Proteine arginina metilazione, catalizzata da una classe di enzimi viz., Proteina arginina metil transferasi (PRMTs), è il processo di aggiunta enzimatica di gruppi metile (s) per arginines all'interno di proteine. Il test in vitro metilazione è lo strumento più affidabile per valutare lo stato di metilazione di substrati PRMT noti o nuovi.
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Articolo metodologico
In vitro metilazione Assay per studiare proteine Arginina Metilazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Proteina arginina metilazione è una delle più abbondanti modificazioni post-traduzionali nel nucleo. Proteine arginina metilazione può essere identificato e / o determinato mediante approcci di proteomica, e / o immunoblotting con anticorpi specifici metil-arginina. Tuttavia, queste tecniche a volte possono essere fuorvianti e spesso fornire risultati falsi positivi. Soprattutto, queste tecniche non possono fornire prove dirette a sostegno della specificità di substrato PRMT. In vitro test di metilazione, d'altra parte, sono saggi biochimici utili, che sono sensibili, e costantemente rivelano se le proteine identificate sono davvero substrati PRMT. Un tipico test di metilazione in vitro comprende purificati, PRMTs attivi, substrato purificato e un radioisotopo marcato donatore di metile (S-adenosil-L-[metil-3 H] metionina). Qui si descrive un protocollo step-by-step per isolare PRMT1 cataliticamente attivo, un membro della famiglia PRMT ubiquitariamente espresso. Il meThyl attività transferasi del PRMT1 purificato sono stati successivamente testati su Ras-GTPasi attivando binding protein 1 (G3BP1) proteina, un substrato PRMT noto, in presenza di S-adenosil-L-[metil-3H] metionina come donatore di metile. Questo protocollo può essere impiegato non solo per stabilire lo stato di metilazione di nuovi substrati PRMT1 fisiologici, ma anche per comprendere il meccanismo di base della proteina arginina metilazione.
Introduzione
Proteine metilazione è stata descritta per la prima nel 1968 1. Fu solo la prima clonazione di PRMT1 nel 1996, che i ricercatori hanno cominciato ad apprezzare l'importanza di questa modificazione post-traslazionale 2. È interessante notare che circa il 2% dei residui di arginina nelle proteine di estratti nucleari sono metilato 3, che indica l'abbondanza di questa modifica. L'arginina è un aminoacido carico positivamente con una catena laterale di base ei azoto / s all'interno delle catene laterali di arginina può essere post-traduzionali modificato mediante l'aggiunta di un gruppo metile, un processo noto com....
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Protocollo
1 Preparazione di costrutti di espressione
- Prima di iniziare il protocollo, PRMTs clone in vettori di espressione di mammifero con un epitopo tag N-terminale (Myc o HA), e il substrato in-frame con glutatione-S-transferasi (GST) per l'espressione di proteine di alto livello e la purificazione da cellule batteriche lisati, utilizzando tecniche di biologia molecolare standard.
2 Purificazione di PRMTs
- Usare piatti 100 mm di coltura per mantenere le cellule umane epiteliali bronchiali (Beas2B). Passage le cellule ogni 3 giorni e non lasciarli crescere a confluenza.
- Il giorno prima della trasfezione....
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Risultati
Le capacità di HA-PRMT1 a metilato GST-G3BP1 sono stati determinati da un test in vitro metilazione in. PRMT1 HA-tag purificata da lisati cellulari Beas2B è stato impiegato in una reazione di metilazione contenente GST-G3BP1, e 1 μCi di S-adenosil-L-[metil-3 H] metionina, come donatore di metile. PRMT1 potrebbe efficacemente catalizzare la metilazione di GST-G3BP1 (Figura 1, pannello superiore). Reazioni di metilazione mediante pull-down eseguite su lisati di vuoto vet.......
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Discussione
Il protocollo qui descritto è abitualmente utilizzato per stabilire lo stato di metilazione dei substrati PRMT identificati. Questo test robusto e coerente fornirà anche prove definitive sulla specificità del PRMTs per i loro substrati. I componenti chiave per il successo di questo test sono: 1 Espressione di PRMTs in cellule di mammifero, 2 attività di PRMTs purificati, 3 Espressione e purificazione di substrato, e 4 completo trasferimento occidentale delle proteine alla membrana di nitrocellulosa.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto da un Merit Award dalla US Department of Veterans Affairs, e un NIH concedere R01CA138528 a RW.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| S-adenosil-L-[metil-3H] metionina | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
| Dispenser per flaconi | National Diagnostics | LS-900 | |
| AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
| Fiale a scintillazione da 6 ml | Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
| GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
| L-Glutatione ridotto | Sigma | G4251 | |
| Lipofectamina | Invitrogen | Reagente di trasfezione | |
| Beas2B | ATCC | ||
| Optimem | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals | ||
| SDS | Sigma | ||
| Sodio desossicolato | Sigma | ||
| PMSF | Sigma | ||
| matrice di affinità anti-HA | Roche Tris | ||
| Sigma | |||
| Nacl Sigma | |||
| Bio-rad gel doc | Bio Rad | ||
| anti-HA anticorpo | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
Riferimenti
- Paik, W. K., Kim, S. Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme. J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).
- Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TI....
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Ristampe e permessi
