Da un 2DE-Gel Spot Proteine ​​Funzione: Lesson Learned From HS1 nella leucemia linfocitica cronica

Sommario

Qui si descrive un protocollo che le coppie due tecniche di proteomica, cioè 2-dimensionale elettroforesi (2DE) e spettrometria di massa (MS), per identificare differenzialmente espressi / proteine ​​modificate post-traduzionali tra due o più gruppi di campioni elementari. Questo approccio, insieme a esperimenti funzionali, permette l'identificazione e la caratterizzazione di marcatori prognostici / bersagli terapeutici.

Abstract

L'identificazione di molecole coinvolte nell'iniziazione e progressione tumorale è fondamentale per la biologia comprensione della malattia e, di conseguenza, per la gestione clinica dei pazienti. Nel presente lavoro descriviamo un approccio proteomico ottimizzato per l'identificazione di molecole coinvolte nella progressione della leucemia linfocitica cronica (CLL). Nel dettaglio, lisati di cellule leucemiche sono risolte da 2-dimensionale elettroforesi (2DE) e visualizzate come "macchie" sui gel 2DE. Analisi comparativa delle mappe proteomiche permette l'identificazione delle proteine ​​differenzialmente espressi (in termini di abbondanza e modificazioni post-traduzionali) che vengono raccolti, isolato e identificato da spettrometria di massa (MS). La funzione biologica dei candidati individuati può essere controllata con diversi saggi (cioè la migrazione, adesione e polimerizzazione F-actina), che abbiamo ottimizzato per le cellule leucemiche primarie.

Introduzione

Leucemia linfocitica cronica (CLL), la leucemia dell'adulto più comune nei paesi occidentali, deriva dall'accumulo di monoclonali CD5 ⁺ linfociti B neoplastici ed è clinicamente molto eterogenea. Può essere presente come una forma di pre-leucemiche, definito come linfocitosi monoclonale delle cellule B (MBL) ^1,2,3. In altri casi la malattia può apparire sia con un decorso clinico indolente, che può rimanere stabile per anni prima di avere bisogno del trattamento, o come una malattia chemorefractory progressiva con prognosi infausta nonostante la terapia. Infine, si può progredire in un linfoma di alto grado spesso letali (sindrome di Richter-RS) ^2,3,4. I pazienti sono di solito classificati in due sottogruppi principali: il bene e il male prognosi, sulla base di un insieme di fattori prognostici che fornisce informazioni complementari sui predittori di outcome malattia e la sopravvivenza. Eterogeneità clinica probabilmente riflette l'eterogeneità biologica. Un certo numero di genetica, microambientali e cefattori llular hanno dimostrato di concorrere alla patogenesi della malattia anche se sono stati trovati ⁵ meccanismi unificanti. In particolare, diversi studi hanno dimostrato che le differenze nel decorso clinico della malattia può essere in parte spiegato con la presenza (o l'assenza) di alcuni marcatori biologici che hanno un valore prognostico ^6,7,8. Questi dati hanno dimostrato che una migliore comprensione della biologia della malattia potrebbe fornire spunti ulteriori per la gestione clinica della patologia, tramite l'identificazione di entrambi i marcatori prognostici e bersagli terapeutici.

L'obiettivo del presente lavoro è quello di mostrare come una combinazione di diverse tecniche di proteomica può essere utilizzato per l'identificazione di proteine ​​coinvolte nella LLC insorgenza e la progressione. Il nostro approccio dimostra che è possibile unire insieme proteomica di base e dati clinici ^5.

Nella presente flusso di lavoro, primarie cellule leucemiche di pazienti selezionati(Buono vs cattivo prognosi) sono isolati e lisati cellulari vengono poi utilizzati per ottenere mappe proteomiche. 2DE permette la caratterizzazione del profilo proteomico di una popolazione di cellule, comprese le modificazioni post-traduzionali, dando così informazioni indirette sull'attività biologica di ciascuna proteina. Lisati cellulari totali vengono risolti da una prima pista di dimensione in base al punto isoelettrico, seguita da una seconda dimensione eseguito su un gel di poliacrilammide che risolve le proteine ​​in base al loro peso molecolare. Analisi comparativa delle mappe proteomiche permette l'identificazione delle proteine ​​differenzialmente espresse (sia in termini di abbondanza e modificazioni post-traduzionali) come macchie sul gel che possono essere tagliati e analizzati da spettrometria di massa. Il ruolo di ciascun candidato può essere poi sfruttata da diversi saggi.

Tale approccio, limitato alla CLL nel manoscritto corrente, può essere facilmente esteso ad altre malattie / campioni, fornendo così informazioni sulla proteomic / differenze biologiche tra i due gruppi (cioè patologiche vs normale, stimolati vs non stimolato, wild-type vs knockdown).

Protocollo

NOTA: Tutti i campioni di tessuto sono stati ottenuti con l'approvazione del Comitato Etico dell'Ospedale San Raffaele (Milano, Italia).

1 campioni di tessuti umani e purificazione delle cellule (Figura 1)

NOTA: i linfociti leucemiche sono stati ottenuti da sangue periferico (PB) di pazienti affetti da LLC, diagnosticati secondo Mulligan et al ^9.

1.1) La separazione delle cellule leucemiche da PB

1. Raccogliere PB in provette di raccolta del sangue con vacutainer sodio eparina.
2. Trasferire il sangue in una provetta da 15 ml e aggiungere B-cellula umana arricchimento cocktail a 50 ml / ml di sangue intero. Mescolare bene e incubare 20 minuti a temperatura ambiente.
3. Diluire il campione con un uguale volume di PBS + 2% FBS, mescolare il sangue con delicatezza e con attenzione overlay sul Ficoll, facendo attenzione a non rompere l'interfaccia. Utilizzare almeno 1 parte di Ficoll a 2 parti di campione diluito (cioè 4 ml Ficoll + 10 ml di sangue in 15 ml tube).
4. Centrifugare a 400 xg, a temperatura ambiente (20 ° C) per 20 minuti senza freno. Le cellule mononucleari saranno all'interfaccia.
5. Aspirare accuratamente l'interfaccia per recuperare le cellule e inserire in un nuovo tubo. Lavare le cellule una volta con PBS e centrifugare a 300 xg, a 4 ° C al buio per 5 min. Il pellet sarà in basso.
6. Eliminare il surnatante. Risospendere il pellet nel surnatante rimanente muovendo il tubo avanti e indietro con le dita. Diluire il pellet con 10 ml di mezzo completo RPMI (RPMI 1640 supplementato con 10% di siero fetale di vitello e 15 mg / ml di gentamicina) e contare le cellule con il metodo di esclusione Trypan Blue.

1.2) Valutazione Purezza

NOTA: La purezza di tutti i preparati deve essere sempre superiore al 99%.

1. Incubare 100 ml di sospensione cellulare purificata con i seguenti anticorpi (disponibili in commercio, vedi Tabella dei Materiali): CD3 _FITC (5 microlitri / TESt), CD14 _PE (5 ml / test), CD19 _ECD (6 ml / test), CD16-CD56 _PC5 (2 ml / test), CD5 _PC7 (4 ml / test), per 20 minuti a 4 ° C in un tubo FACS.
2. Lavare il campione con 4 ml di PBS (centrifugare per 5 min a 300 xg) e controllare la purezza del flusso cytometry.Check nella trama la% di cellule CLL (> 99%), che co-esprimono CD19 e CD5 sulla loro superficie come mostrato nella Figura 1 (6). Assicurarsi che i preparativi sono praticamente privi di NK, linfociti T e monociti controllando la% di CD3, CD14 e CD16-56 nella trama, che dovrebbe essere vicino allo zero.

1.3) I campioni di archiviazione

1. Per gli studi di proteomica, raccogliere 25 x 10 ⁶ cellule in una provetta da 1,5 ml, cellule centrifugare a 300 xg per 10 min, scartare il surnatante e lyophilize pellet per 4 ore. Conservare a -80 ° C fino all'utilizzo.
2. Per i test di validazione, risospendere le cellule in RPMI completo (quantità dipende l'ulteriore analisi che èscelta) e procedere con il punto 4.

2. elettroforesi bidimensionale (2-DE) (Figura 2)

2.1) Isoelettrofocalizzazione (IEF)

1. Solubilizzare cellule CLL pellet con un volume finale di 380 microlitri di buffer 2-DE (344 ml di una soluzione di RBthio (9 M Urea, Tris 10 mM, 4% CHAPS), 30 ml di 65mm DTT, 6 ml di 2% IPG buffer di ampholine pH 4-7).
2. Applicare campioni di proteine ​​(1 mg) per 18 strisce IPG (pH 4-7) e di eseguire IEF seguente protocollo standard come descritto da Conti et al. ¹⁰
3. Equilibrare le strisce in 2 ml di tampone per l'equilibrazione (EB: 50 mM tampone pH 8.8 Tris-HCl contenente 6 M urea, 30% glicerolo, 2% SDS), integrato con il 2% di fresco DTT, per 15 minuti a RT. Eliminare EB + DTT e aggiungere 2 ml di EB integrato con 2,5% Iodoacetamide. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante.

2.2) SDS-PAGE

1. Asciugare le strisce su carta senza toccare il gel per rimuoverel'eccesso di EB. Caricare ogni striscia sulla cima di un gradiente di gel SDS-PAGE 9-16%. Aggiungere una piccola quantità di SDS-elettroforesi Buffer (Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS 0,1% w / v) sulla parte superiore del gel per facilitare il caricamento del nastro.
2. Sigillare il gel con l'aggiunta di ~ 5 ml di soluzione di agar (0,8%) per evitare di galleggiamento della striscia, quindi montare l'unità elettroforetica e riempire con tampone SDS-elettroforesi. Eseguire la corsa a 60 mA / gel per 4 ore a 4 ° C.
3. Rimuovere il gel dall'unità elettroforetico e inserirlo nella casella colorazione corretta.

2.3) Macchia d'argento per la preparativa Gel

FIXER	50% Metanolo 12% di acido acetico 0,05% formalina	2 ore (o tutta la notte) *
TAMPONE DI LAVAGGIO	35% Ehanol	20 min (ripetere l'operazione per tre volte)
SENSIBILIZZAZIONE	0,02% di sodio tiosolfato	2 min
WASH	H 2 O	5 min (ripetere il passo tre volte)
ARGENTO NITRATO	0,2% di nitrato d'argento 0,076% formalina	20 min
WASH	H 2 O	1 min (ripetere il passaggio due volte)
SVILUPPATORE	6% di sodio carbonato 0,0004% di sodio tiosolfato 0,05% di formalina	Fino a quando la colorazione è sufficiente
Stop	50% Metanolo	30 min
	* 2 ore è il tempo minimo richiesto per la fissazione delle proteine

Tabella 1.

NOTA: spot proteici possono essere visualizzati mediante colorazione gel con MS macchia d'argento compatibile ^11. Tutte le soluzioni necessarieper la colorazione argento sono elencati nella Tabella 1.

1. Preparare circa 200 ml di ciascuna soluzione / gel e procedere come indicato nella tabella 1. Aggiungere con cautela ogni soluzione alla casella di colorazione contenente il gel. Eseguire tutte le incubazioni su una piattaforma oscillante.
2. Dopo la colorazione, rimuovere la soluzione di arresto e lasciare il gel in una soluzione di 1% di acido acetico fino acquisizione.

2.4) Gel Acquisizione e Analisi

1. Acquisire immagini ad alta risoluzione utilizzando un densitometro entro 3 giorni dalla colorazione.
2. Analizzare 2-D modelli di proteine ​​utilizzando il software per i gel 2-DE.
   NOTA: Il software permette una comparazione di immagini veloce e affidabile.
   1. Creare un progetto scegliendo "creare un nuovo progetto" dal menu contestuale. Creare una cartella e importare i gel scegliendo "immagini gel di importazione" con tif, png. o .gel estensione.
   2. Una volta che i gel sono importati e aggiunti al workspasso, eseguire un rilevamento automatico posto selezionando il gel per la rilevazione spot e scegliendo "Modifica> punto> individuare" nel menu.
   3. Successivamente, eseguire uno sfondo sottrazione selezionando dal menu "sfondo sottrarre". Nota: Dopo di che è possibile confrontare più gel e per rilevare differenze o somiglianze di analisi quantitativa e / o qualitativa.

3. Proteina Identificazione mediante MALDI-TOF MS analisi (Figura 3)

3.1) digestione delle proteine

1. Sciacquare il gel con acqua e accise luoghi di interesse da gel sia dal manuale (tagliando con un bisturi pulito) o escissione automatico.
2. Lavare particelle di gel con acqua (100-150 ml), spin down (30 sec a 400 xg) e rimuovere il liquido.
3. Aggiungere un volume uguale (a seconda del volume di gel) di CH ₃ CN ai pezzi di gel e attendere 10-15 minuti fino a quando i pezzi di gel ridursi. Asciugare le particelle di gel ina centrifuga a vuoto.
4. Aggiungi 75-100 ml di Dithioerythritol 10 mM diluito in 50 mM NH ₄ HCO ₃ e incubare per 30 minuti a 56 ° C (riduzione Step). Shrink nuovamente i pezzi di gel con CH ₃ CN come descritto al punto 3.1.3.
5. Procedere con alchilazione con l'aggiunta di 75-100 ml di una soluzione 55 mM Iodoacetamide diluito in 50 mM NH ₄ HCO ₃ e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente al buio.
6. Shrink i pezzi di gel ancora una volta con CH ₃ CN con un volume sufficiente a coprire i pezzi di gel come descritto al punto 3.1.3. Secco in una centrifuga a vuoto.
7. Reidratare le particelle in un tampone contenente 25 mM di NH ₄ HCO _3, 5 mM CaCl _{2, e 12,5 ng /} ml di tripsina a 4 ° C per 20 min. Utilizzare un volume sufficiente di tampone per coprire i pezzi di gel. Rimuovere il surnatante non-assorbita dai pezzi di gel e aggiungere 25 mM NH ₄ HCO _3, 5 mM CaCl ₂ senza tripsina di COVer il gel.
8. Lasciare campioni a 37 ° C per almeno 3 ore (il tempo minimo richiesto per la digestione peptide) per una notte.

3.2) Spettrometria di Massa Analisi (tecnica di goccia secchi)

1. Spot 1 ml aliquota di ogni campione su una piastra MALDI acciaio inox e mescolare con 1 ml di α-ciano-4-idrossicinnamico acido come matrice, preparati nel 50% CH ₃ CN e 0,1% TFA.
2. Ottenere spettri di massa su uno spettrometro di massa MALDI-TOF. Accumulare circa 200 spettri al posto, regolando intensità del laser per evitare la saturazione del segnale o per aumentare il segnale. Spettri Process via software Data Explorer come descritto di seguito:
   1. Importare il file dat ed eseguire la correzione al basale scegliendo "processo> Correzione della linea di base". Calibrare masse utilizzando i prodotti tripsina autolisi e picchi di matrice scegliendo "processo> Calibrazione di massa> calibrazione manuale; selezionare picchi vicino a m / z 855,1 e 2163,1 by lasciato trascinare e selezionare le corrispondenti masse di riferimento, quindi fare clic su "complotto" e "si applicano calibrazione" nella finestra di calibrazione manuale.
   2. Regolare la soglia di rilevamento di picco ("peak> rilevamento di picco"), duplicare la traccia attiva ("visualizzazione> duplicare traccia attiva"), selezionare la nuova traccia ed eseguire il deisotoping ("picco> deisotoping"). Utilizzando la macro "getpeaklist", generare un elenco di masse da utilizzare per l'identificazione. Se necessario, rimuovere manualmente i segnali di rumore raccolte da picchi per pulire la lista e ottenere una migliore identificazione.
3. Identificare le proteine ​​ricercando un database completo di proteine ​​non ridondante con profonda e mascotte come i motori di ricerca ^12.
   1. Utilizzare i seguenti parametri in tutte le ricerche: un mancato clivaggio per ogni peptide, metionina ossidazione come modifica variabile, cisteina carbamidomethylation come modifica fisso e un initiAl tolleranza massa di 50 ppm.

4. citoscheletro Attività saggi (Figura 4)

NOTA: Risospendere le cellule purificate nel passo 1 a completo RPMI (10 ⁶ cellule / 200 ml).

4.1) Migrazione Assay. Questo test consente la quantificazione della capacità migratoria delle cellule analizzate (linfociti). Utilizzare una camera transwell di 6,5 mm di diametro e 5,0 micron dimensione dei pori ed eseguire il test in triplice copia. Ottimizza le dimensioni dei pori e tempo di migrazione (Step 4.1.3) nel caso di diversi tipi di cellule.

1. Preparare la camera inferiore con l'aggiunta di 600 ml di RPMI completo con o senza gli stimoli specifici (cioè SDF-1) per misurare la e la migrazione spontanea indotta rispettivamente.
2. Mettere la camera superiore su di esso e lasciare che il sistema equilibrare per 30 minuti a 37 ° C in incubatore.
3. Seed 10 ⁶ cellule / 200 microlitri nella camera superiore (numero totale delle cellule) e incubarela piastra per 4 ore a 37 ° C in incubatore.
4. Rimuovere la camera superiore, raccogliere i media nella camera inferiore e lavare la camera inferiore una volta con 1 ml di PBS. Raccogliere il PBS nel tubo.
5. Centrifugare 5 minuti a 300 xg, scartare il surnatante e risospendere in 500 microlitri di PBS.
6. Mediante citometria di flusso, contare il numero di cellule migrate dopo 1 min di acquisizione. Nel caso di una popolazione cellulare isolata non è necessario aggiungere alcun anticorpo superficie. Controllare il numero di cellule in un diagramma a punti bidimensionale considerando le disperde laterali delle cellule e il numero di eventi visualizzati in 1 min, che è il numero da utilizzare per il calcolo.
7. Calcolare l'Indice di migrazione (MI) come:
   

4.2) saggi di adesione. Questo test consente di misurare la capacità di adesione delle cellule. Eseguire il test in triplice copia.

1. Pre-coat 96-wells piastra (a fondo piatto) con 50 ml / pozzetto di una delle 2% BSA-PBS (come sfondo) o 1 mg ICAM-1 diluito in PBS, una notte a 4 ° C.
2. Lavare la piastra due volte con PBS e bloccare i siti non specifici con l'aggiunta di 2% BSA-PBS (100 l / pozzetto) per 1 ora a 37 ° C.
3. Nelle cellule frattempo risospendere a 5 x 10 ⁶ / ml in RPMI completo, etichettarli con inseguitore cellulare 1 mM CMFDA-verde e incubare 30 minuti a 37 ° C.
4. Aggiungere 1 x 10 ⁶ cellule / pozzetto ai pozzetti pre-rivestite dopo aver scartato la soluzione di saturazione (punto 4.2.2) e incubare 1 ora a 37 ° C.
5. Quantificare l'adesione utilizzando un lettore ELISA (eccitazione del filtro: 485 nm, filtro di emissione: 535 nm). Eseguire una prima misura sul totale in ingresso (INPUT).
6. Lavare la piastra delicatamente con 2% BSA-PBS (200 ml / pozzetto) 4 volte (x). Eseguire una lettura della piastra dopo ogni lavaggio (Adesione _x).
7. Dopo la sottrazione del fondo per ogni misurazione, calcolare ADHES specificiion (adesione):
   

4.3) test di polimerizzazione. Questo è un saggio colorimetrico che quantifica F-actina polimerizzazione. Eseguire il test in triplice copia.

1. Risospendere 1x10 ^ 6 cellule in 100 ml di pre-riscaldato completo RPMI e aggiungere lo stimolo specifico (ad esempio α-IgM 20 mg / ml) per 10 min.
2. Arrestare la reazione con 400 ml di paraformaldeide al 4% e fissare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente.
3. Lavare 3 volte con PBS (centrifugare a 300 xg per 5 min, 4 ° C).
4. Eliminare le cellule surnatante e permeabilize con PBS-saponina 0,2% (200 ml) in ghiaccio per 2 min.
5. Lavare 3 volte con PBS-saponina 0,1% (centrifugare a 100 xg per 5 min, 4 ° C), scartare il surnatante e risospendere in 100 microlitri di PBS-saponina 0,1%.
6. Colorare con falloidina-AlexaFluor 488 (3 mg / ml) per 30 minuti a T ambienteemperatura nel buio.
7. Lavare 3 volte con PBS-0.1% saponine. Eliminare il supernatante e risospendere in 300 microlitri di PBS.
8. Quantificare la quantità di F-actina mediante citometria a flusso, calcolare l'intensità media Florescence (MFI) del falloidina. Analizzare i dati generati in un singolo appezzamento dimensione per produrre un istogramma basato sull'intensità fluorescente, il valore di MFI viene mostrato nel report grafico.
9. Misurare polimerizzazione F-actina (Δ F-actina) come:
   

Risultati

Abbiamo isolato le cellule B leucemiche primarie formano PB di pazienti affetti da LLC e abbiamo analizzato le mappe proteomiche. I campioni (n = 104) sono stati raggruppati in due sottoinsiemi principali in base alle caratteristiche cliniche di ciascun paziente (cattiva prognosi vs buona prognosi) ed è stata eseguita l'analisi comparativa dei gel 2DE.

L'identificazione analisi ha permesso di spot differenzialmente espressi tra i due sottoinsiemi (in termini di presenza / assenza o ...

Discussione

Lo scopo di questo manoscritto è di descrivere un protocollo ottimizzato per l'identificazione di molecole coinvolte nella patogenesi della LLC, anche se questo approccio può essere esteso ad altre malattie e / o altri tipi di campioni ^16-18. Confrontando i profili proteomici di 2 sottogruppi di pazienti con LLC, buoni vs cattivi prognosi ^19, abbiamo dimostrato che differiscono per lo stato di fosforilazione di HS1 e che la sua attivazione colpisce la migrazione e l'adesione ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acetonitril	MERCK	61830025001730
Bicarbonato di ammonio	SIGMA	A6141-500G
1,4-ditioeritritolo	SIGMA	D9680-5G
Iodoacetamide	SIGMA	I6125-25G
Cloruro di calcio diidrato	SIGMA	223506-25G
Tripsina, grado di sequenziamento	ROCHE	11418475001
α- acido ciano-4-idrossicinnamico	SIGMA	C2020-10G
Acido trifluoroacetico	SIGMA	T6580
ZipTipµ-C18	MILLIPORE	ZTC18M096
RosettaSep Cocktail di arricchimento di cellule B umane	STEMCELL	15064
PBS	EUROCLONE	ECB4004L
FBS	DOMINIQUE DUTSCHER	S1810
Lymphoprep	SENTINEL DIAGNOSTICS	1114547
Trypan Blue	SIGMA	T8154
CD19	BECKMAN COULTER	082A07770	ECD
CD5	BECKMAN COULTER	082A07754	PC5
CD3	BECKMAN COULTER	082A07746	FITC
CD14	BD	345785	PE
CD16	BECKMAN COULTER	082A07767	PC5
CD56	BECKMAN COULTER	082A07789	PC5
Ettan IPGphor 3 Unità di messa a fuoco isoelettrica	GE-Healthcare	11-0033-64
Urea	SIGMA	U6504
Tris-HCL Tampone	BIO-RAD	161-0799
CHAPS	SIGMA	C2020-10G
DTT	SIGMA	D9163-5G
IPGstrips	GE-Healthcare	17-1233-01	pH lineare 4-7 18cm
IPGbuffer	GE-Healthcare	17-6000-86	pH 4-7
Glicerolo	SIGMA	G6279
PROTEAN II XL Cell	BIO-RAD	165-3188
SDS	INVITROGEN	NP0001
Acrilammide	BIO-RAD	161-0156
Agarosio	INVITROGEN	16500
Metanolo	SIGMA	32213
Acido acetico	VWR	631000
Formalina	BIO-OPTICAL	05-K01009
Etanolo	VWR	9832500
Tiosolfato di sodio	FLUKA	72049
Nitrato d'argento	FLUKA	85228
Dinamica molecolare Densitometro laser SI personale	Amersham Biosciences
ImageMaster 2D Platinum 5.0	Amersham Biosciences
Carbonato di sodio	MERCK	A0250292
MALDI-TOF Voyager-DE STR	Applied Biosystems
Data Explorer software (versione 3.2)	Applied Biosystems
camera transwell diametro 6,6 mm	CORNING	3421
RPMI	EUROCLONE	ECB2000L	CON L-GLUTAMMINA
Gentamicina	SIGMA	G1397
SDF-1	PREPROTECH	300-28A
Piastra a fondo piatto a 96 pozzetti	BECTON DICKINSON	353072
BSA	SANTA CRUZ	9048-46-8
ICAM-1	R& D Systems	720-IC
CMFDA	Life Thechnology	C7025	IgM verde
	SOUTHERNBIOTECH	2020-02
Paraformaldeide	SIGMA	P6148
Saponina	SIGMA	S-7900
Falloidina	Vita Tecnologia	A12379	Alexa fluor 488