dal crescente unorta. Tagliare la valvola polmonare (PV) insieme a due millimetri bracciale dell'arteria polmonare. Smaltire il resto del cuore.
- Conservare il fotovoltaico in soluzione salina (100 unità / ml) di eparina freddo e. Nota: Il PV può essere mantenuto in soluzione per due ore prima del trapianto verso il cuore del donatore.
2. Preparazione donatore di cuore
- A 6-8 settimane di età femmina C57BL / 6 mouse viene utilizzato come un donatore di cuore. Rimuovere il mouse dalla gabbia e si pesa, poi eutanasia con un cocktail di ketamina / xylazina (ketamina, 200 mg / kg e xylazina, 20 mg / kg, IP) overdose. Questa è una procedura terminale.
- Agganciare la zona del torace e posizionare il mouse in una posizione prona dorsale su un taccuino. Poi fare la toracotomia. Senza mezzi termini separare il cuore, vena cava inferiore (IVC), vena cava superiore (SVC), dell'aorta ascendente, PA, e la vena polmonare. Profumato l'IVC con il freddo ghiaccio soluzione salina sterile.
- Legare l'IVC, SVC, e vena polmonare con 6-0 sutura di seta poi tagliare superiore allegature.
- Tagliare l'aorta e PA 2 mm bracciale.
- Tagliare il PV e smaltirlo.
3. Valvola cardiaca trapianto su un donatore di cuore
- Subito dopo la fase 2.5, posizionare la valvola cardiaca dal punto 1.5 nel cuore del donatore e orientare la valvola cardiaca.
- Fissare la PV con un punto sul lato destro della valvola attraverso 10-0 monofilamento sugli aghi conici e inizia a suturare continuamente con 5-6 stiches dall'altro lato del PV.
- Dopo aver terminato il lato anteriore, ruotare cuore orizzontalmente e iniziare a suturare il lato posteriore del PV sul cuore del donatore.
- Conservare il cuore in una soluzione fredda di eparina / soluzione salina sterile. Nota: Il cuore del donatore può essere mantenuto in soluzione per due ore prima dell'impianto per il mouse destinatario.
4. Eterotopico trapianto cardiaco a un destinatario mouse
- A 6-8 settimane di età femmina C57BL / 6 topo è stato usato come un recipient. Rimuovere il mouse dalla gabbia e si pesa, poi anestetizzati con cocktail di ketamina / xilazina (ketamina, 100 mg / kg e xilazina 10 mg / kg). Ketoprofene (5 mg / kg) è usato come preanesthesia analgesico.
- Dopo aver verificato il livello di sedazione per coda pizzicare, tagliare il addominale e peli del torace. Lubrificare gli occhi con pomata oftalmica sterile, e posizionare il mouse in una posizione prona dorsale su un taccuino. Disinfettare l'addome con Betadine e alcool pastiglie. Poi coprire il mouse con un telino sterile ed esporre solo la zona di incisione.
- Effettuare una laparotomia mediana incisione da sotto la xifoidea alla regione sovrapubica, e inserire un divaricatore auto ritegno. Avvolgere l'intestino in soluzione salina inumidito garza. Senza mezzi termini definire l'aorta sottorenale e la vena cava.
- Inserire due 6-0 punti di sutura in seta prossimale e distale attorno alla aorta e IVC per limitare la circolazione del sangue.
- Posizionare il cuore del donatore sul lato destro dell'aorta addominale e coprire con gau sterileze. Idratare con soluzione fisiologica.
- Effettuare una aortotomy nell'aorta addominale utilizzando un ago G 30 ed estendere l'apertura con le forbici alle dimensioni dell'aorta donatore.
- Eseguire un end-to side anastomosi con sterili suture monofilamento 10-0 sugli aghi conici. Fissare l'aorta donatore con un punto sull'estremità prossimale dell'apertura nell'aorta addominale e inizia a suturare continuamente con 4-5 stiches dall'estremità distale dell'aorta addominale.
- Capovolgere il cuore a sinistra, coprire con garza salina infusa e iniziare a suturare continuamente con 4-5 stiches dall'estremità distale dell'aorta addominale.
- Effettuare una venotomia nella IVC usando un ago G 30 ed estendere l'apertura alla dimensione dell'arteria polmonare donatore.
- Eseguire la fine anastomosi lato utilizzando sterili suture monofilamento 10-0 sugli aghi conici. Fissare il donatore PA con un punto sull'estremità prossimale dell'apertura nella IVC e inizia a suturare continuamente con 4-5 stiches dal'estremità distale della vena cava inferiore. Questa volta, perché l'aorta è nel senso, si assicura la sutura della parete sinistra della PA del donatore è all'interno della IVC.
- Lavare lume IVC con eparina e soluzione salina (100 unità / ml). Chiudere la parete destra del donatore e del ricevente PA IVC suturando loro continuamente all'estremità distale.
- Togliere la legatura distale e controllare l'emorragia applicando una topica agente emostatico sterile riassorbibile. Quando l'emorragia si arresta completamente, rimuovere la sutura prossimale e controllare l'emorragia allo stesso modo.
- Ritorno intestini e chiudere la muscolatura addominale e la pelle in due strati con un 6-0 nero poliammide monofilamento di sutura.
- Iniettare 0,5 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea e posizionare il mouse in una gabbia di recupero su un rilievo di riscaldamento fino a quando il mouse è completamente mobile. Al momento del recupero, ritorno il mouse in una nuova gabbia con biancheria da letto di carta. Dare farmaci antidolorifici (ibuprofene, 30 mg / kg, acqua potabile) per 48 ore. FareNon restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
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Risultati
La Figura 1 illustra gli schemi della valvola modello di trapianto di cuore con trapianto di cuore eterotopico. La valvola cardiaca è stato raccolto da un donatore e impiantato su un cuore da un secondo mouse donatore. Poi il cuore con la nuova valvola cardiaca è stato impiantato all'addome di un mouse destinatario. Figura 2 mostra una illustrazione del cuore impiantato nello spazio addominale (A), subito dopo trapianto cardiaco (B), e 5 minuti dopo...
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Discussione
Il tasso di mortalità di questa procedura è vicino al 20%, che è stato causato principalmente da emorragia nel sito di trapianto PV e anastomosi sull'aorta donatore all'aorta addominale destinatario. Nella maggior parte dei casi, il tasso di mortalità diminuisce significativamente chirurgia 48 hr postale. I topi hanno mostrato di sopravvivenza cuore batte forte e il flusso di sangue attraverso il fotovoltaico impiantato. L'intero processo dura quattro ore per una micro chirurgo esperto. Ci vorranno circa 250...
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto, in parte, da una sovvenzione del NIH (RO1 HL098228) per CKB.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Microscopio | Leica | M80 | |
| C57BL/6J (H-2b), Femmina | Jackson Laboratories | 664 | 8-12 settimane |
| Iniezione di ketamina cloridrato | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Soluzione sterile di xilazina | Akorn Inc. | NADA# 139-236 | |
| Ketoprofene | Fort Dodge Salute degli animali | NDC 0856-4396-01 | |
| Ibuprofene | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Eparina | Sodio Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | |
| Soluzione salina (sterile 0,9% cloruro di sodio) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9% | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Unguento oftalmico petrolato | Dechra Prodotti veterinari | NDC 17033-211-38 | |
| Pastiglie per la preparazione dello iodio | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Tamponi per la preparazione dell'alcol | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Applicatori con punta in cotone | Fisher Sientific | 23-400-118 | |
| Forbice fine | FST | 14028-10 | |
| Forcipe Micro-Adson FST | 11018-12 | ||
| Pinza per applicazione morsetto | FST | 00072-14 | |
| S & T Morsetto Vascolare | FST | 00396-01 | |
| Forbici a molla | FST | 15008-08 | |
| Divaricatori Colibri | FST | 17000-04 | |
| Dumont #5 Pinza | FST | 11251-20 | |
| Dumont #7 - Pinza fine | FST | 11274-20 | |
| Dumont #5/45 Pinza | FST | 11251-35 | |
| Tish Porta aghi / Pinze | Micrins | MI1540 | |
| Sutura monofilamento in poliammide nera, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | Per suturare l'innesto |
| Sutura monofilamento in poliammide nera, 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | Per la muscolatura e la chiusura della pelle |
| Spugne non tessute | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Emostatico assorbibile | Ethicon | 1961 | |
| Siringa da 1 ml | BD | 309659 | |
| Siringa da 3 ml | BD | 309657 | |
| Siringa da 10 ml | BD | 309604 | |
| 18 G 1 1/2 pollici, Ago | BD | 305190 | |
| 25 G 1 pollici, Ago | BD | 305125 | |
| 30 G 1 pollici, Ago | BD | 305106 | |
| Ricircolatore d'acqua calda | Gaymar | TP-700 | |
| Cuscinetto riscaldante | Gaymar | TP-22G | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| VEVO2100 Ultrasuoni ad alta frequenza | VisualSonics | http://www.visualsonics.com/vevo2100 | Il numero di catalogo e il prezzo possono essere acquistati dai rappresentanti di vendita. |
| gel per trasmissione di ultrasuoni | Parker Laboratories, INC. | 01-02 | |
| Sistema di anestesia animale da laboratorio da tavolo | VetEquip, INC. | ||
| Isoflurano | Baxter | 1001936060 |
Riferimenti
- Polito, A., et al. Increased morbidity and mortality in very preterm VLBW infants with congenital heart disease. Intens Care Med. 39, 1104-1112 (2013).
- Wren, C., Reinhardt, Z., Khawaja, K. Twenty year trends in diagnosis of life threatening neonatal cardiovascular malformations. Arch Dis Child Fetal. 93, F33-F35 (2008).
- Vacanti, J. P. Beyond transplantation Third annual Samuel Jason Mixter lecture. Archives of surgery. 123, Chicago Ill. 545-549 (1960).
- Tudorache, I., et al. Orthotopic replacement of aortic heart valves with tissue-engineered grafts. Tissue engineering Part A. 19, 1686-1694 (2013).
- van Geldorp, M. W., et al. Patient outcome after aortic valve replacement with a mechanical or biological prosthesis weighing lifetime anticoagulant related event risk against reoperation risk. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 137, 881-886 (2009).
- El Oakley, R., Kleine, P., Bach, D. S. Choice of prosthetic heart valve in today's practice. Circulation. 117, 253-256 (2008).
- Quinn, R. W. Animal Models for Bench to Bedside Translation of Regenerative Cardiac Constructs. Progress in Pediatric cardiology. 35, (2013).
- Shinoka, T., et al. Tissue engineering heart valves valve leaflet replacement study in a lamb model. The Annals of thoracic surgery. 60, S513-S516 (1995).
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- Shinoka, T., et al. Tissue engineered heart valves. Autologous valve leaflet replacement study in a lamb model. Circulation. 94, II164-II168 (1996).
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- Sodian, R., et al. Early in vivo experience with tissue-engineered trileaflet heart valves). Circulation. 102, III22-III29 (2000).
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