Qui presentiamo un metodo semplice e rapido per caratterizzare le proprietà adesive intrinseche delle molecole di adesione cellulare putative. L'ectodominio secreto, marcato con epitopo, di una molecola di adesione cellulare viene catturato dal terreno di coltura su piccole perle funzionalizzate uniformi. Queste perle possono quindi essere utilizzate immediatamente in semplici saggi di aggregazione delle microsfere.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Perlina di aggregazione saggi per la caratterizzazione di molecole di adesione cellulare putativo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Adesione cellula-cellula è fondamentale per la vita pluricellulare ed è mediata da una gamma diversificata di proteine di superficie cellulare. Tuttavia, le interazioni adesive per molte di queste proteine sono poco conosciuti. Qui vi presentiamo un metodo rapido semplice per caratterizzare le proprietà adesive delle molecole di adesione cellulare omofiliche putativi. HEK293 cellule coltivate vengono trasfettate con il plasmide di DNA che codifica un secreto, epitopo-tagged ectodomain di una proteina di superficie cellulare. Utilizzando perline funzionalizzati specifici per il tag epitopo, il, proteina di fusione solubile secreta viene catturato dal mezzo di coltura. Le perle rivestite possono essere utilizzati direttamente nel tallone metodiche di aggregazione o in cordone fluorescente smistamento test per verificare l'adesione homophilic. Se lo si desidera, mutagenesi può quindi essere utilizzato per chiarire gli amminoacidi specifici o domini richiesti per l'adesione. Questo test richiede solo piccole quantità di proteina espressa, non richiede la produzione di linee cellulari stabili, e può essere ACCOmplished in 4 giorni.
Introduzione
Adesione cellula-cellula è essenziale per lo sviluppo e l'integrità degli organismi multicellulari ed è mediata da una gamma diversificata di molecole di superficie cellulare. Molte di queste molecole di adesione sono stati identificati e caratterizzati, anche se molti rimangono da scoprire. Diversi metodi sono utilizzati per studiare le proprietà delle molecole di adesione cellulare (CAM), tra cui separazione delle cellule saggi, saggi di aggregazione delle cellule 1-8 e metodi biofisici, come la microscopia a forza atomica e spettroscopia di forza di superficie 9-12.
La complessità di anche semplificata nei....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1 Cella di preparazione (Giorno -2 a 0)
- Split cellule HEK293 1: 5 con 0,05% di soluzione di tripsina-EDTA e incubare in crescita media a 37 ° C con il 5% di CO 2 fino al 60 - 80% confluenti (2 - 3 giorni). Per ogni condizione, le cellule di coltura in 2 x 100 piatti mm.
2. cellulare trasfezione (giorno 1)
- Trasfezione le cellule HEK293 con plasmide codificante Fc-fusion che usano un reagente di trasfezione quali Lipofectamine. Metodi alternativi che si traducono in efficienza di transfezione comparabili possono anche essere utilizzati.
- Ritorna cellule trasfettate per incubatore per 24 ore. <....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Un esperimento di esempio è presentato in figura 2, che mostra tallone aggregazione calcio-dipendente dal ectodomain di N-caderina fuso a Fc (NcadEC-Fc). In assenza di calcio, perline mostrano poca o nessuna tendenza ad aggregarsi e non vi è alcun aumento delle dimensioni aggregata con il tempo (Figura 1A, C). In presenza di calcio, perline rivestite con NcadEC-Fc mostra robusta aggregazione, con granulometria crescente nel tempo (Figura 1B, C). Questo esperimento è sta.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
L'adesione cellulare è una caratteristica essenziale della vita pluricellulare ed è mediata da una vasta gamma di proteine di superficie cellulare. Di questi, le proprietà adesive dettagliate sono compresi solo una parte relativamente piccola. Qui, abbiamo descritto un protocollo rapido semplice per indagare la capacità adesiva homophilic di ectodomains secreti fuse a un tag epitopo conveniente. Questo approccio ha una serie di importanti vantaggi. In primo luogo, le linee cellulari stabili non sono necessari
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da un premio NSF/ARRA (IOS 0920357) e da un premio dal NIH (5R21MH098463).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Plasmide pFc-N1 | Addgene | Da inviare | |
| HEK293 cellule | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| DMEM | Mediatech - Corning | 10-013-CV | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Sigma | F2442 | |
| 100x Pen-Strep (10.000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| 0,05% Tripsina-EDTA | Tecnologie di vita | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Tecnologie di vita | 11668030 | |
| Dynabeads Proteina G | Life Technologies | 10003D | |
| Albumina di siero bovino | Sigma | A3294 | |
| Diapositive di depressione | Microscopia elettronica Scienze | 71878-06 | |
| Unità filtrante centrifuga Amicon Ultra-15 con membrana Ultracel-10 | Millipore | UFC901024 | |
| filtro per siringa da 0,45 mm | Sarstedt | 83.1826 | |
| Software di analisi delle immagini Dynamag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Fiji (ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | ||
| Tabella dei tamponi/soluzioni | |||
| Terreni di crescita | DMEM + 10% FBS + Filtro per streptococco a penna. | ||
| Media di crescita – FBS | DMEM + Filtro Pen-Strep | sterilizzare e conservare a 4 °C. | |
| Tampone legante | 50 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,2% BSA | Vortex fino a dissoluzione, conservare in ghiaccio. |
Riferimenti
- Chen, X., Gumbiner, B. M. Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity. J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).
- Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. Evidence for the binding of ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
