Articolo metodologico

Concentrarsi Formazione: Un test cellulare per determinare il potenziale oncogeno di un gene

DOI:

10.3791/51742

⸱

31 dicembre 2014

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University of California, Davis

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il saggio Formazione Focus fornisce un metodo semplice per valutare il potenziale di trasformare un oncogene candidato.

Abstract

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La trasformazione maligna delle cellule è tipicamente associata a un aumento della proliferazione, alla perdita dell'inibizione del contatto, all'acquisizione di un potenziale di crescita indipendente dall'ancoraggio e alla capacità di formare tumori negli animali da esperimento1. Nelle cellule NIH 3T3, la via di trasduzione del segnale Ras è nota per innescare molti di questi eventi, ciò che è noto come trasformazione Ras. L'introduzione di un gene sovraespresso nelle cellule NIH 3T3 può promuovere la trasformazione morfologica e la perdita di inibizione del contatto, che può aiutare a determinare il potenziale oncogenico di quel gene di interesse. Un test che fornisce un metodo semplice per valutare un aspetto del potenziale di trasformazione di un oncogene è il Focus Formation Assay (FFA)2. Quando le cellule NIH 3T3 si dividono normalmente in coltura, lo fanno fino a raggiungere un monostrato confluente. Tuttavia, in presenza di un oncogene sovraespresso, queste cellule possono iniziare a crescere in focolai1 densi e multistrato che possono essere visualizzati e quantificati mediante colorazione con cristallovioletto o Hema 3. In questo articolo descriviamo il protocollo FFA con trasduzione retrovirale del gene di interesse in cellule NIH 3T3 e come quantificare il numero di focolai attraverso la colorazione. La trasduzione retrovirale offre un metodo più efficiente di consegna genica rispetto alla trasfezione e l'uso di un retrovirus murino ecotropo fornisce un controllo di biosicurezza quando si lavora con potenziali oncogeni umani.

Introduzione

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Le cellule tumorali possono essere distinti dalle loro controparti normali da una vasta gamma di alterazioni, dai modelli di espressione genica per epigenomica ai cambiamenti morfologici e proliferativi. Tra questi ultimi, ridotta dipendenza da siero, perdita di contatto (densità) inibizione, l'acquisizione della proliferazione di ancoraggio-indipendente e, in ultima analisi, la capacità di formare tumori quando iniettate in animali sono utili, indicatori misurabili di trasformazione maligna 3. Diversi in vitro e in vivo sono stati sviluppati per la trasformazione cellulare. In vitro mirare a individuare e cambiamenti nella cultura morfologia (attenzione test formazione), la dinamica della cultura (il tasso di crescita, la densità di saturazione) e fattore di crescita di misura (la crescita nel siero ridotta) o ancoraggio (crescita in soft agar) esigenze. Il gold standard per determinare la natura maligna di un tipo di cellula rimane la formazione di tumori (xenotrapianti) negli animali da esperimento. Tuttavia, tl costo e la durata degli studi in vivo non sempre li rendono giustificabile in una prima fase di validazione o proiezione di oncogeni candidati. Anche se nessun test in vitro fornisce una valutazione definitiva del potenziale oncogeno di un gene, essi forniscono informazioni in potenziale oncogeno che potrebbero restringere futuro studi in vivo. Uno dei sistemi più utilizzati per valutare il potenziale oncogeno in vitro è al centro di Formazione Assay 2. Questo approccio si basa sull'uso di NIH 3T3 fibroblasti di topo, una linea cellulare non trasformato che mostra forte inibizione contatto. Sovraespressione di un oncogene si traduce in perdita di crescita di densità-dipendente; cellule trasformate possono crescere in strati multipli, formando "fuochi", facilmente visualizzato sullo sfondo monostrato di cellule non trasformate. La formazione fuoco Assay, poi, misura la capacità di un oncogene candidato per indurre la trasformazione maligna, come dimostra la perdita di contatto inibition come un fenotipo misurabile. L'FFA è stato utilizzato per valutare la trasformazione da sovraespressione di proteine ​​chinasi (ad esempio, Src 4, BRAF 5), fattori di trascrizione (ad esempio, N-myc 6) recettori, G-accoppiati alle proteine ​​(ad esempio, P2RY8 7) e GTPases (ad esempio, , Ras 1), tra gli altri. La relativa facilità di questo saggio rende una buona scelta che fornirà una risposta rapida e visivamente chiaro se sovraespressione del gene è sufficiente per trasformare cellule di fibroblasti di topo NIH 3T3 in vitro.

L'FFA descritto in questo protocollo utilizza la linea cellulare di confezionamento Plat-E 8, che fornisce proteine ​​virali di imballaggio, e il vettore retrovirale pBABEpuro 9 (Addgene plasmide 1764) per la produzione di retrovirus. Dopo trasfezione con il costrutto pBABEpuro contenente il gene di interesse, la linea cellulare Plat-E produrrà retrovirus ecotropic che può essere utilizzato per infettare cellule NIH 3T3. Til suo metodo virale di consegna del gene è più efficiente rispetto ai metodi di trasfezione chimici tradizionali e offre un modo per esprimere in modo sostenibile il gene 10. Una volta inseriti nel genoma delle cellule NIH 3T3, sovraespressione del gene di interesse è guidato dalla lunghe ripetizioni terminali virali (LTR) promotore 11. Questa costante espressione può essere usato per determinare se il gene di interesse ha attività oncogenica, come misurato dalla formazione di foci, sulle cellule NIH 3T3.

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Protocollo

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1. Rendere i vettori virali

Le sequenze codificanti per il gene di interesse, così come i controlli positivi e negativi, sono inseriti in pBABEpuro con metodi tradizionali di clonazione (amplificazione PCR, digestione di restrizione e legatura). Ci sono quattro siti di restrizione sul vettore in cui il DNA può essere inserito: BamHI, SnaBI, EcoRI e Sali.

  1. Preparare trasfezione-grade plasmide DNA dalle cellule competenti mediante il kit plasmide midi QIAGEN.
  2. Misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop2000.

2. Retrovirus Produzione

La linea cellulare di packaging Plat-E sarà utilizzato per produrre retrovirus ecotropic che porterà il cDNA di interesse per cellule NIH 3T3.

  1. Stabilire Plat-E culture di cellule congelate
    1. Scongelare rapidamente cellule Plat-E in un bagno d'acqua ° C 37 e trasferire in una provetta da 15 ml. Lentamente aggiungere 9 ml di Plat-E medio (Dudi lbecco modificato (DMEM) + 10% siero fetale bovino (FBS) + penicillina e streptomicina).
    2. Centrifugare la provetta a 180 x g per 5 minuti e scartare il surnatante.
    3. Risospendere le cellule con 10 ml di Plat-E a medio e trasferimento in un piatto di cultura 10 cm.
    4. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore fino a quando sono 80-90% confluenti (circa 2 giorni).
  2. Splitting cellulare
    1. Aspirare il medio e lavare le cellule una volta con PBS.
    2. Aggiungere 2 ml di 0,05% tripsina-EDTA e incubare per 1 min a RT.
    3. Staccare le cellule finger tapping, aggiungere 10 ml di Plat-E di media, e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml.
    4. Centrifugare la provetta a 180 x g per 5 minuti e scartare il surnatante.
    5. Risospendere le cellule con 10 ml di Plat-E a medio e sementi in nuovi piatti a 1: 4-1: 6 diluizioni.
  3. Plat-E Seeding e Transfection
    1. Seed 2 x 10 6cellule per 10 centimetri piatto di coltura usando Plat-E medio senza antibiotici.
    2. Incubare le cellule O / N a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
    3. Il giorno dopo, il trasferimento di 300 ml di Opti-MEM in 1,5 ml provetta da microcentrifuga.
    4. Aggiungere 27 ml di polyethylenimine (PEI), un costo-efficacia di trasfezione reattivo 12, al tubo preparato con Opti-MEM. Mescolare delicatamente con le dita toccando e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
    5. Aggiungere 9 mg di trasfezione-grade plasmide DNA nel tubo Opti-MEM / PEI, mescolare delicatamente con il vortex e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
    6. Aggiungere il DNA / PEI goccia a goccia complesso nel piatto Plat-E, e incubare O / N a 37 ° C, 5% CO 2.
    7. Il giorno dopo, aspirare il supporto contenente il reagente di trasfezione e aggiungere 10 ml di fresco medio Plat-E (senza antibiotici).
    8. Riportare le cellule per l'incubatore.

3. Cellule NIH 3T3 e infezioni

  1. Stabilire NIHCulture 3T3 e il seeding
    1. Scongelare rapidamente cellule NIH 3T3 in ° C bagnomaria 37 e trasferire in una provetta da 15 ml. Aggiungere lentamente 9 ml di NIH 3T3 medium (DMEM + 10% FBS).
    2. Centrifugare la provetta a 180 x g per 5 minuti e scartare il surnatante.
    3. Risospendere le cellule con 10 ml di NIH 3T3 media e il trasferimento ad un piatto di cultura 10 cm.
    4. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. È molto importante che le cellule NIH 3T3 sono sempre tenute underconfluent (50-60%), la frequenza di trasformazione spontanea (e quindi i livelli basali di formazione foci) aumenta una volta coltura raggiunga confluenza.
    5. Seed 3 x 10 5 cellule per 10 centimetri piatto e incubare O / N per l'infezione il giorno successivo.
  2. Infezione
    1. Raccogliere il supernatante retrovirale dal piatto Plat-E utilizzando una siringa monouso 10 ml, filtrare attraverso un filtro a membrana di nylon dimensioni 0,45 micron pori, e trasferirlo in un 15 mltube.
    2. Aggiungere 10 ml di fresco medio Plat-E per le cellule (senza antibiotici), e restituirli alla incubatrice.
    3. Aspirare il supporto dal piatto delle cellule NIH 3T3 di essere infetti, e aggiungere 5 ml di regolare medie NIH 3T3 e 5 ml di virus contenenti surnatante filtrato.
    4. Aggiungere polibrene al piatto ad una concentrazione di 6 mg / ml.
    5. Incubare le cellule O / N a 37 ° C, 5% CO 2.
    6. Il giorno dopo, ripetere i punti 3.2.1 - 3.2.5 per un secondo turno di infezione.
    7. Sostituire il supporto contenente il virus, con regolare medio NIH 3T3.
    8. Lasciare le cellule NIH 3T3 a crescere per 2-3 settimane, sostituendo la soluzione, se necessario. Controllare espressione della proteina di interesse mediante elettroforesi delle proteine ​​convenzionale e immunoblot su lisati cellulari interi da lastre di replica.

4. Colorazione e quantificazione

  1. Cristallo viola colorazione
    1. Aspirare il mezzo di NIH 3T3 e posizionare i piattisul ghiaccio.
    2. Lavare i piatti due volte con PBS freddo.
    3. Fissare le cellule con metanolo ghiacciata per 10 min.
    4. Togliere i piatti da ghiaccio, aspirare il metanolo, e aggiungere 3 ml di soluzione di cristallo viola 0,5% effettuati nel 25% di metanolo (RT).
    5. Incubare i piatti per 5 minuti a RT.
    6. Aspirare la soluzione a cristalli viola e risciacquare accuratamente il piatto con Milli-Q H 2 O fino a quando nessun colore si stacca nel risciacquo.
    7. Lasciare i piatti asciugare O / N su un banco (scoperto).
  2. Foci Quantificazione
    1. Una volta che i piatti sono asciutti, utilizzare un righello per misurare le collezioni di colore scuro di cellule sulla piastra. Contano solo quelli che sono più di 5 mm di diametro come "focolai". Registrare il numero di focolai e calcolare le medie e il significato rispetto ai controlli.

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Risultati

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MXD3 è un fattore fondamentale cerniera elica-ansa-elica leucina (bHLHZ) di trascrizione che è un membro del MYC / MAX / network MAD. Si tratta di un atipico membro della famiglia MAD 13-15, ed è stato segnalato per essere coinvolti nella carcinogenesi 16,17. Rispetto al pBABEpuro (controllo negativo) e MYC (controllo positivo), i piatti NIH 3T3 dove era sovraespresso MXD3 era significativamente inferiore foci (Figura 1A). I dati della figura 1B sono stati raccolti...

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Discussione

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La FFA fornisce un metodo semplice e veloce per valutare trasformazione maligna in vitro. E 'suscettibile di proiezione di un numero relativamente elevato di geni candidati, e le sue esigenze tecniche modeste rendono conveniente. Inoltre, due o più geni possono essere coexpressed (talvolta indicato come un saggio "cooperazione") per valutare il potenziale cancerogeno della combinazione. I vantaggi di questo test si basano sulla sua tecnica semplice, la facilità di quantificazione e la sua relativa...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da New Innovator Award Program del direttore NIH (ED). AA è stato sostenuto in parte da premi di laurea dal National Cancer Institute e la National Science Foundation.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
vettore pBABE-puro AddgenePlasmid 1764di clonazione
cellulare di imballaggio retrovirale Platino-E, EcotropicCell Biolabs, Inc.RV-101per la produzione virale
Linea cellulare NIH 3T3 linea cellulare murinaSigma-Aldrich93061524per il saggio di formazione del fuoco
Siringa con punta BD Luer-Lok da 10 mlBiosciences309604reagente per la produzione virale
0,45 μ m Filtro per siringa PuradiscWhatman6750-2504reagente per la produzione virale
Polietilenimmina (PEI)Polysciences, Inc.23966-2reagente per trasfezione cellulare
Polybrene Infezione / reagente per trasfezione di polibreneEMD MilliporeTR-1003-Greagente per trasfezione cellulare
Crystal VioletFisher ScientificC581-25reagente per colorazione cellulare
Plasmid Plus Midi KitQIAGEN12945Purificazione plasmidico
BD Falcon Piastre per colture tissutaliBD Biosciences353003forniture per colture cellulari
Terreno di coltura cellulare Dulbecco's Modified Eagle (DMEM)Terreno di coltura cellulareGibco11995-065
0,05% Tripsina-EDTAGibco25300-054forniture per colture cellulari
Opti-MEM I Terreno di coltura a siero ridottoGibco31985-062Terreno di coltura cellulare
Fetale Bovino (FBS)Terreno di coltura cellulareGibco16000-044
vettore Linea Linea cellulare BD

Riferimenti

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  1. Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. Biological assays for Ras transformation. Methods in enzymology. , 255-395 (1995).
  2. Celis, J. E. Cell biology : a laboratory handbook. , 3rd edn, Elsevier Academic. 345-352 (2006).
  3. Raptis, L., Vultur, A. Neoplastic transformation assays. Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).
  4. Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells. Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).
  5. Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene. IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).
  6. Yancopoulos, G. D., et al. N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).
  7. Fujiwara, S., et al. Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening. Leukemia & lymphoma. 48, 978-986 (2007).
  8. Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene. 7, 1063-1066 (2000).
  9. Morgenstern, J. P., Land, H. Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line. Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).
  10. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
  11. Klaver, B., Berkhout, B. Comparison of 5' and 3' long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus. Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).
  12. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).
  13. Fox, E. J., Wright, S. C. S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells. The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).
  14. Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation. Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).
  15. Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression. Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).
  16. Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3. Cell cycle. 7, 423-427 (2008).
  17. Barisone, G. A., et al. Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells. PloS One. 7, e38508(2012).
  18. Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112, 193-205 (2003).

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