Le cellule globoidi sono una caratteristica patologica distintiva della malattia di Krabbe, una leucodistrofia attualmente priva di una terapia efficace a lungo termine. Abbiamo sviluppato un modello di coltura cellulare per studiare la biologia innata e il potenziale patogenetico delle microglia attivate e la loro trasformazione in cellule globoidi.
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Articolo metodologico
Un In Vitro Modello per lo Studio della Fisiopatologia Cellulare in Globoid Leucodistrofia cellulare
In questo articolo
Sommario
Abstract
La precisa funzione di microglia multi-nucleata, chiamate cellule globoidi, che sono unicamente abbondanti nel sistema nervoso centrale di leucodistrofia cellulare globoidi (GLD) è chiaro. Questo divario nella conoscenza è stato ostacolato dalla mancanza di un adeguato modello in vitro per lo studio. Qui, descriviamo un sistema di coltura gliale murino primario in cui il trattamento con risultati psicosina in multinucleazione della microglia che ricordano le caratteristiche cellule globoidi trovate in GLD. Con questo nuovo sistema, abbiamo definito le condizioni e le modalità di analisi per lo studio delle cellule globoidi. L'uso potenziale di questo sistema modello è stato validato nel nostro studio precedente, che ha individuato un potenziale ruolo di metalloproteinasi della matrice (MMP) -3 in GLD. Questo nuovo sistema in vitro può essere un modello utile per studiare la formazione e funzione, ma anche il potenziale manipolazione terapeutica di queste cellule uniche.
Introduzione
Leucodistrofia cellule Globoid (GLD), nota anche come malattia di Krabbe, è una malattia demielinizzante mortale derivante dalla perdita di funzione mutazioni nel galatocerebrosidase (GALC) gene 1. La forma più diffusa di GLD è la variante infantile, che è caratterizzata da esordio nella prima infanzia e caratterizzata da un decorso clinico aggressivo del motore e del declino cognitivo che porta alla morte prematura, spesso prima di cinque anni di 2,3 anni. Il test genetico viene utilizzato per verificare una diagnosi di GLD 4. Neuropatologia di GLD rivela demielinizzazione diffusa, atrofia neuronale, astrogliosis e la presenza di mic....
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Protocollo
Tutte le procedure che coinvolgono animali sono stati eseguiti in conformità con la politica sulla Humane cura e l'uso di animali da laboratorio esposte dall'Ufficio del Laboratorio Benessere degli Animali (NIH) e solo con l'approvazione da Care and Use Committee Animal Istituzionale (IACUC) dell'Università di Connecticut Health Center.
1 Preparazione delle Culture gliali miste
- Sterilizzare tutti gli strumenti prima dell'uso. Aggiungere 3 ml di soluzione ghiacciata sterile di Hank equilibrata sale (HBSS) non contenenti cationi (Mg 2 + o Ca 2 +) a tre sterili 60 millimetri piastre Petri ....
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Risultati
Questo protocollo, come scritto, è prevista per circa 36 giorni per completare dall'inizio alla fine (vedere Figura 1: Schema del flusso di lavoro sperimentale). E 'stata la nostra esperienza che lo sviluppo delle cellule globoidi-like "in questo sistema di coltura primaria sia affidabile e riproducibile: la formazione di cellule multinucleate in risposta a psicosina è costantemente osservata con 7 giorni di trattamento.
Colorazione immunocitochimica della microglia con Iba-.......
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Discussione
Il protocollo qui descritto fornisce un nuovo modello di sistema in cui studiare lo sviluppo e la caratterizzazione funzionale di microglia attivate e cellule globoidi. Lavoro preliminare da Im et al. utilizzando una linea cellulare HEK293 ha fornito un modello per lo sviluppo del presente protocollo per lo studio della formazione delle cellule globoidi 21. E 'inoltre importante sottolineare che le cellule derivate globoidi nel modello differiscono dalle cellule globoidi native identificabili in .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni della National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 a S.J.C.), del National Institutes of Health (NS065808 a E.R.B.; NS078392 a S.J.C.), fondi di avviamento dell'UConn Health Center (a SJC) e del Kim Family Fund (UCHC a sostegno di K.I.C.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Hank' s soluzione salina bilanciata (HBSS) non contenente cationi (Mg2+ e Ca2+). | Tecnologie per la vita | 14175-095 | |
| Kit di dissociazione del tessuto neurale | Miltenyi | 130-092-628 | |
| 40 μ colino per cellule Fisherbrand | 22363547 | ||
| Hank' s soluzione salina bilanciata (HBSS) contenente cationi (Mg2+ e Ca2+). | Gibco | 14025-092 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| siero fetale bovino (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Penicilina/Streptomicina | Tecnologie di vita | 15070-063 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Soluzione tripsina-EDTA | Tecnologie di vita | 25299-056 | |
| Psicosina | Sigma | P9256 | |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Paraformaldeide (PFA) | Microscopia elettronica Scienza | 19208 | |
| Siero di capra normale (NGS) | Invitrogen | PCN5000 | |
| Iba-1 | WAKO | 019-19741 | |
| Alexa Fluor coniugato antisera | Life Technologies | Vari | |
| mezzi di montaggio | Southern Biotech | OB100-01 | |
| Kit di test fagocitici | Cayman Chemicals | 500290 | |
| HEPES | Sigma | BP310-500 |
Riferimenti
- Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease. Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).
- Duffner, P. K., et al.
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Ristampe e permessi
