Piccoli organoidi cripta intestinali in coltura ex vivo fornire un sistema di coltura tessuto che racchiude in sintesi la crescita delle cripte dipendenti sulle cellule staminali e la loro nicchia. Abbiamo stabilito un metodo per dosare il profilo metabolico in tempo reale in organoidi cripta del mouse primario. Abbiamo trovato organoidi mantengono le proprietà fisiologiche definite dalla loro fonte.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Real Time Analisi di profilo metabolico in Ex Vivo Culture del mouse intestinale Cripta organoide
In questo articolo
Sommario
Abstract
La mucosa dell'intestino tenue presenta un'architettura ripetitiva organizzata in due strutture fondamentali: villi, sporgenti nel lume intestinale e composti da enterociti maturi, cellule caliciformi e cellule enteroendocrine; e cripte, che risiedono in prossimità del sottomucosa e muscolare, l'ospitare staminali adulte e cellule progenitrici e cellule mature Paneth, così come stromali e cellule del sistema immunitario del microambiente cripta. Fino agli ultimi anni, studi in vitro di piccolo intestino era limitato a linee cellulari derivate da tumori benigni o maligni, e non rappresentano la fisiologia dei normali epiteli intestinali e l'influenza del microambiente in cui risiedono. Qui, dimostriamo un metodo adattato da Sato et al. (2009) per la coltura di organoidi cripta del mouse intestinali primarie derivate da topi C57BL / 6. Inoltre, vi presentiamo l'uso di colture organoide cripta di saggiare il profilo metabolico cripta in tempo reale per misurazione del consumo basale di ossigeno, glicolisi, la produzione di ATP e la capacità respiratoria. Organoidi mantengono proprietà definite per la loro origine e conservano gli aspetti del loro adattamento metabolico riflessa dal consumo di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare. In tempo reale studi metabolici in questo organoide sistema di coltura cripta sono un potente strumento per studiare il metabolismo energetico organoide cripta, e come possono essere modulati da fattori nutrizionali e farmacologici.
Introduzione
Cancro del colon-retto (CRC) è la terza causa di decessi per cancro correlati negli Stati Uniti. Cancro del colon sporadica - vale a dire che derivanti nel corso della vita (> 50 anni di età) e senza fattori predisponenti genetici chiare - conti per ~ 80% di tutti i casi, con un'incidenza fortemente influenzata da abitudini alimentari a lungo termine 1,2. Questi tumori presentano uno spostamento metabolico verso dipendenza glicolisi ossidativa, noto come effetto Warburg, che può in parte rendere concentrazioni elevate di particelle elementari cellulari e di energia disponibili (attraverso glutaminolysis) permettere e forse guidare alti tassi d....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Questo studio è stato eseguito in conformità con le raccomandazioni nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato approvato dalla commissione etica della sperimentazione animale del Albert Einstein College of Medicine.
1. Isolamento Cripta e Cultura
- Isolamento delle Cripte dal piccolo intestino:
- Isolare cripte intestinali da qualsiasi modello di topi di interesse. Eutanasia i topi con CO 2 seguita da dislocazione cervicale.
- Aprire l'addome longitudinalmente e riempire il piccolo intestino (SI) con soluzione fisiologica fre....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Organoidi cripta sono state stabilite da 8 mesi C57BL / 6 topi nutriti purificato roditore dieta American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Organoidi cripta intestinali possono essere coltivate in coltura per lunghi periodi da un unico crypt (Figura 1A, singola freccia rossa). Organoidi crescono strutture cripta-come in 18-20 giorni in coltura (Figura 1B, frecce rosse). Cripte sono stati diversi passaggi ogni 3 settimane e organoidi recuperati in modo efficiente dopo ogni passaggio. .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Abbiamo testato il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) delle cripte isolate da 8 mesi topi e cresciuti in organoidi ex vivo. Dopo la misurazione del tasso basale, il metabolismo cripta è stata valutata con l'aggiunta di oligomicina, il cianuro di carbonile -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) e rotenone, in sequenza.
Basale OCR e ECAR basale sono stati registrati 0-29 min (Figura 2A e 2B). A.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Non ci sono informazioni.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni RO1 CA 135561, R01 CA151494, R01 CA174432 e P3013330 dal National Institutes of Health.
Vorremmo ringraziare Michele Houston, Elena Dhima e Dott.ssa Anna Velcich per i loro preziosi commenti nello sviluppo del protocollo di isolamento cripta.
Ringraziamo anche la formazione del diabete e Centro di Ricerca del Albert Einstein College of Medicine sostenuto da NIH P60DK20541, e il dottor Michael Brownlee e il dottor Xue Liang-Du, che dirigono e operano la struttura Seahorse, rispettivamente.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BD Matrigel Matrice di membrana basale, GFR, senza rosso fenolo, senza LDEV | BD Biosciences | 356231 | |
| PBS (soluzione salina tamponata con fosfato), senza magnesio, senza calcio, pH 7.2 | Life Technologies | 20012-027 | |
| Advanced DMEM/F-12 (1x) | Life Technologies | 12634-028 | |
| Dulbecco′ s Aquila modificata′ s Terreno senza glucosio, L-glutammina, rosso fenolo, piruvato di sodio e bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Sale sodico rosso fenolo | Sigma-Aldrich | P4758 | Concentrazione finale 15 mg/l in DMEM (D5030) - step 2.2.2 |
| Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml | Life Technologies | 15240-062 | Concentrazione finale 1x o 2x |
| Penicilina-Streptomicina, liquid | Life Technologies | 15140-122 | Concentrazione finale 1x |
| Gibco® GlutaMAX&commercio; integratore | Life Technologies | 35050061 | Concentrazione finale 1x |
| Gibco® HEPES (acido N-2-idrossietilpiperazina-N-2-etano solfonico), 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Concentrazione finale 10 mM |
| N-acetil-L-cisteina, 25 g | Sigma-Aldrich | A9165-25G | Concentrazione finale 1 mM |
| 100x N-2 integratore, liquido | Invitrogen | 17502-048 | Concentrazione finale 1x |
| 50x B-27® integratore meno vitamina A, liquido | Invitrogen | 12587-010 | Concentrazione finale 1x |
| R-spondina 1 di topo ricombinante, CF, 50 μ g | R& D Systems | 3474-RS-050 | Concentrazione finale 500 ng/ml |
| EGF murino ricombinante, 100 μ g | Peprotech | 315-09 | Concentrazione finale 50 ng/ml |
| Noggin murino ricombinante, 20 μ g | Peprotech | 250-38 | Concentrazione finale 100 ng/ml |
| Gibco® L-glutammina, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Concentrazione finale 2 mM |
| Gibco® polvere di glucosio | Life Technologies | 15023-021 | Concentrazione finale 5 mM |
| Ambion® 0,5 M EDTA (acido etilendiamminotetraacetico), pH 8,0 | Life Technologies | AM9260G | Concentrazione finale 3 mM per step 1.1.5; 2 mM per step 1.1.8 |
| [header] | |||
| DTT (ditiotreitolo), 1M | Life Technologies | P2325 | Concentrazione finale 3 mM |
| Albumina da siero bovino (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | 0.1% in PBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | 1% in PBS |
| Recovery™ Congelamento di colture cellulari Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Inibitore di ROCK (Y-27632) | Sigma-Aldrich | Y0503 | Concentrazione finale 10 μ M |
| Oligomicina | Sigma-Aldrich | O4876 | Concentrazione finale 1 μ M |
| Cianuro di carbonile-p-trifluoro-metossi-fenil-idrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | Concentrazione finale 1 μ M |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Concentrazione finale 1 μ M |
| Idrossido di sodio | Sigma-Aldrich | 221465 | Concentrazione finale 0,1 N in PBS |
| XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer) | Seahorse Bioscience |
Riferimenti
- Jemal, A., et al. CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).
- Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. Eating patterns and risk of colon cancer. Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
