Generazione di transgenici Hydra Da Embryo microiniezione

Sommario

Le Hydra transgeniche stabili sono prodotte mediante microiniezione di DNA plasmidico negli embrioni seguita da integrazione genomica casuale e propagazione asessuata per stabilire una linea uniforme. Le idre transgeniche vengono utilizzate per tracciare i movimenti cellulari, sovraesprimere i geni, studiare la funzione del promotore o abbattere l'espressione genica utilizzando l'RNAi.

Abstract

Come membro del phylum Cnidaria, il gruppo gemello di tutti i bilateriani, Hydra può far luce sui processi biologici fondamentali condivisi tra gli animali pluricellulari. Hydra è usato come modello per lo studio della rigenerazione, della formazione di modelli e delle cellule staminali. Tuttavia, gli sforzi della ricerca sono stati ostacolati dalla mancanza di un metodo affidabile per le perturbazioni geniche per studiare la funzione molecolare. Lo sviluppo di metodi transgenici ha rivitalizzato lo studio della biologia dell'idra ¹. Le idre transgeniche consentono il tracciamento di cellule vive, lo smistamento per produrre popolazioni cellulari pure per l'analisi biochimica, la manipolazione della funzione genica mediante knockdown e sovraespressione e l'analisi della funzione del promotore. Il DNA plasmidico iniettato negli embrioni in fase iniziale si integra casualmente nel genoma all'inizio dello sviluppo. Ciò si traduce in piccoli che esprimono transgeni in chiazze di tessuto in uno o più dei tre lignaggi (epiteliale ectodermico, epiteliale endodermico o interstiziale). Il tasso di successo nell'ottenere un cucciolo con tessuto transgenico è compreso tra il 10% e il 20%. La propagazione asessuata del cucciolo transgenico viene utilizzata per stabilire una linea uniformemente transgenica in un particolare lignaggio. Generare Hydra transgenico è sorprendentemente semplice e robusto, e qui descriviamo un protocollo che può essere facilmente implementato a basso costo.

Introduzione

Hydra è stato utilizzato per studiare la rigenerazione, formazione di pattern, e cellule staminali per circa 250 anni ² Hydra ha un piano corpo semplice che consiste di tre linee cellulari:. Epiteliale ectodermica, endodermico epiteliale, e interstiziale. Il corpo tubolare è formato dalla ectodermica e linee dell'epitelio endodermico, ciascuno dei quali è un singolo strato di cellule. Tutte le cellule epiteliali della colonna corpo sono mitotico. Quando le cellule epiteliali vengono spostati nelle estremità ^3, la testa (bocca e tentacoli) alla fine della bocca o il piede (disco basale) alla fine aborale, arrestano nella fas....

Protocollo

1 Preparazione di DNA plasmidico, aghi, e piatti iniezione

1. Preparare il DNA plasmidico utilizzando un kit Maxi alta velocità o Midi e concentrare il DNA a 2,5 mg / ml mediante precipitazione in etanolo. Il pellet di DNA deve essere sciolto in acqua deionizzata priva di nucleasi. Conservare il DNA in 10-20 microlitri aliquote a -20 ° C. (Vedi Tabella supplementare 1 per un elenco di vettori disponibili)
2. Fare un piatto di iniezione utilizzando agarosio per costruire un trogolo per lo svolgimento di embrioni in una capsula di Petri di 100 x 15 mm.
   1. Posizionare un vetrino da microscopio 75 x 50 vetro in un piatto 100 x 15 mm ....

Risultati

Stabilire linee transgeniche Hydra

Alimentare larve transgeniche ogni 2-3 giorni con Artemia nauplii. I piccoli a volte non mangiano per un giorno o due dopo la schiusa. Alcuni nuovi nascituri saranno mai mangiare, e quindi non sopravviverà. Se il cucciolo è transgenico sia nel ectodermica (Figura 1A) o tessuto epiteliale endodermico, permettere all'animale di germoglio e raccogliere le gemme che hanno il tessuto più transgenico (Figura 1B, C).

Discussione

Hydra riproduce asessualmente di routine, ma richiede stimoli ambientali per iniziare la produzione di gameti. Questi stimoli non sono ben definiti, per la maggior parte delle specie Hydra e possono differire da ceppo a ceppo. Un ostacolo significativo alla produzione di transgenico Hydra è l'ottenimento di embrioni su base regolare, perché può essere difficile in un ambiente di laboratorio per indurre Hydra per diventare sessuale. Il ceppo AEP ^25, tuttavia, produce gam.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
AEP Hydra Strain			E-mail: Celina Juliano a celina.juliano@yale.edu o Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
Kit Maxi ad alta velocità	Qiagen	12662
100 x 15 mm Piastre di Petri	BD Falcon	351029
75 x 50 mm Vetro Microscopio Stampo	Sigma	CLS294775X50
Microiniezione	IBI Scientific	FM-600
Vetro borosilicato con filamento	Sutter Instrument	BF100-50-10	O.D.: 1,0 mm, I.D.: 0,50 mm, lunghezza 10 cm
Estrattore per micropipette fiammato/marrone	Strumento Sutter	P-97
Fenolo Rosso	Sigma	P3532
Pinze per gioiellieri, Durmont #5	Sigma	F6521
Lama per bisturi #15	Fisher	50-822-421
Olio minerale	Sigma	M8410-500ML
Microiniettore	Narishige	IM-9B
Supporto magnetico	Narishige	GJ-1
Piastra di ferro	Narishige	IP
Joystick Micromanipolatore	Narishige	MN-151