Utilizzando microarray proteici contenenti quasi tutta la S. cerevisiae proteoma è sondato per un rapido interrogatori imparziale di migliaia di interazioni proteina-proteina in parallelo. Questo metodo può essere utilizzato per la proteina-piccola molecola, modificazione post-traslazionale, e altri saggi in high-throughput.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Ad alta densità di microarrays della proteina funzionali contenenti ~ 4.200 proteine ricombinanti di lievito vengono esaminati per le interazioni proteina-proteina chinasi utilizzando una proteina di fusione purificate per affinità lievito chinasi contenente un tag V5-epitopi per read-out. Chinasi purificata è ottenuto attraverso la cultura di un ceppo di lievito ottimizzato per alta copia la produzione di proteine ospitare un plasmide contenente una fusione chinasi-V5 costruire sotto un elenco indirizzi globale promotore inducibile. Il lievito viene coltivato in mezzi restrittiva con una fonte di carbonio neutro per 6 ore seguita da induzione con 2% galattosio. Successivamente, la coltura è raccolta e chinasi è purificato mediante affinità standard di tecniche cromatografiche per ottenere una proteina chinasi altamente purificata per uso nel saggio. La chinasi purificata è diluita con tampone chinasi ad una gamma appropriata per il dosaggio e microarray della proteina sono bloccate prima ibridazione con il microarray della proteina. Dopo l'ibridazione, gli array vengono sondati con un anticorpo monoclonale V5 ANTIBody per identificare le proteine legate dalla proteina chinasi-V5. Infine, gli array vengono sottoposti a scansione utilizzando uno scanner microarray standard ei dati vengono estratti per l'informatica a valle dell'analisi 1,2 per determinare una elevata fiducia insieme di interazioni proteiche per la convalida a valle in vivo.
Introduzione
La necessità di effettuare analisi globali di biochimica delle proteine e di attività in vivo legame ha portato allo sviluppo di nuovi metodi di profiling interazioni proteina-proteina (PPI) e le modificazioni post-traduzionali di proteomi interi 1,3-8. Microarrays proteine sono prodotte come microarray proteici funzionali utilizzando proteine funzionali full-length 4-6,8,9 o microarrays della proteina analitiche contenenti anticorpi 10,11. Essi sono progettati per contenere una alta densità di proteine disposte su vetrini da microscopio con una varietà di chimiche superficiali per facilitare una varietà di condizioni....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Preparazione della sonda
- Cultura e purificare le sonde chinasi V5-fusione utilizzate per esaminare le interazioni con altre proteine come segue:
- Utilizzare appena striato ceppo di lievito Y258 (Mata pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) contenenti proteine V5-fusion (espressa da GATEWAY vettoriali pYES-DEST52). Utilizzare la proteina isolata come sonda sui microarray. Piatto il lievito in sintetico complete-uracile (Sc-Ura) / 2% destrosio / Agar e crescere a 30 ° C per 3 giorni di cultura congelati (-80 ° C glicerolo magazzino).
- Seminare colture starter (5-20 ml) da una singola colonia e crescere durante la notte in Sc-Ura / 2% d....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
L'attività di interazione proteina-proteina è stata osservata utilizzando un lettore di chip standard per valutare l'TDA1-V5 proteina chinasi di fusione costrutto come proteina esca contro un lievito microarray proteina funzionale contenente circa 4,200 unica S. cerevisiae proteine di fusione GST-. Ulteriore interrogatorio con il software GenePix rivelato una moltitudine di eventi di intensità variabili vincolanti. L'affinità è stato misurato l'intensità graduata del segnale derivato da un anticorpo monoclona.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il protocollo è stato originariamente presentato effettuata utilizzando 85 proteine del lievito proteine chinasi-V5 fusione unica di confrontare attività di legame attraverso distinte famiglie e connessi di protein chinasi lievito conseguente individuazione di nuove reti di interazione in vivo chinasi 1. Come un emergente tecnologia profilazione proteomica, lo sviluppo di High Throughput (HTP) proiezione del proteoma usando microarrays della proteina invocato librerie peptidiche e eucarioti e pro.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del NIH. I saggi mostrati in Figura 1 sono stati eseguiti dal Dr. Joseph Fasolo. Ringraziamo il Dr. Rui Chen per gli utili commenti.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre di Petri | VWR | NC-10747 | o |
| equivalente Estratto di lievito Bacto | Difco | 0217-17 | |
| Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
| Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
| Destrosio | Sigma | D9434 | |
| Raffinosio | Sigma | R0514 | |
| Galattosio | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura | MP Bio | 114410622 | |
| Piccole provette per coltura | VWR/Fisher | ||
| Flacone di Erlenmeyer grande | VWR/Fisher | ||
| Rotore | |||
| Provette per centrifuga (500 ml) | |||
| Provetta Falcon (50 ml) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| Compresse PBS Sigma | P4417 | ||
| Provette FastPrep (tubo con tappo a vite da 2 ml) | |||
| Macchina FastPrep | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Perline di zircone | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Imidazolo (pH = 7,4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Cocktail completo di inibitori (senza EDTA) | Roche | 11873580001 | |
| Cocktail di inibitori della fosfatasi 1 | sigma | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Incubatrice a scuotimento (30 ° C) | |||
| Resina di affinità del nichel Life | Technologies | colonna R901-01 | |
| G25 | GE scienze della vita | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies Anticorpo | ||
| monoclonale V5 | Life Technologies | R960-25 | |
| Alexa647 Tagged monoclonale V5 Anticorpo | Technologies | 451098 | |
| Microarray di proteine Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter scivola | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| tampone di lisi: 0,1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazolo (pH 7,4), cocktail completo di inibitori della proteasi ... Cocktail di inibitori della fosfatasi senza EDTA 1, 1 mM PMSF (aggiungere appena prima dell'uso) | Aggiungere i reagenti a 1x PBS (tampone fosfato 0,01 M, cloruro di potassio 0,0027 M, cloruro di sodio 0,137 M; pH 7,4) per ottenere il volume desiderato di soluzione di lisi | ||
| Tampone bloccante: 1% albumina sierica bovina (BSA), 0,1% Tween-20 | Aggiungere i reagenti a 1x PBS per ottenere il volume desiderato di tampone | ||
| bloccanteTampone sonda: 2 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 0,05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μ M ATP (per chinasi), 1% BSA | Aggiungere il reagente a 1x PBS per ottenere il volume desiderato di tampone sonda | ||
| Tampone di lavaggio: 0,1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 50 mM imidazolo (pH 7,4), 2 mM MgCl2 | Aggiungere il reagente a 1x PBS per ottenere il volume desiderato di tampone sonda | ||
| Tampone di eluizione: 0,1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 - ndash; 500 mM di imidazolo (pH 7,4), cocktail completo di inibitori della proteasi Cocktail di inibitori della fosfatasi senza EDTA 1, 1 mM PMSF (aggiungere appena prima dell'uso) | Prima di iniziare, è importante annotare il gradiente di concentrazione di imidazolo (50 – 500 mM) e creare provette separate per ogni concentrazione (si consiglia di creare l'intervallo utilizzando incrementi di 50 mM). Aggiungere il reagente a 1x PBS per ottenere il volume desiderato di tampone sonda | ||
| 3x YEP +6% galattosio: sciogliere 30 g di estratto di lievito e 60 g di peptone in 700 ml di H2O e sterilizzare in autoclave. Aggiungere 300 ml di filtro sterilizzato al 20% di galattosio (wt/vol) | Il galattosio non deve essere sterilizzato in autoclave |
Riferimenti
- Fasolo, J., et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes. 25, 767-778 (2011).
- Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. ProCAT: a data analysis approac....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
