Cultura primario di topo neuroni dopaminergici

La dopamina, uno dei neurotrasmettitori cerebrali essenziali ^1,2, viene rilasciato principalmente dal mesencefalo dopaminergici (DA) neuroni. La maggior parte dei neuroni dopaminergici risiedono nella parte ventrale del mesencefalo ^2-6. Schematicamente, mesencefalo neuroni DA possono essere divise in tre anatomicamente e funzionalmente distinti sistemi di proiezione: mesostriatal, mesolimbico, e percorsi mesocorticali ^2,5. Il sistema nigrostriatale è coinvolta nel comportamento motorio, i percorsi mesolimbico svolgono un ruolo importante nel rinforzo, la motivazione e l'apprendimento, mentre le vie dopaminergiche che proiettano alla corteccia prefrontale sono implicati nella cognizione ^2.

Neuroni DA sono coinvolti in diverse patologie neurologiche umane come la schizofrenia, deficit di attenzione, disturbi iper attività, e la malattia di Parkinson (PD) ^2,4. PD è caratterizzata da una degenerazione progressiva e selettiva di neuroni DA collegamento substantia nigrapars compacta (SNC) al corpo striato. La perdita di Nigro-striatale DA neuroni provoca una grave deplezione di dopamina nello striato che è responsabile dei sintomi motori della malattia di Parkinson (bradicinesia, tremore a riposo, rigidità e) ^7. La causa iniziale del PD idiopatica non è stata stabilita e gli attuali trattamenti sono solo sintomatica, che mira a ripristinare il livello di dopamina nello striato. Il farmaco più prescritto è L-Dopa (levodopa), il precursore naturale della dopamina. Anche se la somministrazione di Levodopa compensa la perdita di dopamina per un certo tempo, le complicanze motorie si verificano dopo i trattamenti a lungo termine (discinesia e stati on / off) ^8,9.

La ricerca sui neuroni dopaminergici e PD è in costante progressione e intensi sforzi sono stati fatti per sviluppare trattamenti basati sul trapianto di cellule, la terapia genica, o agenti neuroprotettivi ^10,11. Tuttavia, una questione importante rimane non chiarita: qual è la causa della estrema vulnerabilità di neuroni DA? Parte della risposta può essere trovata nella attività dei neuroni DA. Una riduzione dell'attività elettrica e della eccitabilità di neuroni dopaminergici sembra aumentare la loro propensione a degenerare ^12. Tuttavia, la complessità del PD patogenesi richiede ulteriori studi per identificare i meccanismi coinvolti nella degenerazione dei neuroni DA ^13-15.

Colture primarie sono particolarmente rilevanti per studiare le proprietà dei neuroni DA ^16-19 e di sfidare questi neuroni a varie sollecitazioni per la valutazione degli agenti neuroprotettivi ^20-24. Modelli di coltura Rat sono più spesso utilizzati, come la dissezione di ratto dell'embrione mesencefalo è più facile, in confronto con il mouse, e una maggiore quantità di neuroni possono essere ottenuti nel ratto. Tuttavia, la generazione di modelli transgenici murini di malattia ²⁵ ha notevolmente aumentato l'interesse della comunità neuroscienziato per colture primarie dal mouse ^26-29. Anche se le culture prepared da animali neonati può essere utilizzato, è meglio prepararli da embrioni allo stadio post-mitotico (E13.5 per i neuroni mesencefalo), quando i neuroni hanno conservato la loro capacità di differenziarsi. Il protocollo che segue presenta isolate mesencefalo neuroni in coltura primaria da embrioni di topo (E13.5), che sono i più difficili da preparare. In particolare, forniamo un protocollo con terreno privo di siero cultura per una migliore riproducibilità. Le due fasi più critiche in preparazione culturale (dissezione e dissociazione meccanica) saranno accuratamente dettagliati nel video associato.

I topi utilizzati in questo lavoro sono stati curati e trattati in conformità con le linee guida del Consiglio dell'Unione europea (86/609 / UE) per l'uso di animali da laboratorio.

1 Preparazione delle soluzioni necessarie

1. Soluzioni Immagini
   1. 10x Poly-L-Ornitina (OLP) Soluzione: pesare 10 mg di PLO bromidrato (peso molecolare = 30,000-70,000) e sciogliere in 70 ml di acqua sterile. Filtrare la soluzione con 0,2 micron filtro a siringa, aliquote, e conservare a -20 ° C.
   2. 30% di soluzione di glucosio: pesare 30 g di D (+) - Glucosio e sciogliere in acqua sterile fino ad un volume totale di 100 ml. Filter, aliquote e conservare a 4 ° C.
   3. Modified mezzo di Eagle di 5x Dulbecco (DMEM) / Nutrient Mixture F-12 Ham: pesare 6 g di polvere DMEM / F-12 Prosciutto e sciogliere in acqua sterile fino ad un volume totale di 100 ml. Filter, aliquote e conservare a 4 ° C.
   4. 7,5% Bicarbonato di sodio _(NaHCO3) Solution: pesare 7,5 g di _NaHCO3 e sciogliere in acqua sterile fino ad un volume totale di 100 ml. Filter, aliquote e conservare a 4 ° C.
   5. 1 M HEPES Soluzione: Pesare 23,8 g di HEPES e sciogliere in acqua sterile fino ad un volume totale di 100 ml. Filter, aliquote e conservare a 4 ° C.
   6. 70% (v / v) etanolo: Diluire 70 ml di etanolo assoluto con 30 ml di acqua sterile.
2. Tampone fosfato isotonico con glucosio e antibiotici (PBS-GAB): aggiungere 10 ml di soluzione di glucosio al 30% e 5 ml di soluzione di penicillina-streptomicina a 500 ml di Dulbecco Phosphate Buffered Saline. Conservare a 4 ° C.
3. Inattivato siero fetale bovino (IFB): Scongelare siero bovino notte a 4 ° C e inattivare a 56 ° C per 30 min. Aliquota in 50 ml e conservare a -20 ° C.
4. Cultura Media: In acqua sterile, mescolare successivamente 40 ml di DMEM 5x / F12-Ham, 1 ml di 1 M HEPES, 2 ml di 200 mM L-glutammina, 2 ml di penicillina-streptomicina, 4 ml di 30% di glucosio unnd 3 ml di 7,5% _NaHCO3 ad un volume finale di 180 ml. Filtrare e utilizzare lo stesso giorno.
5. Ormone Mix
   1. Preparare 180 ml di terreno di coltura. Sciogliere 200 mg di apo-transferrina in questo mezzo.
   2. Pesare 50 mg di insulina e sciogliere in 2 ml di HCl 0,1 M. Aggiungere lentamente 8 ml di acqua sterile mentre mescolando delicatamente. Diluire la soluzione nel mezzo di coltura.
   3. Pesare 19,3 mg di putrescina dicloridrato e sciogliere in 10 ml di acqua sterile. Aggiungere la soluzione alla miscela ormone 10 ml.
   4. Preparare una soluzione di selenito di sodio 3 mM in acqua sterile e una soluzione di progesterone 2 mM in etanolo assoluto. Aggiungere 20 ml di ciascuna soluzione al mix ormonale.
   5. Filtrare il mix di ormoni, un'aliquota in 10 ml e conservare a -20 ° C.

2 Preparazione di piastre di coltura e strumenti

1. FBS rivestimento delle piastre di coltura: Il giorno prima della dissezione, preparare 180 ml di terreno di coltura. Aggiungere 10 ml diIFB a 90 ml di mezzo di coltura. Aggiungere 300 ml / pozzetto di terreno di coltura / 10% IFB in piastre da 24 pozzetti poli-D-lisina pretrattata. Incubare per una notte a 37 ° C. Conservare i supporti rimanenti (con e senza IFB) a 4 ° C.
2. Sterilizzare gli strumenti e le pipette Pasteur. Raccogliere le attrezzature elencate nella tabella dei materiali così come una cappa di classe II a flusso laminare e un incubatore CO _2.

3. Dissezione di mouse mesencefalo

1. Sacrifica un E13.5 il mouse in stato di gravidanza (secondo le linee guida istituzionali). Pulire l'addome del mouse con il 70% di etanolo e aprire la parete addominale. Raccogliere le corna uterine, aprirli utilizzando le forbici delicati, sezionare ogni embrione dalle corna uterine, e rimuovere le membrane amniotiche. Mettere gli embrioni in una capsula di Petri 100 millimetri contenente PBS sterile-GAB e lavarli con bonifico in 3 bagni identici consecutivi con pinze. Per la dissezione, collocare gli embrioni da 3 in una capsula di Petri sterile 60 mm.
2. Movvia e il piatto finale Petri allo stereomicroscopio. Non decapitare gli embrioni. Utilizzando le forbici Vännäs, asportare il cervello.
   1. Rimuovere con cautela e scartare le regioni anteriori e romboencefalo. A lato rostrale, tagliare vicino alla regione del talamo, al taglio laterale caudale in corrispondenza della zona istmo, rimuovere il collicolo superiore.
   2. Una volta che il mesencefalo ventrale è isolato, rimuovere con cautela le meningi con una pinza ultra fine. Raccogliere i segmenti sezionati, senza le meningi, in una provetta sterile da 13 ml riempito con PBS-GAB.
3. Pulire accuratamente il tubo contenente il mesencephala con il 70% di etanolo e portarla sotto il cofano.

Dissociazione 4. cellulare

1. Lavare mesencephala 3 volte con PBS sterile-GAB. Consenti frammenti del cervello di stabilirsi tra ogni lavaggio ed evitare di interrompere il tessuto. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere con attenzione quanto soluzione possibile e incubare segmenti cerebrali in 3 ml di tripsina / EDTA per 15 min a 37 ° C in unCO ₂ incubatore.
2. Fuoco-lucidare le pipette Pasteur per massimizzare la sopravvivenza dei neuroni, come la fine di una pipetta di vetro non levigato è tagliente e può danneggiare le cellule durante le fasi di dissociazione. Leggermente ridurre il diametro estremità (+ 0,5 mm) della pipetta Pasteur mentre fuoco lucidatura.
3. Rimuovere con attenzione quanto soluzione / EDTA tripsina possibile e aggiungere 10 ml di terreno di coltura / 10% IFB. Lavare i segmenti del cervello 3x con terreno di coltura / 10% IFB.
4. Utilizzando la pipetta Pasteur fuoco lucido, iniziare dissociazione di mesencephala in 6 ml di terreno di coltura / 10% IFB. Triturare 10x (evitare bolle d'aria), consentono ai blocchi di stabilirsi, poi raccogliere il medium in una nuova provetta sterile 13 ml.
5. Aggiungere 6 ml di terreno di coltura, ripetere il passaggio precedente, una volta e raccogliere il supporto contenente cellule dissociate nello stesso tubo 13 ml.
6. Centrifugare le cellule a 160 g per 5 min. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in terreno di coltura addizionato con10% mix ormonale.

5. cellulare placcatura

1. Contare le celle in sospensione in una cella Malassez e regolare il volume del mezzo ad una concentrazione di 600.000 cellule / ml. Circa 1.700.000 cellule possono essere ottenute da un mesencefalo mouse.
2. Rimuovere FBS-terreno contenente rivestimento da piastre da 24 pozzetti e aggiungere in ogni pozzetto 1 ml di sospensione cellulare (600.000 cellule / pozzetto, 2-4% delle cellule TH +).
3. Incubare la piastra a 37 ° C e 5% di CO _2/95% di aria. Nessun mezzo cambiamento è necessario. Neuroni dopaminergici sono maturi dopo circa 5-7 giorni in vitro (espressione coerente del trasportatore della dopamina). Conservare le cellule in coltura fino a 15 giorni senza prodotto sostitutivo.

6. immunofluorescenza protocollo

1. Pulizia dei vetrini
   1. Il giorno prima della dissezione, aggiungere 10 ml di 1 M HCl in una capsula di Petri. Posare sulla superficie del liquido 12-15 vetrini e attendere 15 min.
   2. Affondare il coperchioscivolare nel liquido e attendere 15 min.
   3. Rimuovere HCl e lavare 3 volte con acqua.
   4. Lavare i coprioggetti rapidamente con etanolo puro, una volta, quindi aggiungere etanolo puro al piatto e attendere 30 min.
   5. Sotto il cofano, rimuovere i vetrini puliti da etanolo e aggiungere 1 coprioggetto per pozzetto di una piastra di coltura cellulare 12 pozzetti con pinze sterilizzate.
   6. Lavare coprioggetto due volte con acqua sterile (1 ml / pozzetto). Poi, lavarli una volta con PBS sterile.
2. Rivestimento dei vetrini
   1. Rimuovere PBS e aggiungere 500 microlitri / pozzetto di 2x dell'OLP (diluito in PBS). Incubare per 4 ore a 37 ° C in incubatore CO _2.
   2. Rimuovere la soluzione OLP e lavare 3 volte con PBS sterile.
   3. Rimuovere PBS e aggiungere 500 microlitri / pozzetto di 20% IFB / 1 g / ml laminina. Incubare per una notte a 37 ° C in incubatore CO _2.
3. Placcatura le cellule per immunofluorescenza
   1. Rimuovere medio rivestimento da piastre da 12 pozzetti.
   2. Aggiungere 900,000 cellule / pozzetto in 2 volumi ml e far crescere le cellule in 37 ° C in incubatore. Le celle possono essere tenuti in coltura fino a 15 giorni senza prodotto sostitutivo.
4. Immunostaining
   1. Rimuovere media da piastre da 12 pozzetti e lavare con 500 microlitri / pozzetto DMEM preriscaldato a 37 ° C.
   2. Aggiungere 500 ml / pozzetto di DMEM preriscaldato a 37 ° C, quindi aggiungere lentamente 160 ml / pozzetto di 8% paraformaldeide (PFA, concentrazione finale 2%) e incubare per 10 min a 37 ° C.
   3. Rimuovere PFA e lavare 3 volte con PBS / 0,1 M glicina per 10 min.
   4. Rimuovere PBS, aggiungere / pozzetto di PBS / 0,05% di siero di capra 300 microlitri Triton X-100/20% e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
   5. Rimuovi medio, aggiungere siero di capra 300 ml / pozzetto di anticorpo primario diluito in PBS / 0,05% Triton X-100 / all'1% e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Gli anticorpi primari che possono essere utilizzati per la rilevazione di neuroni dopaminergici e caratterizzazione della cultura sono indicati nella tabella materiali. Mantenere1 bene senza anticorpo primario per valutare per lo sfondo dei diversi anticorpi secondari.
   6. Rimuovere medie e lavare 3 volte con PBS / 0,2% di gelatina per 10 min.
   7. Rimuovi medio, aggiungere siero di capra 300 ml / pozzetto di anticorpo secondario diluito in PBS / 0,05% Triton X-100 / all'1% e incubare per 1 ora a temperatura ambiente, al buio. Gli anticorpi secondari utilizzati sono indicati nella tabella materiali.
   8. Rimuovere medie e lavare 3 volte con PBS / 0,2% di gelatina per 10 min.
   9. Rimuovere medie e lavare 3 volte con PBS.
   10. Montare i coprioggetti sul lato vetro diapositive cella verso il basso in una goccia di Vectashield. Conservare i vetrini a temperatura ambiente per una notte per consentire al mezzo di montaggio a secco, poi conservarli a 4 ° C.
   11. Acquisire le immagini utilizzando un microscopio confocale o di un microscopio a contrasto di fase attrezzata per epifluorescenza. Immagini rappresentative sono state acquisite con un microscopio confocale Leica SP2 UV.

Un diagramma di flusso illustrato dei passaggi di coltura mesencefalo è mostrato in Figura 1. Brevemente, dopo aver raccolto embrioni E13.5 da una gravidanza topo svizzera, mesencefalo ventrale è sezionato dall'intero embrione. I frammenti del cervello isolati vengono successivamente sottoposti a digestione enzimatica e dissociazione meccanica. Cellule dissociate sono pellettizzati per centrifugazione, risospese in terreno di coltura e placcato in piastre da 12 o da 24 pozzetti pre-rivestito. Le cellule sono mantenute fino a 15 giorni senza prodotto sostitutivo.

Un diagramma di flusso dettagliato del mesencefalo ventrale dissezione, corrispondente al punto 3.2, è mostrato nella Figura 2. Linee rosse tratteggiate indicano le tre principali linee di taglio su una rappresentazione schematica di cervello di topo E13.5 (adattato da Prestoz et al. 30) e fasi di taglio sono illustrate.

Immagini di contrasto di fase della cultura dopo 1, 4, e 7 giorni in vitro (DIV) sono mostrati in figura 3. neuroni sviluppano rapidamente estensioni e germinazione (Figura 3A). Rami e ramificazioni sono più estesi a DIV4 e div7 (Figure 3B-3C).

Neuroni dopaminergici vengono rilevati mediante immunocitochimica utilizzando un anticorpo anti-TH (Figura 4A). Il numero di cellule TH + è espresso per 2,5 centimetri 2 coprioggetti (Figura 4B). Noi non esprimiamo il numero di cellule TH + per pozzetto come la densità delle cellule è molto più elevato ai confini della plastica rivestito bene che sul vetrino di vetro rivestito, che è al centro sul pozzo. Neuroni DA (cellule TH +) rappresentano il 2-4% della popolazione dell'intero cellule sul vetrino. TH-positivi cellule (TH +) appaiono già nel DIV1 e il loro numero aumenta rapidamente fino a raggiungere un massimo a DIV6.

La proporzione relativa delle cellule viene valutata mediante l'etichettatura immunofluorescenza delle cellule DA with un anticorpo anti-DAT (figura 5A) o un anticorpo anti-TH (Figura 5B) e colorazione concomitante di cellule neuronali con anticorpo anti-MAP2. Immunocolorazione rappresentativa di diverse popolazioni neuronali presenti nella cultura è anche mostrato in Figura 5. Neuroni GABAergici sono colorate utilizzando un anticorpo anti-GAD67 (Figura 5C) e rappresentano circa il 50% delle cellule. Neuroni serotoninergici vengono rilevati con un anticorpo anti-serotonina (Figura 5D) e rappresentano meno dell'1% delle cellule in coltura. La coltura cellulare mesencefalo contiene anche neuroni glutamatergici (il 40% della cultura), i neuroni colinergici, e cellule gliali rare (circa 2-3%). Percentuale di cellule gliali è determinato utilizzando proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) colorazione (Figura 5E). L'identificazione univoca dei neuroni dopaminergici mesencefalo può essere ottenuta anche utilizzando marcatori specifici come Pitx3 o Foxa2 31,32.

Maggiore ingrandimento immunocolorazione delle diverse popolazioni neuronali presenti nella cultura è mostrato in Figura 6. Neuroni dopaminergici vengono rilevati utilizzando un anticorpo anti-DAT (Figura 6A). DAT colorazione rispecchia DA neurone stato di maturazione. DAT espressione inizia a DIV3-4. Neuroni GABAergici e neuroni serotoninergici sono macchiati utilizzando un anticorpo anti-GAD67 (Figura 6B) o un anticorpo anti-serotonina (Figura 6C), rispettivamente.

Figura 1 Illustrato diagramma di flusso della cultura mesencefalo. Principali fasi di coltura sono indicati. (A) Sacrifica una gravidanza topo svizzero, raccogliere embrioni E13.5 in piastre di Petri e lavarli da bagni PBS successive. (BC) al microscopio dissezione, dissect mesencefalo ventrale da tutto il embrioni e metterli in un tubo. (D) Aggiungi tripsina-EDTA ai frammenti del cervello sezionato e digerire a 37 ° C per 15 min. (E) Togliere tripsina, aggiungere terreno contenente siero-cultura e di effettuare dissociazione delle cellule meccanico (10 movimenti triturazione, ripetute due volte). (F) Pellet cella, li risospendere in terreno privo di siero integrato con gli ormoni e li piastra in prerivestite 12 o 24 pozzetti piastre. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura diagramma di flusso 2 dettagliata della dissezione mesencefalo. Principali fasi di dissezione sono indicati. (A) embrione di topo al E13.5 dopo rerimozione dalle corna uterine. (B) Senza decapitare l'embrione, asportare il cervello. (C) Rappresentazione schematica del cervello embrionale del mouse E13.5. Red linee tratteggiate indicano dove il cervello deve essere tagliato per isolare mesencefalo ventrale (R, taglio rostrale, C, taglio caudale; D, taglio dorsale). Il vescicole cefaliche telencefalo, diencefalo, mesencefalo e romboencefalo sono delimitati in blu, viola, rosa e grigio, rispettivamente. Aq, acquedotto; Ipotesi, ipotalamo; LGE, laterale eminenza gangliare; LV, ventricolo laterale; MFB, fascio proencefalo mediale; MGE, mediale eminenza gangliare; sc, collicolo superiore; Thal, talamo; VM, mesencefalo ventrale; 4V, quarto ventricolo (adattato da 30). (D) le linee di taglio sono indicati da linee tratteggiate rosse su un cervello di topo E13.5. Cervello (E) del mouse dopo la rimozione delle regioni anteriori e romboencefalo (cioè dopo taglio R). cervello (F) del mouse dopo la rimozione del superior collicolo (cioè dopo i tagli R e D). (G) Vista ventrale del mesencefalo un isolato (cioè dopo taglia R, C, D). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3 immagini a contrasto di fase della cultura a diversi stadi di sviluppo. (A) DIV1, (B) DIV4, e immagini (C) div7 della stessa cultura sono mostrati. Le immagini sono state acquisite in cellule vive con un microscopio invertito. Cliccate qui per una versione più grande di questa figura.

Figura 4 tirosina idrossilasi colorazione dei neuroni dopaminergici. (A) A div8, neuroni dopaminergici sono stati rilevati utilizzando anticorpi anti-TH. La rivelazione è stata effettuata utilizzando un 3,3'-diamminobenzidina (DAB) kit. L'immagine è stata acquisita con un microscopio invertito. (B) Numero di TH + neuroni in colture mesencefalo in funzione dell'età della cultura. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5 proporzione Rappresentante di neuroni e astrociti nella cultura. Alla DIV4, neuroni DA (in magenta) sono stati rilevati utilizzando anticorpi anti-DAT (A) o anti-TH anticorpo (B) e neuroni GABAergici, neuroni serotoninergici e astrociti (in magenta) sono stati rilevati utilizzando anticorpi anti-GAD67 (C), anti-serotonina (D), e anticorpi anti-GFAP (E), rispettivamente. Cellule neuronali (in ciano) sono state colorate con un anticorpo anti-MAP2 (AE). Le immagini sono state acquisite con un microscopio invertito. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6 colorazione rappresentante di diverse popolazioni cellulari della cultura mesencefalo. (A) neuroni dopaminergici rilevata da DAT colorazione a DIV9 (in rosso). (B) neuroni GABAergici visualizzati da GAD-67 colorazione a DIV9 (in verde). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.