In questo studio, una nuova piattaforma per indagare le firme molecolari intraneuronali di risposta al trattamento nel disturbo bipolare (BD) è stato sviluppato e validato. Epitelio olfattivo da pazienti BD è stato ottenuto attraverso biopsie nasali. Poi laser-capture microdissezione è stato combinato con Tempo reale RT PCR per indagare la firma molecolare della risposta litio in BD.
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Articolo metodologico
I neuroni olfattivi ottenuti attraverso nasale biopsia combinato con laser-Capture Microdissection: un approccio potenziale per studiare risposta al trattamento in Disturbi Mentali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il disturbo bipolare (BD) è un grave disturbo neuropsichiatrico con fisiopatologia poco compreso e in genere trattate con lo stabilizzatore dell'umore, carbonato di litio. Gli studi sugli animali e studi genetici umani indicano che il litio colpisce bersagli molecolari che sono coinvolti nella crescita neuronale, la sopravvivenza e la maturazione, e in particolare le molecole coinvolte nella segnalazione Wnt. Data la sfida etica di ottenere biopsie cerebrali per studiare variazioni dinamiche molecolari associati con litio-risposta nel sistema nervoso centrale (CNS), si può considerare l'uso di neuroni ottenuti da tessuti olfattive per raggiungere questo goal.The epitelio olfattivo contiene neuroni recettrici a diversi stadi di sviluppo e gliali come cellule di supporto. Questo offre un'opportunità unica per studiare i cambiamenti dinamici nel sistema nervoso centrale dei pazienti con malattie neuropsichiatriche, utilizzando il tessuto olfattivo ottenuto in modo sicuro da biopsie nasali. Per superare l'inconveniente posta dal substla contaminazione antial di tessuto olfattiva biopsia con cellule non neuronali, un nuovo approccio per ottenere popolazioni di cellule neuronali arricchito è stato sviluppato combinando biopsie nasali con laser-capture microdissezione. In questo studio, un sistema per studiare variazioni dinamiche molecolari associati al trattamento nel tessuto neuronale è stato sviluppato e convalidato, con un piccolo campione pilota di pazienti BD reclutati per lo studio dei meccanismi molecolari di risposta al trattamento litio.
Introduzione
Il disturbo bipolare (BD) è un grave disturbo neuropsichiatrico, caratterizzato da alterazioni patologiche di umore, guidare e cognizione 1. Litio usato per il trattamento di BD ha dimostrato di alterare costanti i livelli di mRNA stato di un gran numero di geni in studi su animali 2, ma rimane sconosciuta se uno qualsiasi di queste molecole è associato con risposta clinica nell'uomo 2. Comprendere il meccanismo di risposta litio richiederebbe indagare i cambiamenti molecolari litio-indotta nei tessuti neuronali. Purtroppo, non è pratico di ottenere biopsie cerebrali di pazienti BD prenatale e della post-litio per identificare le ....
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Protocollo
NOTA: Tutti i volontari di ricerca in questo studio sono stati somministrati i documenti di consenso informato approvato dal Institutional Review Board di Howard University e la Johns Hopkins University. Solo ai partecipanti che hanno acconsentito, firmando documenti consenso informato sono stati arruolati nello studio. La base di studio per questa analisi consisteva in: 20 soggetti (12 BD e 10 controlli, 30% maschi) ed età (sd) di 38,2 (14,1) anni significa.
NOTA: Spray tutte le superfici con RNase Zap per eliminare la contaminazione RNasi dalle superfici di vetro e plastica.
1. Biopsia Procedura
- Spray topico lidocaina ....
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Risultati
La strategia di protocollo e la risoluzione dei problemi nello studio delle firme molecolari sono state ottimizzate con successo. Qualità dell'RNA e criteri di arricchimento neuronali per campioni da utilizzare in una fase successiva analisi reale Time-PCR sono stati standardizzati. RIN e concentrazione di RNA sono stati esaminati i fattori di confondimento a livelli di espressione rilevati. Sulla base dell'analisi di diversi campioni con RIN da 1 - 10, è stato determinato che un RIN minimo di ~ 3,0 e sopra è sufficient.......
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Discussione
Una nuova piattaforma per l'ottenimento arricchiti strati di neuroni olfattivi combinando biopsia nasale e LCM è presentato ed è stato convalidato in questo studio. Questa tecnica può avere implicazioni diffuse. Può essere applicato verso studi biomarcatori, compresi quelli per la risposta al trattamento, e gli sforzi di scoperta di farmaci per altre condizioni neuropsichiatriche, avere un impatto più ampio nel campo.
Per ottenere i neuroni di alta qualità suscettibili di applicazioni a .......
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Dichiarazioni
Gli autori non segnalano rapporti finanziari con interessi commerciali.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni USPHS MH-091460 (E.N.), MH-084018 (A.S.), MH-094268 Silvo O. Conte center (A.S.), MH-069853 (A.S.), MH-085226 (A.S.), MH-088753 (A.S.), MH-092443 (A.S.) e MH-096208 (K.I.), sovvenzioni da DANA (E.N.), Stanley (A.S.), RUSK (A.S.), S-R foundations (A.S.), NARSAD (A.S. e K.I.), e il Fondo per la ricerca sulle cellule staminali del Maryland (A.S. e K.I.).
Apprezziamo sinceramente gli sforzi e i contributi di Pearl Kim, Maria Papapavlou, Nao Gamo, Youjin Chung, Yukiko Lema e Mark Christie verso il coordinamento del processo di biopsia.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
RNA Extraction
Carl Zeiss td colspan="4">
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Preparazione dei Tessuti | |||
| Stampi Cryomold Tissue-Tek | Sakura Finetek | 4557 | |
| Composto O.C.T. | Tessuto Sakura Finetek | 4583 | |
| Criosezionamento | |||
| Vetrino a membrana 1.0 PEN (D) | Carl Zeiss Microscopy | 415190-9041-000 | |
| Rnase Zap | Ambion | AM9780 | |
| DEPC Qualità dell'acqua trattata | biologica | 351-068-131 | |
| Microdissection | |||
| Microscopio: Sistema MicroLaser serie PALM | Microscopia | Modello: Axiovert 200M Software: Robo v3.2 | |
| No. 5 Dumont Microdissction Forceps | Roboz | RS-49085< | |
| RNAqueous Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| cDNA Synthesis | |||
| SuperScript III First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| OMP qPCR | |||
| SYBR GreenER qPCR SuperMix | Invitrogen | 11760-500 | |
| Taqman qPCR | |||
| TaqMan Sonde per saggi di espressione | Biosystems applicati | Vari | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 |
Riferimenti
- Goodwin, F. K., Jamison, K. R. Manic-depressive illness. , Oxford University Press. (1990).
- Einat, H., Manji, H. K. Cellular plasticity cascades: genes-to-behavior pathways in animal models of bipolar disorder. Biol Psychiatry. 59 (12), 1160-1171 (2006).
- Severino, G., et al.....
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Ristampe e permessi
