Generazione di Enterobacter Sp. YSU auxotrofi Utilizzando Transposon Mutagenesi

Sommario

Enterobacter sp. YSU cresce in glucosio sali minima quantità di terreno. Auxotrofi sono generati trasformandola con transposome che si inserisce in modo casuale nel genoma dell'ospite. Mutanti si trovano di replicazione delle piastre da medie complesso terreno minimo. Geni interrotti sono identificati da salvataggio e sequenziamento del gene.

Abstract

Prototrofici batteri crescono su M-9 sali minimi mezzo addizionato con glucosio (M-9 medio), che viene utilizzato come fonte di carbonio e di energia. Auxotrofi possono essere generati utilizzando un transposome. Il commercialmente disponibile, Tn 5 transposome -derived utilizzato in questo protocollo è costituito da un segmento lineare di DNA contenente una origine di replicazione γ R6K, un gene per la resistenza alla kanamicina e termina due sequenze mosaico, che servono come siti di legame trasposasi. Il transposome, fornito come un complesso proteico DNA / trasposasi, viene introdotta mediante elettroporazione nel ceppo prototrofici, Enterobacter sp. YSU, e si inserisce in modo casuale nel genoma di questo host. I trasformanti sono placcati in replica su Luria-Bertani agar piastre contenenti kanamicina, (LB-kan) e su piastre di agar M-9 medie contenenti kanamicina (M-9-kan). I trasformanti che crescono su piastre LB-kan, ma non su piastre M-9-kan sono considerati auxotrofi. Genomico purificatoDNA da un auxotroph è parzialmente digerito, legata e trasformato in un pir ⁺ Escherichia coli (E. coli) ceppo. L'origine di replicazione R6Kγ permette il plasmide di replicare in pir ⁺ E. ceppi di coli, e il marcatore di resistenza alla kanamicina consente per la selezione plasmide. Ogni trasformante possiede un nuovo plasmide contenente il trasposone affiancato dalla regione cromosomica interrotto. Sanger sequenziamento e il Local Alignment Search Tool di base (BLAST) suggeriscono una identità putativo del gene interrotto. Ci sono tre vantaggi nell'utilizzo di questa strategia mutagenesi transposome. In primo luogo, non si basa sulla espressione di un gene trasposasi dall'host. In secondo luogo, il transposome viene introdotto nel host di destinazione mediante elettroporazione, piuttosto che per coniugazione o trasduzione e quindi è più efficiente. In terzo luogo, l'origine di replicazione R6Kγ rende facile identificare il g mutatoene che è parzialmente recuperato in un plasmide ricombinante. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare i geni coinvolti nelle altre caratteristiche di Enterobacter sp. YSU o di una più ampia varietà di ceppi batterici.

Introduzione

Prototrofici batteri crescono in M-9 sali minimi terreno contenente glucosio (M-9 medio), la conversione del glucosio attraverso percorsi metabolici carbonio centrali per generare precursori, come amminoacidi, acidi nucleici e vitamine, per biosintesi ^1. M-9 terreno contiene cloruro di ammonio come fonte di azoto, sodio e fosfato di potassio come buffer e fonte di fosforo, solfato di magnesio come fonte di zolfo e glucosio come fonte di carbonio e di energia. Luria-Bertani (LB) mezzo è ricco di aminoacidi da tryptone e di vitamine e fattori di crescita da estratto di lievito. Esso supporta la crescita di auxotrofi che non possono sintetizzare aminoacidi, v....

Protocollo

1. elettroporazione di cellule competenti ^5,11

1. Diluire un O / N cultura LB di Enterobacter sp. YSU 1/20 in 50 ml di terreno LB fresco e crescere con agitazione a 120 rpm e 30 ° C ad un OD (600 nm) tra 0,4 e 0,6. Facoltativamente, crescere altri ceppi batterici alla loro temperatura di crescita ottimale.
2. Raffreddare le cellule in ghiaccio per 5 min e centrifugare a 4 ° C e 7.000 xg per 5 min.
3. Eliminare il surnatante, risospendere le cellule in 50 ml di acqua ghiacciata sterile e centrifugare a 4 ° C e 7.000 xg per 5 min. Ripetere questo passaggio.
4. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in un vol....

Risultati

Trasformazione di Enterobacter sp. YSU mediante elettroporazione con il transposome avviato inserimento genoma casuale nel genoma dell'ospite (Figura 1A, B). Un elettroporazione di successo ha prodotto diverse migliaia di trasformanti che crescono su piastre LB-Kan. Per ottenere 300-400, colonie per piastra ben distanziati, la quantità di trasformazione miscela diffusione su ciascuna piastra di agar LB-kan è stato ottimizzato. Ogni trasformante conteneva almeno un inserto trasposoni, ma non era.......

Discussione

Mutagenesi trasposone utilizzando un transposome è uno strumento efficace per la generazione di auxotrofi in Enterobacter sp. YSU e altri tipi di Gram-negativi e batteri Gram-positivi ^3,4. Il processo è stato avviato con l'introduzione della Tn 5 transposome -derived nell'ospite mediante elettroporazione. Per identificare colonie con inserti, il ceppo di destinazione non trasformata doveva essere sensibili alla kanamicina per la selezione per il marcatore di resistenza portata dal tr.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
EZ-Tn5 R6Kγ Epicentro del kit trasposoma ori/KAN-2 Tnp	(Illumina)	TSM08KR
EC100D pir+ Epicentro elettrocompetente di E. coli	(Illumina)	ECP09500	In grado di replicare plasmidi con origine di replicazione R6K&gamma a basso numero di copie
EC100D pir-116 Epicentro elettrocompetente di E. coli	(Illumina)	EC6P095H	In grado di replicare plasmidi con un R6Kγ origine di replica ad un alto numero di copie
5X M-9 Sali	Thermo Fisher	DF048517
Lennox LB Brodo	Thermo Fisher	BP1427-2
Agar	Amresco, Inc.	J637-1KG	Il terreno solido conteneva l'1,6% (p/v) di agar
Kanamicina solfato	Amresco, Inc.	0408-25G	Quando necessario, il supporto conteneva 50 μ g/ml kanamicina solfato
D-glucosio monoidrato	Amresco, Inc.	0643-1KG
Estratto di lievito	Amresco, Inc.	J850-500G
Tryptone	Amresco, Inc.	J859-500G
KCl	Sigma-Aldrich	P4504-500G
NaCl	Amresco, Inc.	X190-1KG
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO2	Fisher Scientific	BP213-1
Brodo super ottimale con repressione dei cataboliti (SOC) medio			0,5% (p/v) estratto di lievito, 2% (p/v) triptone, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 e 20 mM Glucosio
BfuC I	NEB	R0636S	Digestione parziale del DNA genomico
Xho I	NEB	R0146S	Digestione plasmidica
T4 DNA Ligasi	NEB	M0202S
Acqua libera da nucleasi	Amresco, Inc.	E476-1L	Per la dissoluzione del DNA precipitato e le reazioni endonucleasici di restrizione
GenomeLab DTCS - Kit di avvio rapido	Beckman Coulter	608120	Sequenziamento del DNA
Wizard Kit di purificazione del DNA genomico	Promega	A1120A
Wizard Plus SV Minipreps Sistema di purificazione del DNA	Promega	A1460	Purificazione del plasmide
Replica Blocco di placcatura	Thermo Fisher	09-718-1
Quadrati di velluto	Thermo Fisher	09-718-2	Replica placcatura
PetriStickers	Diversified Biotech	PSTK-1100	Griglia per replica placcatura
Petri Piastre	Thermo Fisher	FB0875712
Gene Pulser II	BioRad		Elettroporazione Elettroporazione
Cuvette – 2 mm	BioExpress	E-5010-2
Concentratore di DNA sottovuoto CentriVap	Labconco	7970010	Essiccazione del DNA
CEQ 2000XL Sistema di analisi del DNA	Beckman Coulter		Sequenziamento del DNA
Vettore NTI Advance 11.5.0	Life Technologies	12605099	Analisi della sequenza del DNA