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Articolo metodologico

Tecniche sperimentali e di imaging per l'esame Strutture coagulo di fibrina in normali e patologiche Uniti

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DOI:

10.3791/52019

1 aprile 2015

In questo articolo

Sommario

In questo manoscritto vengono presentate tecniche sperimentali, tra cui la preparazione del sangue, la microscopia confocale e l'analisi della velocità di lisi, per esaminare le differenze morfologiche tra strutture di coaguli normali e anormali dovute a stati patologici.

Abstract

La fibrina è una proteina della matrice extracellulare responsabile del mantenimento dell'integrità strutturale dei coaguli di sangue. Negli ultimi anni sono state fatte molte ricerche sulla fibrina, tra cui lo studio della sintesi, della struttura-funzione e della lisi dei coaguli. Tuttavia, c'è ancora molto da sapere sulle caratteristiche morfologiche e strutturali dei coaguli che derivano dai pazienti con malattia. In questo studio di ricerca, vengono presentate tecniche sperimentali che consentono l'esame delle differenze morfologiche delle strutture anormali dei coaguli dovute a stati patologici come il diabete e l'anemia falciforme. Il nostro studio si concentra sulla preparazione e la valutazione di coaguli di fibrina al fine di valutare le differenze morfologiche utilizzando vari saggi sperimentali e microscopia confocale. Inoltre, viene descritto anche un metodo che consente il calcolo continuo e in tempo reale dei tassi di lisi nei coaguli di fibrina. Le tecniche qui descritte sono importanti per i ricercatori e i medici che cercano di chiarire le patologie trombotiche concomitanti come infarti del miocardio, cardiopatia ischemica e ictus in pazienti con diabete o anemia falciforme.

Introduzione

Lesioni a rivestimento endoteliale di un vaso sanguigno viene riparato attraverso la risposta emostatico, o la formazione di un coagulo di sangue. Quando il sangue permea nella matrice extracellulare, fattori tissutali attivano piastrine nel sangue che facilitano l'iniziazione della cascata coagulativa. Il componente chiave meccanica di questo processo di guarigione è la matrice di fibrina, composto da fibre di fibrina che sono altamente elastica, e può sostenere le grandi forze 1-4. Molti ricercatori hanno studiato la struttura di formazione, e la funzione di fibrina ampiamente negli ultimi decenni 5-13.

I pazie....

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Protocollo

NOTA: Il seguente protocollo aderisce alle linee guida stabilite dal Institutional Review Board (IRB) presso la Georgia Tech.

1. Raccolta di sangue e Blood Red isolamento delle cellule Procedura

  1. Raccogliere 40-120 ml di sangue da donatori in 10 ml vacutainer eparina. Inizia PBMC (cellule mononucleate del sangue periferico) isolamento entro 4 ore di raccolta. Durante questo tempo, mantenere il sangue a RT.
    NOTA: O / N stoccaggio di sangue in RT o 4 ° C non è raccomandato in quanto questo si tradurrà in minori rendimenti PBMC.
  2. Diluire sangue intero 1: 1 in ghiaccio freddo (4 ° C) PBS sterile.
  3. ....

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Risultati

Microscopia confocale Analisi di glicata fibrina Strutture Clot

Le immagini microscopia confocale di coaguli normali e glicate sono presentati in Figura 3. Microscopia confocale dei coaguli normali e glicate rivela che coaguli glicate sono più densi con pori inferiori ai coaguli normali con e senza l'aggiunta di FXIIIa durante la polimerizzazione coagulo. Nella Figura 3A e 3B, vi è una concentrazione di fibrina inferiore che crea una struttu.......

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Discussione

Per ottenere dati significativi sulla struttura dei meccanismi di coagulazione in stati di malattia, è importante isolare i fattori coinvolti nella coagulazione per determinare gli effetti delle proteine ​​e cellule in queste condizioni. Questo protocollo è stato sviluppato per i fini della valutazione della struttura del coagulo di fibrina in stati diabetici e SCD in vitro.

E 'necessario comprendere i meccanismi coinvolti nella formazione di fibrina e fibrinolisi in stati patologic.......

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare il Lam Lab della Georgia Tech per le molte utili discussioni nello sviluppo dei saggi sperimentali. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Heart, Lung, and Blood Institute del National Institutes of Health con il numero di premio K01HL115486 e dal New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 dell'Ufficio del Direttore, National Institutes of Health. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
PBSLife Technologies10010031
Ficoll-Paque (polisaccaride idrofilo)GE Healthcare45-001-749
Provette vacutainer eparinizzate da 10 mlBD Biosciences366643
Laboratori di ricerca sugli enzimidel fibrinogeno umanoN/A
Alexa Fluor 488 Sonde molecolari coniugate di fibrinogeno umanoF13191
Provetta per microcentrifuga graduata da 0,5 mlFisher Scientific05-408-120
Glucosio in polvereLife Technologies15023-02
FXIIIaEnzyme Research LaboratoriesN/A
VIS Microscopio confocaleZeiss LSM 510LSM 510
50 mM TrisLonzaS50-642
Cloruro di calcio (CaCl2)Sigma Aldrich449709-10G
Vybrant DiD soluzione per la marcatura cellulareLife TechnologiesL7781
PlasminEnzyme Research LaboratoriesN/A
Cloruro di sodio (5 M NaCl)Life TechnologiesAM9759
Software di modellazione statisticaIBMSPSS Statistics 22

Riferimenti

  1. Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
  2. Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers.

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Ristampe e permessi

Tag

Microscopia confocalevelocità di fibrinolisicoaguli glicatianemia falciformediabete mellitotrombosiemostasiimaging in tempo realepolimerizzazione del coagulolisi indotta dalla plasmina