Un In Vitro Modello per lo Studio della Fisiopatologia Cellulare in Globoid Leucodistrofia cellulare

Summary

Le cellule globoidi sono una caratteristica patologica distintiva della malattia di Krabbe, una leucodistrofia attualmente priva di una terapia efficace a lungo termine. Abbiamo sviluppato un modello di coltura cellulare per studiare la biologia innata e il potenziale patogenetico delle microglia attivate e la loro trasformazione in cellule globoidi.

Abstract

La precisa funzione di microglia multi-nucleata, chiamate cellule globoidi, che sono unicamente abbondanti nel sistema nervoso centrale di leucodistrofia cellulare globoidi (GLD) è chiaro. Questo divario nella conoscenza è stato ostacolato dalla mancanza di un adeguato modello in vitro per lo studio. Qui, descriviamo un sistema di coltura gliale murino primario in cui il trattamento con risultati psicosina in multinucleazione della microglia che ricordano le caratteristiche cellule globoidi trovate in GLD. Con questo nuovo sistema, abbiamo definito le condizioni e le modalità di analisi per lo studio delle cellule globoidi. L'uso potenziale di questo sistema modello è stato validato nel nostro studio precedente, che ha individuato un potenziale ruolo di metalloproteinasi della matrice (MMP) -3 in GLD. Questo nuovo sistema in vitro può essere un modello utile per studiare la formazione e funzione, ma anche il potenziale manipolazione terapeutica di queste cellule uniche.

Introduction

Leucodistrofia cellule Globoid (GLD), nota anche come malattia di Krabbe, è una malattia demielinizzante mortale derivante dalla perdita di funzione mutazioni nel galatocerebrosidase (GALC) gene ^1. La forma più diffusa di GLD è la variante infantile, che è caratterizzata da esordio nella prima infanzia e caratterizzata da un decorso clinico aggressivo del motore e del declino cognitivo che porta alla morte prematura, spesso prima di cinque anni di ^2,3 anni. Il test genetico viene utilizzato per verificare una diagnosi di GLD ^4. Neuropatologia di GLD rivela demielinizzazione diffusa, atrofia neuronale, astrogliosis e la presenza di microglia gonfie multi-nucleate chiamato cellule globoidi ^5-7. L'identificazione delle cellule globoidi, spesso contenenti inclusioni tubulosi nel loro citoplasma, è stata una caratteristica distintiva della GLD negli ultimi 97 anni, anche se la specifica funzione di queste cellule cospicui è rimasta inafferrabile.

Il coinvolgimento di non-myelnari glia (astrociti e microglia) nella patogenesi della GLD è stata a lungo considerata una risposta secondaria alla profonda demielinizzazione in questa malattia ^8. È interessante notare che la prima descrizione di questa malattia, realizzato da Knud Krabbe nel 1916 ^5, la formazione riferito fagociti multinucleate contenenti lipidi detriti che sono stati chiamati 'Globoid cellule' e sono una caratteristica di questa malattia.

Cellule globoidi sono la caratteristica segno distintivo di GLD patologia, anche se il loro ruolo nella GLD è stata a lungo ignorata. È interessante notare che queste cellule sono tra i primi cambiamenti caratteristici CNS tessuto GLD. Questa mancanza di conoscenza può essere dovuto al presupposto che la formazione dei fagociti multinucleate, dette cellule giganti in altre malattie, sono tipicamente considerati come conseguenza della patologia piuttosto che una forza trainante patogeno iniziale ^9. Pertanto, ci sono stati pochi studi che hanno valutato il meccanismo attraverso il whicellule globoidi ch sono formate da fagociti, soprattutto nel SNC di GLD. La procedura descritta in questo rapporto si concentra sull'importanza della formazione delle cellule globoidi nel sistema nervoso centrale e la nostra precedente dimostrazione che psicosina indotta multinucleazione della microglia in vitro e queste cellule esposte livelli più elevati di attività fagocitaria. Coerentemente con queste osservazioni, globoidi cellule nel cervello twitcher spesso contengono residui PAS-positivo, suggerendo elevati livelli di attività fagocitaria. Globoidi cellule si trovano anche ad essere immunopositive di ferritina (un marcatore microglia) ^10, KP-1 / CD68 (un marcatore monociti), e alcuni sono anche positivi per vimentina (una proteina intermedia filamento e marker di astrociti e microglia attivata) ^11, HLA-dra (un recettore di superficie MHCII), e TNF-α ^7, e Iba-1 (una proteina legante calcio-antagonista usato per identificare microglia) ^12. Sulla base di questa collezione di marcatori, cellule globoidi provengono da microglia che si sviluppanoun fenotipo unico.

Nonostante la loro unicità, la funzione e il contributo di GC a GLD patogenesi specifico è stato ampiamente trascurato. Cellule globoidi sono stati pensati per essere una conseguenza secondaria di demielinizzazione cronica. Tuttavia, studi precedenti che esaminano l'associazione temporale delle cellule globoidi alla materia patologia bianco di GLD hanno identificato la presenza di cellule globoidi nel tardo embrionale ai primi periodi post-natale; tempi precedenti l'apoptosi degli oligodendrociti e demielinizzazione conclamata ^13. Così, la sequenza temporale di sviluppo della neuropatologia in GLD suggerisce che le cellule globoidi sono formate in anticipo di demielinizzazione in questa malattia ^14. Ciò ha portato alla nostra ipotesi che la precoce formazione di cellule globoidi in GLD può rappresentare un evento patogeno che definisce piuttosto che una risposta reattiva secondaria a danno degli oligodendrociti ^15. Inoltre, disregolazione delle attività di microglia in GLD è stato considerato un fattor limitando l'efficacia a lungo termine di terapie con cellule staminali hematopeotic per il trattamento di questa malattia ^16. Così, indagando le funzioni cellulari e regolazione della microglia e cellule globoidi, in risposta a psicosina dovrebbe fornire nuove intuizioni nella patogenesi della GLD.

Fino a poco tempo, la mancanza di un modello appropriato in cui studiare la formazione delle cellule globoidi aveva limitato la comprensione della funzione e il contributo di queste cellule alla patologia di GLD preciso. In studi recenti, è stato stabilito che le cellule globoidi-come possono essere formati in risposta diretta a psicosina, una tossina lipidi patogeno che si accumula in GLD. Abbiamo scoperto che la microglia, ma non macrofagi, vengono attivati ​​e trasformati in cellule gliali globoidi in colture primarie in risposta a psicosina ^15. Questa trasformazione in cellule globoidi è risultato essere mediata dalla proteasi extracellulare, metalloproteinasi della matrice (MMP) -3 ^15. Più di recente, abbiamohanno esteso questi risultati e determinato che la microglia e cellule globoidi psicosina attivati ​​sviluppate in questo sistema modello in vitro sono potentemente tossico per gli oligodendrociti e le cellule progenitrici degli oligodendrociti. Quindi, se considerato nel contesto della GLD, la precoce accumulo di psicosina e la formazione di cellule globoidi prima di demielinizzazione sosterrebbe un ruolo primario ed eventualmente patogeni emergenti per microglia in questa malattia.

Noi proponiamo che lo studio della formazione delle cellule globoidi rivelerà nuove informazioni sulla patogenesi della GLD che contribuiranno alla nostra comprensione di questa malattia. Inoltre, questo nuovo modello cellulare di GLD può fornire un nuovo formato da cui nuovi approcci terapeutici per affrontare i cambiamenti patologici in questa malattia potrebbero essere testati. Quindi, in questa relazione forniamo un protocollo dettagliato per lo sviluppo in vitro di cellule globoidi psicosina indotta da colture primarie di cellule gliali non-mielinizzanti.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono animali sono stati eseguiti in conformità con la politica sulla Humane cura e l'uso di animali da laboratorio esposte dall'Ufficio del Laboratorio Benessere degli Animali (NIH) e solo con l'approvazione da Care and Use Committee Animal Istituzionale (IACUC) dell'Università di Connecticut Health Center.

1 Preparazione delle Culture gliali miste

1. Sterilizzare tutti gli strumenti prima dell'uso. Aggiungere 3 ml di soluzione ghiacciata sterile di Hank equilibrata sale (HBSS) non contenenti cationi (Mg ^{2 +} o Ca ^{2 +)} a tre sterili 60 millimetri piastre Petri mantenute sul ghiaccio per mantenere il freddo.
2. Isolare le cortecce da postnatali cuccioli di topo P0-P2, come descritto in precedenza ^17,18.
   NOTA: strutture sottocorticali, come l'ippocampo, non sono incluse in queste culture.
3. Rimuovere con attenzione le meningi e poi trasferire le cortecce isolate di fresco HBSS e dissociare i tessuti enzimaticamente, utilizzando un neural kit di dissezione dei tessuti secondo il protocollo del produttore.
4. Piastra le cellule in sterili T-175 palloni e incubare una notte nei media [Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) con siero fetale bovino al 10% (FBS) contenente 1x penicillina / streptomicina].
5. Sostituire tutti i media il giorno successivo con i media fresca. Continuare a incubare le culture, con cambi regolari di media, per circa 3 settimane o fino a quando viene stabilito un monostrato cellulare.
   NOTA: Questo monostrato sarà composto di astrociti e microglia con uno di circa 10: 1 ratio ^19.

2 Globoid induzione delle cellule gliali in Culture misti

1. Preparare i coprioggetti ECM rivestite.
   1. Immergere coprioggetto circolari con 1 acido sterile N cloridrico (HCl) in una piastra di Petri sterile per 30 min. Lavare coprioggetto con 3x acqua sterile e poi immergere nel 95% EtOH per almeno 20 min. e poi lasciare asciugare all'aria.
   2. Luogo goccioline di diluito matr extracellularemateriali ix (ECM) rivestimento proteina su un foglio di Parafilm (es 150-250 ml / gocciolina di laminina 10 mcg / ml disciolto in tampone fosfato sterile [PBS]). Distribuire le gocce in modo che vetrini non toccare, quando sono immessi su queste goccioline. Posizionare delicatamente ogni coprioggetto secca su una gocciolina con pinze.
   3. Lasciare i coprioggetti sulle goccioline per ca. 4-6 hr all'interno della cappa cultura con la fascia chiusa.
   4. Posizionare i coprioggetti ECM rivestite (lato ECM rivestite up) in ciascuno dei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti. Lavare ogni pozzetto con PBS sterile 3x e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
2. Preparazione di cellule gliali per placcatura su vetrini.
   1. Aspirare il supporto dalle colture gliali e lavare delicatamente le 3x monostrato gliali con 10 ml di PBS sterile. Successivamente, aggiungere 8-10 ml di soluzione di tripsina-EDTA al T-175, e incubare per 5-10 min a 37 ° C.
   2. Quando la maggior parte del monostrato è stato staccato, aggiungere 20 ml di completo supportoal pallone per fermare tripsinizzazione. Raccogliere i supporti contenenti le cellule staccate in un tubo conico da 50 ml e centrifugare per 10 minuti a 300 xg a temperatura ambiente.
   3. Aspirare il sopranatante senza disturbare il pellet, e poi risospendere le cellule in 2 ml di mezzi freschi completo pipettando delicatamente la soluzione con una pipetta P1000.
   4. Determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro e poi risospendere le cellule in terreno completo alla densità desiderata (ad esempio 10 ⁵ cellule / ml). Piastra le cellule sui vetrini ECM rivestite (ad esempio 500 ml in ciascun pozzetto della piastra da 24 pozzetti). Aggiungere ulteriori mezzi freschi completi a ciascun pozzetto per 3-5 giorni di incubazione a 37 ° C, o fino a quando le cellule crescono alla confluenza visivo desiderato.
3. Il trattamento con psicosina.
   1. Ricostituire il psicosina ad una concentrazione magazzino (108,3 mm) in dimetilsolfossido (DMSO). Diluire questo stock in 100% EtOH per fare una scorta di lavoro che può lan essere aggiunti in ogni pozzetto della piastra da 24 pozzetti per ottenere una concentrazione finale di 10 mM.
   2. Al momento di aggiungere il psicosina, agitare delicatamente la piastra di coltura per mescolare il psicosina nella cultura dei media. Supplemento alla psicosina aggiungendo l'equivalente di 10 micron ogni altro giorno per una settimana.
4. Dopo 7 giorni di trattamento psicosina, raccogliere i media e pipetta 500 ml di freddo 4% paraformaldeide (PFA) in ogni pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 20 min per fissare le cellule. Poi, lavare i pozzetti 3 volte con PBS e poi tenere le piastre a 4 ° C fino a quando trattati per immunoistochimica (vedi sotto).
   NOTA: cellule di coltura possono essere raccolti per enzimatici o test ELISA a questo punto se lo si desidera.

3. immunocitochimica (ICC) per visualizzare le cellule Globoid

1. Sostituire PBS con tampone di bloccaggio [+ 0,3% Tween-20 + 5% di siero di capra normale PBS (NGS)], e incubare le cellule per 1 ora a temperatura ambiente.
2. Incubate le cellule fissate in antisieri primaria contro Iba-1 [(1: 1.000) diluita in PBS + 0.3% Tween-20 + 2% NGS] per almeno 1 ora a temperatura ambiente, poi lavare i pozzetti con PBS 3x 5 min / lavare.
3. Aggiungere l'anticorpo coniugato fluorescenza secondaria opportuno identificare il primario etichettatura anticorpi e anti-macchia con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 1: 1.000) per identificare i nuclei. Incubare in soluzione anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente e lavata con PBS 3x 5 min.
4. Montare ogni coprioggetti al microscopio diapositive utilizzando un mezzo di montaggio. Lettura dei vetrini su un microscopio a fluorescenza per l'analisi visive e quantitative.

4 Analisi e caratterizzazione di cellule in coltura primaria Globoid

1. Utilizzare i seguenti tre criteri morfologici per identificare una cella globoidi nella cultura:
   1. Identificare le cellule globoidi usando la microscopia a fluorescenza, mediante l'etichettatura immunopositive per il marcatore microglia, Iba-1 +.
   2. Identificarecellule globoidi come polynucleated (cioè che contengono due o più nuclei positivi DAPI).
   3. Identificare le cellule globoidi da una morfologia arrotondata distinto l'aspetto altamente ramificata di riposo cellule microgliali.
      NOTA: Le cellule possono essere raccolte anche per la superficie cellulare marcatore analisi e quantificazione mediante citometria a flusso da queste culture.
2. Misurare l'attivazione fagocitaria della microglia e cellule globoidi
   1. Per valutare l'attività fagocitaria della microglia psicosina trattati, aggiungere perline di lattice FITC-etichettati ai pozzetti in accordo con le istruzioni del produttore. Aggiungi sfere di lattice fluorescente-coniugati 48 ore prima della fissazione con PFA. Fissare le cellule trattate con perline (come indicato nella sezione 2.4), e il processo di immunocitochimica (come descritto nella sezione 3).
   2. Selezionare anticorpi secondari fluoroforo coniugato in modo che non si sovrappongano gli spettri di emissione a fluorescenza del fluoroforo etichettato perline.
   3. Analyze i profili phagocytotic di Iba-1 + microglia di individuare le cellule che co-localizzano con le perline fluorescenza marcata.
      NOTA: psicosina attiverà microglia. Perline fagocitati saranno definiti nell'ambito mononucleate e multinucleate Iba-1 + cellule in questa impostazione cultura.

5. induzione di Globoid Le cellule ottenute da colture purificate microgliali

NOTA: Un approccio alternativo per decifrare la segnalazione intercellulare tra astrociti e microglia è un altro vantaggio di questo vitro globoidi modello cellulare in. Purificazione di cellule microgliali primarie per replating o co-coltura può essere ottenuto mediante la loro proprietà aderenza minore nella cultura, come descritto nei passaggi seguenti (vedi Sezione 5.2).

1. Raccogliere il supporto dalle confluenti colture gliali miste in tubo da 50 ml e mantenerla a 37 ° C in incubatore.
2. Isolamento microglia da primari Culture gliali miste.
   1. Dopo aver rimosso il supporto da un pallone T175 cultura gliali miste confluenti, aggiungere i media si stringono caldi [comprensivi di supporti completi + 25 mm 4-(2-idrossietil) -1 acido-piperazineethanesulfonic (HEPES) + bicarbonato di sodio 25 mM (Sigma)]. Agitare i flaconi per 3-4 ore in un agitatore orbitale a 100 rpm (37 ° C). Raccogliere i media di questi flaconi scosso in 50 ml provette coniche.
      NOTA: Questo supporto include la microglia meno aderente dai fiaschi.
   2. Spin media a 300 xg per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 2 ml di media-astrociti condizionata (raccolte nella fase 5.1).
   3. Stabilire il numero di cellule acquisiti utilizzando un emocitometro e poi piastra le cellule microgliali su vetrini substrato rivestito (vedi sezione 2.1) per immunocitochimica, o piastra su piastre aderenza e Ultralow per la futura raccolta di cellule globoidi per co-coltura con altri tipi di cellule, come oligodendrociti (come described nella sezione seguente).
      NOTA: Una volta placcato la microglia può essere trattata con psicosina (10 mM) come descritto sopra (vedi sezione 2.3).
3. Co-coltura con oligodendrociti primari per l'analisi di citotossicità.
   NOTA: Collezione di psicosina trattati microglia dalle piastre di aderenza bassi per la successiva co-coltura su colture primarie di oligodendrociti, o cellule progenitrici degli oligodendrociti, può essere utilizzato per esaminare la funzione potenziale citotossico di queste cellule globoidi simili in vitro.
   1. Sviluppare colture di oligodendrociti primarie che utilizzano metodi stabiliti ^18,20. Per ritirare la microglia psicosina trattati, pipettare delicatamente per staccare le cellule aderenti liberamente dal fondo dei pozzetti. Raccogliere le cellule, centrifugare a 300 xg per 10 minuti, e poi risospendere con attenzione nella differenziazione degli oligodendrociti dei media [composto Neurobasal supporti, L-glutammina (1x), B-27 supplemento (1x) e triiodotironina (T3, 10 ng / ml )].
   2. Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro e poi seminare le microglia sulla cultura oligodendrociti a 1 x 10 ⁵ cellule / ml, con un conseguente approssimativa 1: 2 microglia / rapporto oligodendrociti. Incubare come co-coltura per un massimo di 3 giorni.
   3. Fissare le cellule per immunocitochimica (vedere paragrafo 2.4). Raccogliere coltura cellulare supporti per ELISA o analisi chimiche a seconda delle necessità.

Results

Questo protocollo, come scritto, è prevista per circa 36 giorni per completare dall'inizio alla fine (vedere Figura 1: Schema del flusso di lavoro sperimentale). E 'stata la nostra esperienza che lo sviluppo delle cellule globoidi-like "in questo sistema di coltura primaria sia affidabile e riproducibile: la formazione di cellule multinucleate in risposta a psicosina è costantemente osservata con 7 giorni di trattamento.

Colorazione immunocitochimica della microglia con Iba-...

Discussion

Il protocollo qui descritto fornisce un nuovo modello di sistema in cui studiare lo sviluppo e la caratterizzazione funzionale di microglia attivate e cellule globoidi. Lavoro preliminare da Im et al. utilizzando una linea cellulare HEK293 ha fornito un modello per lo sviluppo del presente protocollo per lo studio della formazione delle cellule globoidi ^21. E 'inoltre importante sottolineare che le cellule derivate globoidi nel modello differiscono dalle cellule globoidi native identificabili in ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank' s soluzione salina bilanciata (HBSS) non contenente cationi (Mg2+ e Ca2+).	Tecnologie per la vita	14175-095
Kit di dissociazione del tessuto neurale	Miltenyi	130-092-628
40 μ colino per cellule Fisherbrand		22363547
Hank' s soluzione salina bilanciata (HBSS) contenente cationi (Mg2+ e Ca2+).	Gibco	14025-092
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	11995-065
siero fetale bovino (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Penicilina/Streptomicina	Tecnologie di vita	15070-063
Laminin	Sigma	L2020
Soluzione tripsina-EDTA	Tecnologie di vita	25299-056
Psicosina	Sigma	P9256
Dimetil solfossido (DMSO)	Sigma	D2650
Paraformaldeide (PFA)	Microscopia elettronica Scienza	19208
Siero di capra normale (NGS)	Invitrogen	PCN5000
Iba-1	WAKO	019-19741
Alexa Fluor coniugato antisera	Life Technologies	Vari
mezzi di montaggio	Southern Biotech	OB100-01
Kit di test fagocitici	Cayman Chemicals	500290
HEPES	Sigma	BP310-500