Articolo metodologico

Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina

DOI:

10.3791/51872

⸱

2 agosto 2015

 ,  , 
1Department of Genetics, Stanford University, 2Stanford Center for Genomics and Personalized Medicine, Stanford University

In questo articolo

Sommario

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Utilizzando microarray proteici contenenti quasi tutta la S. cerevisiae proteoma è sondato per un rapido interrogatori imparziale di migliaia di interazioni proteina-proteina in parallelo. Questo metodo può essere utilizzato per la proteina-piccola molecola, modificazione post-traslazionale, e altri saggi in high-throughput.

Abstract

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Ad alta densità di microarrays della proteina funzionali contenenti ~ 4.200 proteine ​​ricombinanti di lievito vengono esaminati per le interazioni proteina-proteina chinasi utilizzando una proteina di fusione purificate per affinità lievito chinasi contenente un tag V5-epitopi per read-out. Chinasi purificata è ottenuto attraverso la cultura di un ceppo di lievito ottimizzato per alta copia la produzione di proteine ​​ospitare un plasmide contenente una fusione chinasi-V5 costruire sotto un elenco indirizzi globale promotore inducibile. Il lievito viene coltivato in mezzi restrittiva con una fonte di carbonio neutro per 6 ore seguita da induzione con 2% galattosio. Successivamente, la coltura è raccolta e chinasi è purificato mediante affinità standard di tecniche cromatografiche per ottenere una proteina chinasi altamente purificata per uso nel saggio. La chinasi purificata è diluita con tampone chinasi ad una gamma appropriata per il dosaggio e microarray della proteina sono bloccate prima ibridazione con il microarray della proteina. Dopo l'ibridazione, gli array vengono sondati con un anticorpo monoclonale V5 ANTIBody per identificare le proteine ​​legate dalla proteina chinasi-V5. Infine, gli array vengono sottoposti a scansione utilizzando uno scanner microarray standard ei dati vengono estratti per l'informatica a valle dell'analisi 1,2 per determinare una elevata fiducia insieme di interazioni proteiche per la convalida a valle in vivo.

Introduzione

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La necessità di effettuare analisi globali di biochimica delle proteine ​​e di attività in vivo legame ha portato allo sviluppo di nuovi metodi di profiling interazioni proteina-proteina (PPI) e le modificazioni post-traduzionali di proteomi interi 1,3-8. Microarrays proteine ​​sono prodotte come microarray proteici funzionali utilizzando proteine ​​funzionali full-length 4-6,8,9 o microarrays della proteina analitiche contenenti anticorpi 10,11. Essi sono progettati per contenere una alta densità di proteine ​​disposte su vetrini da microscopio con una varietà di chimiche superficiali per facilitare una varietà di condizioni sperimentali necessari per condurre ampio biochimico analisi 12. Nitrocellulosa e di superficie aldeide chimiche per il fissaggio chimico tramite lisina o attaccamento affinità metodi come diapositive chelati nichel per fissare le proteine ​​His-tag e glutatione per il fissaggio affinità tra gli altri 13.

L'uso di microarray della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina richiede l'accesso a una elevata qualità library proteina funzionale 14. S. cerevisiae è suscettibile di produrre una tale biblioteca attraverso l'abbinamento di alta copia affinità tagged costrutti di proteine ​​ad alto throughput tecniche di purificazione cromatografica. La stragrande maggioranza del genoma del lievito è stato sequenziato e quasi l'intero proteoma può essere espresso da un plasmide alta copia per la purificazione e biochimico analisi 12. Una volta che le proteine ​​sono ottenuti e disposte in formato da 384 pozzetti, vengono stampate su un vetrino da microscopio che permette una rapida analisi biochimica multi-parametrica parallelo e interrogatori bioinformatica 8,14-16. Microarrays della proteina sono stati utilizzati per saggi enzimatici e interazioni con proteine, lipidi, piccole molecole, e acidi nucleici tra molte altre applicazioni. L'accessibilità delle proteine ​​sulla superficie del proteomaarray li rendono suscettibili di diversi tipi di rilevazione analitica, tra cui, immuno-affinità, risonanza plasmonica di superficie, fluorescenza e molte altre tecniche. Inoltre, esso consente un controllo preciso della condizione sperimentale dove potrebbe essere difficile da fare in vivo.

L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare l'uso appropriato di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina. Questa applicazione consente l'analisi biochimica in parallelo ad alta produttività delle attività di legame alle proteine ​​usando un analita altamente purificato (proteina) di interesse. Una C-terminale (carbossi-terminale) etichettato V5-fusione esca proteina di interesse è prodotta da un plasmide alta copia in un ceppo di lievito ottimizzato per la purificazione della proteina. C-terminale codifica assicura che l'intera lunghezza proteina è stato tradotto. La proteina utilizzata in questo studio è TDA1-V5 proteina di fusione chinasi, che viene potabilizzata con resina nichel affinità tramite un tag His6X. La costru fusione TDA1-V5t è purificato tramite eluizione seriale utilizzando un gradiente di imidazolo per eluire la frazione più altamente arricchito per l'uso nel saggio.

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Protocollo

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1. Preparazione della sonda

  1. Cultura e purificare le sonde chinasi V5-fusione utilizzate per esaminare le interazioni con altre proteine ​​come segue:
    1. Utilizzare appena striato ceppo di lievito Y258 (Mata pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) contenenti proteine ​​V5-fusion (espressa da GATEWAY vettoriali pYES-DEST52). Utilizzare la proteina isolata come sonda sui microarray. Piatto il lievito in sintetico complete-uracile (Sc-Ura) / 2% destrosio / Agar e crescere a 30 ° C per 3 giorni di cultura congelati (-80 ° C glicerolo magazzino).
    2. Seminare colture starter (5-20 ml) da una singola colonia e crescere durante la notte in Sc-Ura / 2% destrosio sulla piattaforma (220-250 giri al minuto) o la rotella che agita a 30 ° C.
    3. La mattina seguente, inoculare 400 ml di Sc-Ura / 2% cultura raffinosio con la cultura di avviamento sufficiente per un diametro finale 600 del 0.1.
    4. Crescere i inoculums a OD 600 di 0,6, seguita da induzione galattosio del fu V5-chinasisione costruire espressione aggiungendo una soluzione di 3x Yeast Extract / Peptone (YEP) supplementato con 6% galattosio, aggiungendo abbastanza per diluire il supporto di induzione di un fattore 3 in modo che la concentrazione finale di galattosio è 2%.
    5. Indurre le cellule a 30 ° C per 6 h su una piattaforma oscillante. Utilizzare un pallone da 2 L Erlenmeyer per garantire un'adeguata aerazione.
    6. Celle di raccolta utilizzando un rotore JA-10 (o comparabili) facendo girare 400 ml di sospensione cellulare a 1000 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    7. Lavare le cellule una volta con 50 ml di ghiaccio tampone PBS freddo e trasferirlo in una provetta da 50 ml. Lavare il pellet di nuovo in ghiaccio PBS freddo (senza detergenti o altri additivi) utilizzati per lisi e trasferimento in 2 ml snap-cap tubi per lisi.
    8. Spin le cellule a 20.000 xg per 1 min a 4 ° C per un pellet e pipetta via buffer.
    9. Mettere le provette su ghiaccio e procedere con il passaggio di lisi.
    10. Lyse le cellule (250-350 ml pellet) con 00,5 millimetri perle zirconia in un 1: 1: 1 volume di pellet, perline, e PBS (PBS) Lysis Buffer e vortex la miscela utilizzando una piattaforma di agitazione per 3 volte a 2 min a intervalli di 4 ° C.
    11. Centrifugare il lisato a 20.000 xg in una microcentrifuga da tavolo per 10 minuti a 4 ° C.
    12. Dispensare surnatante in provetta da centrifuga in policarbonato ad alta velocità e chiarire da ulracentrufugation per 30 min a 150.000 xg a 4 ° C.
    13. Trasferire il lisato chiarificato in una provetta contenente prelavato Ni 2 + resina di affinità (~ 100 ml) e incubare su un nutator per 2 ore a 4 ° C per catturare istidina (His) 6X tagged proteine ​​V5-fusion.
    14. Lavare la resina tre volte per 10 minuti a 4 ° C con tampone di lavaggio. Pellet resina utilizzando una centrifuga da tavolo per 5 min a 1000 xga 4 ° C e aspirare il surnatante. Aggiungere tampone di lavaggio fresco per ogni lavaggio e restituire il tubo del nutator per l'agitazione durante il lavaggio.
    15. Dopo il lavaggio steps sono completi, applicare la resina lavato per un nuovo G-25 colonna per eluizione.
    16. Applicare 25 microlitri di tampone di eluizione in maniera graduale iniziando con imidazolo 100 mM imidazolo 500 mM in incrementi di 50 mm per un totale di 9 frazioni.
    17. Analizzare frazioni raccolte utilizzando gel di sodio dodecil solfato poliacrilammide (SDS-PAGE) e colorazione Coomassie identificare la frazione (s) più altamente arricchito per l'uso nel saggio e aggiungere glicerolo al 30% e conservare a -80 ° C fino all'uso nel test.

2. Probing gli Array

NOTA: Si prega di vedere il punto 2.6 di questa sezione per preparare la soluzione di anticorpi prima di iniziare il test.

  1. Per rilevare le interazioni, diluire l'anticorpo coniugato V5-fluoroforo (cioè AlexaFluor 647) a 260 ng / ml in tampone sonda e mescolare accuratamente agitando.
    NOTA: Preparare questa soluzione di anticorpo 30 min prima dell'uso e porre il tubo su una nutato o ruota per permettere una miscelazione completa e una sospensione omogenea di anticorpi.
  2. Diluire la sonda proteica V5-fusione su un intervallo di concentrazione di 5-500 mg / ml.
    NOTA: Ottimizzato per ogni proteina-proteina test interazione, utilizzando tampone sonda. Ottimizzazione comporta l'aggiunta più sonde per sondare buffer. Tipicamente 10 ug / ml viene usata come punto di partenza e regolati di conseguenza sulla base della forza del segnale.
  3. Rimuovere i microarrays della proteina dal congelatore (-20 ° C) e portare a 4 ° C in frigorifero immediatamente prima dell'uso.
  4. Aggiungere tampone di bloccaggio direttamente al titolare diapositiva contenente i micorarrays proteine ​​e coprire la parte superiore con parafilm per evitare perdite. Bloccare gli array in tampone bloccante per 1 ora agitando a 50 giri su un palco a 4 ° C.
  5. Dopo il blocco, trasferire gli array ad una camera umidificata refrigerate a 4 ° C e aggiungere 90 ml di sonda diluito direttamente sulla superficie dell'array. Sovrapporre il arrays con una scivolata sollevatore alzato e incubare statico (senza agitando) nella camera umidificata a 4 ° C per 1,5 ore.
  6. Lavare gli array 3 volte per 1 min ciascuna in tampone sonda in tre provette da 50 ml coniche. Aggiungere la diapositiva per provette coniche contenenti abbastanza tampone sonda pre-raffreddata a busta completamente la diapositiva. Lasciare che la polizza sollevatore di scivolare delicatamente fuori del microarray di proteine ​​(non forzare fuori come questo potrebbe causare danni alla superficie array).
  7. Applicare la soluzione di anticorpi direttamente a matrice immediatamente dopo aver completato il lavaggio (passo 2.5) e overlay con una scivolata sollevatore cresciuto come prima. Incubare le matrici per 30 min a 4 ° C in camera umidificata.
  8. Eseguire la stessa fase di lavaggio come prima (3 volte 1 min in tampone sonda), e centrifuga in una provetta conica da 50 ml a 800 xg in una centrifuga da tavolo per 5 min a temperatura ambiente. Asciugare gli array in un supporto di diapositive al buio per 30 minuti prima scansione della matrice a 647 nm.

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Risultati

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L'attività di interazione proteina-proteina è stata osservata utilizzando un lettore di chip standard per valutare l'TDA1-V5 proteina chinasi di fusione costrutto come proteina esca contro un lievito microarray proteina funzionale contenente circa 4,200 unica S. cerevisiae proteine ​​di fusione GST-. Ulteriore interrogatorio con il software GenePix rivelato una moltitudine di eventi di intensità variabili vincolanti. L'affinità è stato misurato l'intensità graduata del segnale derivato da un anticorpo monoclona...

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Discussione

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Il protocollo è stato originariamente presentato effettuata utilizzando 85 proteine ​​del lievito proteine ​​chinasi-V5 fusione unica di confrontare attività di legame attraverso distinte famiglie e connessi di protein chinasi lievito conseguente individuazione di nuove reti di interazione in vivo chinasi 1. Come un emergente tecnologia profilazione proteomica, lo sviluppo di High Throughput (HTP) proiezione del proteoma usando microarrays della proteina invocato librerie peptidiche e eucarioti e pro...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del NIH. I saggi mostrati in Figura 1 sono stati eseguiti dal Dr. Joseph Fasolo. Ringraziamo il Dr. Rui Chen per gli utili commenti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastre di PetriVWRNC-10747o
equivalente Estratto di lievito BactoDifco0217-17
Bacto peptoneDifco0118-17
Bacto agarDifco0140-01
DestrosioSigmaD9434
RaffinosioSigmaR0514
GalattosioSigmaG0750
Sc-UraMP Bio114410622
Piccole provette per colturaVWR/Fisher
Flacone di Erlenmeyer grandeVWR/Fisher
Rotore
Provette per centrifuga (500 ml)
Provetta Falcon (50 ml)VWR/Fisher21008-951
Compresse PBS SigmaP4417
Provette FastPrep (tubo con tappo a vite da 2 ml)
Macchina FastPrepMP Biomedicals116004500
Perline di zirconeBioSpec11079105
Triton X100SigmaP4417
DTTSigmaD9779
MgCl2SigmaM8266 
NaClSigmaS3014 
Imidazolo (pH = 7,4)SigmaI5513 
PMSFSigma93482
Cocktail completo di inibitori (senza EDTA)Roche11873580001
Cocktail di inibitori della fosfatasi 1sigmaP2850
BSASigmaA2153 
Tween-20SigmaP1379 
ATPSigmaA1852 
Incubatrice a scuotimento (30 ° C)
Resina di affinità del nichel LifeTechnologiescolonna R901-01
G25GE scienze della vita27-5325-01 
NutatorVWR/Fisher
SDS-PAGE Gel (NuPage)Life Technologies
Coomassie Blue StainLife Technologies Anticorpo
monoclonale V5Life TechnologiesR960-25
Alexa647 Tagged monoclonale V5 AnticorpoTechnologies451098
Microarray di proteine KitLife TechnologiesPAH0525013
Genepix ScannerMolecular Devices
Lifter scivolaThomas Scientifichttp://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/
tampone di lisi: 0,1% Triton X-100, 0,5 mM DTT,
2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazolo (pH 7,4), cocktail completo di inibitori della proteasi ... Cocktail di inibitori della fosfatasi senza EDTA 1, 1 mM PMSF  (aggiungere appena prima dell'uso)		Aggiungere i reagenti a 1x PBS (tampone fosfato 0,01 M, cloruro di potassio 0,0027 M, cloruro di sodio 0,137 M; pH 7,4) per ottenere il volume desiderato di soluzione di lisi
Tampone bloccante: 1% albumina sierica bovina (BSA), 0,1% Tween-20Aggiungere i reagenti a 1x PBS per ottenere il volume desiderato di tampone
bloccanteTampone sonda: 2 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 0,05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μ M ATP (per chinasi), 1% BSAAggiungere il reagente a 1x PBS per ottenere il volume desiderato di tampone sonda
Tampone di lavaggio: 0,1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 50 mM imidazolo (pH 7,4), 2 mM MgCl2Aggiungere il reagente a 1x PBS per ottenere il volume desiderato di tampone sonda
Tampone di eluizione: 0,1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 - ndash; 500 mM di imidazolo (pH 7,4), cocktail completo di inibitori della proteasi Cocktail di inibitori della fosfatasi senza EDTA 1, 1 mM PMSF (aggiungere appena prima dell'uso)Prima di iniziare, è importante annotare il gradiente di concentrazione di imidazolo (50 – 500 mM) e creare provette separate per ogni concentrazione (si consiglia di creare l'intervallo utilizzando incrementi di 50 mM). Aggiungere il reagente a 1x PBS per ottenere il volume desiderato di tampone sonda
3x YEP +6% galattosio: sciogliere 30 g di estratto di lievito e 60 g di peptone in 700 ml di H2O e sterilizzare in autoclave. Aggiungere 300 ml di filtro sterilizzato al 20% di galattosio (wt/vol)  Il galattosio non deve essere sterilizzato in autoclave
Terreno di estrazione JA-10 Life

Riferimenti

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