Qui dimostriamo una tecnica per la trasduzione neuronale diffusa mediante iniezione intraventricolare di virus adeno-associato nel cervello del topo neonatale. Questo metodo fornisce un modo rapido e semplice per ottenere l'espressione permanente dei transgeni veicolati viralmente.
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Articolo metodologico
Intracerebroventricular Iniezione virale del cervello neonatale mouse per persistente e diffusa trasduzione neuronale
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Con il ritmo del progresso scientifico accelerare rapidamente, sono necessari nuovi metodi per la neuroscienza sperimentale per manipolare rapidamente e facilmente l'espressione genica nel cervello di topo. Qui si descrive una tecnica introdotta da Passini e Wolfe per la consegna intracranica diretta di transgeni viralmente-codificati nel cervello neonatale mouse. Nella sua forma più elementare, la procedura richiede solo un secchio di ghiaccio e una siringa microlitro. Tuttavia, il protocollo può anche essere adattato per l'uso con cornici stereotassica per migliorare la coerenza dei ricercatori nuovi alla tecnica. Il metodo si basa sulla capacità del virus adeno-associato (AAV) di spostarsi liberamente dai ventricoli cerebrali nel parenchima cerebrale, mentre il rivestimento ependimale è ancora immaturo durante la prima 12-24 ore dopo la nascita. Iniezione intraventricolare di AAV a questa età i risultati in diffusa trasduzione di neuroni in tutto il cervello. Espressione inizia entro giorni di iniezione e persiste per la lifetime dell'animale. Titolo virale può essere regolato per controllare la densità di neuroni trasdotte, mentre la co-espressione di una proteina fluorescente fornisce un'etichetta vitale di cellule trasdotte. Con la crescente disponibilità di servizi di base virali per fornire i reagenti sia off-the-shelf, pre-confezionati e preparazione virale personalizzato, questo approccio offre un metodo opportuno per manipolare l'espressione genica nel cervello di topo che è veloce, facile e molto meno costoso di ingegneria germinale tradizionale.
Introduzione
I metodi tradizionali per modificare l'espressione genica neuronale richiedono tempo e costosa manipolazioni linea germinale. Alternativa de novo approcci come in utero elettroporazione o iniezione stereotassica lentivirali dare risultati più rapidi e sono meno costosi, ma hanno lo svantaggio di richiedere un intervento chirurgico complesso di 1-3. Inoltre, l'espressione del transgene ha una gamma limitata spaziale con questi metodi. Qui, descriviamo un metodo veloce, facile ed economico per la manipolazione neuronale diffusa tramite iniezione intraventricolare di virus adeno-associato (AAV) nel cervello neonatale mouse. Il metodo....
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Protocollo
Eseguire tutte le procedure ei protocolli che coinvolgono animali in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Le procedure qui descritte sono stati esaminati e approvati dal Baylor College of Medicine Istituzionale Animal Care and Use Committee.
Virus adeno-associato (AAV) vettori replica-incompetente per la consegna del transgene nel cervello di roditori sono approvati per la sicurezza biologica di livello 1 uso. Consultare il sito web di CDC per la pubblicazione governo degli Stati Uniti "Biosafety in Microbiologia e laboratori biomedici (BMBL)" che elenca in dettaglio i re....
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Risultati
I rendimenti intraventricolare successo iniezione virale diffusa e robusta espressione neuronale. Qui abbiamo valutato trasduzione virale utilizzando YFP o tdTomato geni fluorescenti sotto il controllo del promotore di pollo beta actina (CBA promotore). Questi costrutti sono stati confezionati in AAV8 e iniettate nei ventricoli laterali di neonatali topi (P0) ICR. Titoli virali alti (10 10 particelle per emisfero) hanno determinato l'etichettatura densa del bulbo olfattivo, striato, corteccia cerebrale, ippoc.......
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Discussione
Abbiamo descritto un procedimento versatile per la manipolazione genica neuronale utilizzando AAV come veicolo di distribuzione capillare nel cervello neonatale topo. Rispetto ad altri metodi di transgenesi neuronale, come in utero elettroporazione 1 o iniezione stereotassica intracranica 2,3, iniezione virale neonatale è relativamente facile e semplice. La procedura di base può essere eseguita in pochi minuti con solo un cestello di ghiaccio e una siringa microlitro. Sopravvivenza ottimale e di es.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata supportata dalla Robert A. and Rene E. Belfer Family Foundation, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Foundation Alzheimer's Disease research grant A2010097 (JLJ) e NIA Biology of Aging Training grant T32 AG000183 (supporto per SDG).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| ICR topi di razza | Harlan | Hsd: ICR (CD-1) | Questo ceppo è anche conosciuto come topi consanguinei CD-1 |
| FVB | The Jackson Laboratory | 1800 | 5-6 settimane di età |
| Nestlets | Lab Supply | NESTLETS | |
| Shepherd shacks | Lab Supply | SS-mouse | |
| High fat roditore chow | Purina Mills | PicoLab Dieta del topo 20, #5058 | Questo è il nostro cibo standard per roditori |
| alto contenuto di grassi (alternativo) | Harlan Laboratories | Teklad Global 19% protein roditore dieta #2019S | Se a basso contenuto di fitoestrogeni, è necessaria una dieta autoclavabile |
| Siringa per iniezione | Hamilton | 7653-01 | Siringa da 10 ml |
| Aghi per iniezione | Hamilton | 7803-04, RN 6PK PT4, 0,375" | 32 G, per iniezioni standard P0 |
| Piastra metallica per crioanestesia | McMaster Carr | 8975K439 | Piastra in alluminio grezzo, 6" x 12", 0,25" di spessore, dovrà essere tagliata in 3 pezzi uguali e i bordi levigati da un'officina meccanica locale |
| Dispositivo stereotassico per piccoli animali con lettura digitale | David Kopf Instruments | Modello 940 | |
| Supporto universale per siringa con piedino di supporto dell'ago | David Kopf Instruments | Modello 1772-F1 | |
| Telaio neonatale | Stoelting | 51625 | Ufficialmente chiamato adattatore per topi e ratti neonatali |
| Sacche per lo smaltimento dei rischi biologici con indicatore sterile | VWR | 14220-030 | Importante! – Verifica con il personale veterinario e di sicurezza ambientale locale per conoscere il tuo istituto" Protocollo S per lo smaltimento dei rifiuti a rischio biologico |
Riferimenti
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Progress in neurobiology. 92, 227-244 (2010).
- Sun, B., Gan, L. Manipulation of g....
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Ristampe e permessi
