Perlina di aggregazione saggi per la caratterizzazione di molecole di adesione cellulare putativo

Summary

Qui presentiamo un metodo semplice e rapido per caratterizzare le proprietà adesive intrinseche delle molecole di adesione cellulare putative. L'ectodominio secreto, marcato con epitopo, di una molecola di adesione cellulare viene catturato dal terreno di coltura su piccole perle funzionalizzate uniformi. Queste perle possono quindi essere utilizzate immediatamente in semplici saggi di aggregazione delle microsfere.

Abstract

Adesione cellula-cellula è fondamentale per la vita pluricellulare ed è mediata da una gamma diversificata di proteine ​​di superficie cellulare. Tuttavia, le interazioni adesive per molte di queste proteine ​​sono poco conosciuti. Qui vi presentiamo un metodo rapido semplice per caratterizzare le proprietà adesive delle molecole di adesione cellulare omofiliche putativi. HEK293 cellule coltivate vengono trasfettate con il plasmide di DNA che codifica un secreto, epitopo-tagged ectodomain di una proteina di superficie cellulare. Utilizzando perline funzionalizzati specifici per il tag epitopo, il, proteina di fusione solubile secreta viene catturato dal mezzo di coltura. Le perle rivestite possono essere utilizzati direttamente nel tallone metodiche di aggregazione o in cordone fluorescente smistamento test per verificare l'adesione homophilic. Se lo si desidera, mutagenesi può quindi essere utilizzato per chiarire gli amminoacidi specifici o domini richiesti per l'adesione. Questo test richiede solo piccole quantità di proteina espressa, non richiede la produzione di linee cellulari stabili, e può essere ACCOmplished in 4 giorni.

Introduction

Adesione cellula-cellula è essenziale per lo sviluppo e l'integrità degli organismi multicellulari ed è mediata da una gamma diversificata di molecole di superficie cellulare. Molte di queste molecole di adesione sono stati identificati e caratterizzati, anche se molti rimangono da scoprire. Diversi metodi sono utilizzati per studiare le proprietà delle molecole di adesione cellulare (CAM), tra cui separazione delle cellule saggi, saggi di aggregazione delle cellule ^1-8 e metodi biofisici, come la microscopia a forza atomica e spettroscopia di forza di superficie ^9-12.

La complessità di anche semplificata nei sistemi in vitro su linee cellulari rende difficile determinare le proprietà adesive di una CAM putativo. Tipicamente, una molecola è considerata una CAM se induce aggregazione cellulare quando trasfettati in una linea cellulare non adesivo. Tuttavia, è chiaro che questa non è una prova diretta dell'attività adesivo. Per esempio, facilitando la consegna superficie cellulare o la stabilità di unCAM potrebbe anche tradursi in una maggiore aggregazione delle cellule ^1,13. Inoltre, un vero CAM potrebbe non riuscire a mediare aggregazione cella se la linea cellulare manca di altri co-fattori necessari per la consegna superficie cellulare o stabilizzazione.

Per evitare questi fattori di complicazione, le analisi più dirette possono essere impiegate che si basano sull'idea che le interazioni adesive dovrebbe essere una proprietà biochimica intrinseca del dominio extracellulare. Mentre perline sono stati inizialmente utilizzati per caratterizzare Ng-CAM ^2, questi test sono stati estesi al fine di indagare caderina-mediata adesione ^12,14,15. Utilizzando fusione dei C-caderina ectodomain-Fc fusioni, il laboratorio Gumbiner ha mostrato che più ripetizioni caderina contribuiscono a omofiliche interazioni ^14. Utilizzando comparabili metodiche di aggregazione tallone, E-caderina e N-caderina adesione sono stati anche caratterizzati ^12,15, come avere un numero di protocadherins ^1,15-18 e isoforme Dscam di Drosophila ^19. Qui descriviamo un test relativamente semplice e rapida per caratterizzare l'attività adesiva di secreti, ectodomains epitopi-tag di camme omofiliche putativi (Figura 1). Abbiamo usato questo test principalmente per caratterizzare i membri della superfamiglia caderina.

Protocol

1 Cella di preparazione (Giorno -2 a 0)

1. Split cellule HEK293 1: 5 con 0,05% di soluzione di tripsina-EDTA e incubare in crescita media a 37 ° C con il 5% di CO ₂ fino al 60 - 80% confluenti (2 - 3 giorni). Per ogni condizione, le cellule di coltura in 2 x 100 piatti mm.

2. cellulare trasfezione (giorno 1)

1. Trasfezione le cellule HEK293 con plasmide codificante Fc-fusion che usano un reagente di trasfezione quali Lipofectamine. Metodi alternativi che si traducono in efficienza di transfezione comparabili possono anche essere utilizzati.
2. Ritorna cellule trasfettate per incubatore per 24 ore.

3. cellulare Propagazione (Day 2)

1. Preriscaldare mezzi di crescita senza siero fetale bovino (-FBS) a 37 ° C.
2. Sciacquare piatti 2x 10 ml Crescita media -FBS, e restituiscono i piatti per la 37 ° C incubatore per 1 ora.
3. Sciacquare la culture piatti ancora una volta con 10 ml Crescita media -FBS, per un totale di 3 lavaggi.
4. Incubate le cellule HEK293 trasfettate a 37 ° C per altre 48 ore senza FBS prima di raccogliere i media.

4. Perlina Aggregation (Giorno 4)

1. Per raccogliere i supporti dalle piastre di coltura, trasferire file multimediali da ogni coppia di piatti da 50 ml provette coniche e spin a 500 xg per 5 minuti per far sedimentare i detriti cellulari.
2. Filtranti da 50 ml tubo conico in un filtro centrifugo con una siringa da 30 ml e 0,45 micron filtro a siringa.
3. Spin filtri centrifughi a 4.000 xg e 4 ° C fino al volume di terreno di coltura concentrato è di circa 500 microlitri (circa 15 minuti). Ripetere fino a quando è stato aggiunto tutti i media cultura e concentrato.
4. Aggiungere 1,5 ml di proteina G sfere magnetiche a 1 ml di freddo ghiaccio Binding Buffer in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga per ogni campione, posto su un magnete e rimuovere il tampone. Aggiungere immediatamente il terreno di coltura concentrato alla proteina G sfere magnetiche.
5. Ruotare i tubi a 4 ° C per 2 ore.
6. Pltubi asso su un magnete e rimuovere i supporti. Lavare rapidamente perle due volte con il freddo ghiaccio 1 ml di Binding Buffer, e poi risospendere perline in 300 microlitri Binding Buffer.
7. Split perline risospeso in 2 tubi, 150 ml in ciascun tubo, e quindi aggiungere 1,5 ml di mM CaCl ₂ o 200 mM EDTA 200 per il "calcio" e condizioni "non calcio", rispettivamente.
8. Trasferire 100 microlitri di ciascuna condizione di una depressione ben scorrere raccogli micrografie utilizzando un microscopio a luce trasmessa (Figura 2). Raccogliere immagini da 5 campi di visualizzazione per ogni esperimento in ogni punto desiderato.

Analisi dei dati 5.

1. Utilizzando ImageJ, o software di analisi dell'immagine paragonabile, aprire uno dei cinque set di dati di immagine utilizzando l'Importazione / Sequenza d'immagini ... dal menu a tendina File. Questi saranno aperti come una serie di immagini.
2. Nella finestra di dialogo ... Immagine / Proprietà modificare l'iunità mage per pixel e impostare Pixel Larghezza e Altezza pixel a 1.0.
3. Convertire le immagini in binario usando il / Soglia Regola ... comando nel menu a tendina immagine. Impostare la soglia per includere i pixel che contribuiscono a perline o aggregati tallone, ma che escludono background e piccole particelle. Applica a tutte le immagini nello stack.
4. Nella finestra di dialogo Imposta misurazioni, selezionare le caselle di area e Stack di posizione.
5. Eseguire Analizza particelle ... nel Analizza menu a tendina. Questo genererà un elenco di particelle identificate, compresa la loro dimensione (area) e l'immagine in cui sono stati identificati.
6. Ripetere questo processo per il quale sperimentare e condizione sperimentale.

Results

Un esperimento di esempio è presentato in figura 2, che mostra tallone aggregazione calcio-dipendente dal ectodomain di N-caderina fuso a Fc (NcadEC-Fc). In assenza di calcio, perline mostrano poca o nessuna tendenza ad aggregarsi e non vi è alcun aumento delle dimensioni aggregata con il tempo (Figura 1A, C). In presenza di calcio, perline rivestite con NcadEC-Fc mostra robusta aggregazione, con granulometria crescente nel tempo (Figura 1B, C). Questo esperimento è sta...

Discussion

L'adesione cellulare è una caratteristica essenziale della vita pluricellulare ed è mediata da una vasta gamma di proteine ​​di superficie cellulare. Di questi, le proprietà adesive dettagliate sono compresi solo una parte relativamente piccola. Qui, abbiamo descritto un protocollo rapido semplice per indagare la capacità adesiva homophilic di ectodomains secreti fuse a un tag epitopo conveniente. Questo approccio ha una serie di importanti vantaggi. In primo luogo, le linee cellulari stabili non sono necessari

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmide pFc-N1	Addgene	Da inviare
HEK293 cellule	American Type Culture Collection	CRL-1573
DMEM	Mediatech - Corning	10-013-CV
Siero fetale bovino (FBS)	Sigma	F2442
100x Pen-Strep (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122
0,05% Tripsina-EDTA	Tecnologie di vita	25300054
Lipofectamine 2000	Tecnologie di vita	11668030
Dynabeads Proteina G	Life Technologies	10003D
Albumina di siero bovino	Sigma	A3294
Diapositive di depressione	Microscopia elettronica Scienze	71878-06
Unità filtrante centrifuga Amicon Ultra-15 con membrana Ultracel-10	Millipore	UFC901024
filtro per siringa da 0,45 mm	Sarstedt	83.1826
Software di analisi delle immagini Dynamag-2 Magnet	Life Technologies	12321D
Fiji (ImageJ)	http://fiji.sc/Fiji
Tabella dei tamponi/soluzioni
Terreni di crescita	DMEM + 10% FBS + Filtro per streptococco a penna.
Media di crescita – FBS	DMEM + Filtro Pen-Strep	sterilizzare e conservare a 4 °C.
Tampone legante	50 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,2% BSA	Vortex fino a dissoluzione, conservare in ghiaccio.