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Articolo metodologico

Che caratterizza la composizione molecolare di motori su Moving assonale Cargo Utilizzo dell'analisi "Cargo Mapping"

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DOI:

10.3791/52029

⸱

30 ottobre 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Experimental Medicine, Dorris Neuroscience Center, The Scripps Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 3Department of Bioengineering, University of California San Diego, 4Department of Neurosciences, University of California San Diego School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il trasporto intracellulare di carichi, come vescicole o organelli, è effettuato da proteine motrici molecolari che seguono i microtubuli polarizzati. Questo protocollo descrive la correlazione della direzionalità del trasporto delle singole particelle di carico che si muovono all'interno dei neuroni, con la quantità relativa e il tipo di proteine motorie associate.

Abstract

La comprensione dei meccanismi attraverso i quali motori molecolari coordinano le loro attività per il trasporto di carichi vescicolari all'interno dei neuroni richiede l'analisi quantitativa delle associazioni motore / carico a livello delle vescicole singolo. Lo scopo di questo protocollo è quello di utilizzare la microscopia a fluorescenza quantitativa correlare ("mappa") la posizione e la direzionalità del movimento di carico vivo per la composizione e la quantità relative di motori associati allo stesso carico. "Mappatura Cargo" è costituito da immagini in diretta di carichi fluorescente che si muovono in assoni coltivate su dispositivi microfluidici, seguita da una sintesi chimica durante la registrazione di movimento dal vivo, e la successiva immunofluorescenza (IF) colorazione delle esatte regioni assoni stessi con anticorpi contro i motori. Colocalizzazione tra i carichi e relativi motori è valutata assegnando posizione sub-pixel coordinate ai canali del motore e del carico, da funzioni gaussiane di montaggio per la diffrazione-lile funzioni di punto di spread tata che rappresentano le singole fonti puntuali fluorescenti. Del carico e del motore le immagini fisse vengono successivamente sovrapposte a trame di movimento merci, di "mappare" ai loro traiettorie tracciate. Il punto di forza di questo protocollo è la combinazione di live e se i dati di registrare sia il trasporto di carichi vescicolari in cellule vive e per determinare i motori associati a queste stesse vescicole esatte. Questa tecnica supera sfide precedenti che utilizzano metodi biochimici per determinare la composizione media del motore di eterogenee popolazioni di vescicole rinfusa purificati, come questi metodi non rivelano composizioni su singoli carichi in movimento. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per l'analisi di altre vie di trasporto e / o di traffico in altri tipi di cellule di correlare il movimento delle singole strutture intracellulari con la loro composizione proteica. Le limitazioni di questo protocollo sono la relativamente bassa velocità a causa delle basse efficienze di trasfezione di colturaneuroni primari e un campo di vista limitato disponibile per imaging ad alta risoluzione. Le applicazioni future potrebbero includere metodi per aumentare il numero di neuroni che esprimono carichi fluorescente.

Introduzione

Trasporto intracellulare è fondamentale in tutti i tipi di cellule per la consegna di proteine, membrane, organelli e molecole di segnalazione a diversi domini cellulari 1. I neuroni sono altamente specializzati cellule con lunghi, proiezioni polarizzate che critica dipendono da trasporto intracellulare dei carichi essenziali per la loro consegna a lunga distanza per vari microdomini assonale. Questo trasporto è mediata da kinesins e dineine - due grandi famiglie di proteine ​​motore molecolare - che si legano ai carichi e tenere traccia lungo i microtubuli polarizzati in anterograda e retrograda direzioni, rispettivamente. Mentre il movimento retrogrado è mediata principalmente da dineina, il movimento in direzione anterograda è facilitato da una famiglia numerosa e funzionale gamma di motori kinesin. Di conseguenza, il trasporto anterogrado di carichi assonale potrebbe essere mediata da vari membri della famiglia della superfamiglia kinesin 1-5. Sebbene alcuni carichi muovono costantemente in entrambe le direzioni, mcarichi ost si muovono in modo bidirezionale e invertono spesso nel loro cammino verso la loro destinazione finale 1,5-13. Inoltre, è stato dimostrato che i motori di opporsi direzionalità collegata simultaneamente a carichi, sollevando la questione di come il movimento regolato di carichi è coordinata da motori opposto polarità 5-7. Insieme, il trasporto di carichi assonale è un processo concertato che è regolato dalla composizione dei motori e delle loro attività biochimiche specifiche, che a loro volta dipendono da vari adattatori e partner di legame normativi 14.

Per descrivere fedelmente il meccanismo di trasporto assonale per un carico specifico e per scoprire la regolazione di fondo di tale trasporto è fondamentale per determinare la composizione di proteine ​​motore e dei loro partner di legame regolamentazione associati con i singoli carichi durante il trasporto di animali vivi. Altri metodi, ad esempio approcci biochimici, forniscono stime di mot mediao composizioni su popolazioni purificate vescicole eterogenee, ma queste stime non rivelano il tipo o la quantità di motori associati a vescicole si muovono singoli. Inoltre, la ricostituzione del trasporto delle vescicole lungo i microtubuli preassemblati in vitro abilitata la misurazione della quantità di un tipo di motore su un unico livello vescicole 15. Tuttavia, questi esperimenti non correlavano direttamente la quantità di motori con caratteristiche di trasporto di questi vescicole, e misurato il trasporto in assenza di fattori regolatori cellulari.

Un protocollo è presentato qui, che determina la composizione del motore (tipo e la quantità relativa di motori) delle vescicole spostano singoli da immunofluorescenza (IF) dati di misura endogenamente espressi proteine ​​motrici, e correla questi parametri al trasporto vivo degli stessi esatti vescicole in neuroni 16. Questo metodo comporta precisa mappatura dei dati IF-to-live il movimento del carico. Questo si ottiene growing neuroni dell'ippocampo di topo in dispositivi microfluidici seguenti protocolli 17-19 stabiliti. Questi dispositivi consentono l'identificazione e la correlazione ("mappatura") degli assoni e dei singoli carichi in movimento in modalità microscopia luce fissa e dal vivo (Figura 1). Neuroni in coltura sono trasfettate con modo fluorescente proteine ​​cargo con etichetta il cui trasporto è ripreso ad alta risoluzione spaziale e temporale per ottenere le informazioni dettagliate movimento che viene tracciata in kymographs. Nel corso delle immagini, i neuroni sono fissate con paraformaldeide, e successivamente colorate con anticorpi contro proteine ​​motrici endogene. Del carico e del motore le immagini fisse sono sovrapposte su kymographs dal vivo movimento di "mappare" (colocalizza) li al carico dal vivo movimento traiettorie 16. Per correlare il movimento in tempo reale dei carichi con l'associazione di proteine ​​motrici, co-localizzazione viene analizzato utilizzando un pacchetto software MATLAB su misura chiamato "Motor Colocalizzazione "16,20. Carichi e motori fluorescente generano caratteristiche puntiformi diffrazione limitata che può parzialmente sovrapporsi. Per risolvere la posizione di sovrapposizione puncta, il software prima adatta automaticamente funzioni gaussiane a ciascuna funzione del punto di diffusione, che rappresenta puncta fluorescente individuale, per determinare la loro esatta posizione XY sub-pixel di coordinate e l'intensità ampiezze 21-23. Le posizioni dei motori e dei carichi sono successivamente confrontate tra loro per determinare colocalizzazione 16,20. Pertanto, questo metodo assegna più precisamente colocalizzazione tra puncta fluorescenza rispetto ad altri metodi 24.

La forza di questo metodo è la capacità di valutare la colocalizzazione dei motori con carico individuale cellule fissate, per cui traiettorie di movimento vivo (ad esempio, la direzione in cui sono stati in movimento al momento della fissazione) sono stati recorded. Con questo metodo, kinesins e dineine trovato associare simultaneamente vescicole che portano il normale proteina prionica (PrP C -cellular), un carico neuronally arricchito che si sposta bidirezionalmente o rimane stazionario negli assoni 16. Questa analisi ha permesso la formulazione di un modello di lavoro per la regolazione della PrP C movimento delle vescicole in cui anterograda (cinesina) e (dineina) Motori retrogradi coordinano le loro attività al fine di spostare le vescicole in entrambe le direzioni o di rimanere fermo mentre associato al carico . Un'altra forza di questo metodo è la sua applicabilità potenziale massima per caratterizzare colocalizzazione / associazione di molti carichi fluorescente che si muovono in qualsiasi tipo di cellula, con qualsiasi altra proteina (s) di interesse. Così, in diretta correlazione / fisso potrebbe potenzialmente consentire la rilevazione di interazioni transienti proteina-carico, come molti fluorescente individuo etichettato particelle in movimento può essere analizzato su un p desideratoeriodo di tempo. Data l'ampia applicabilità e il tipo di domande che questo metodo può affrontare, questo protocollo sarà di interesse per un vasto pubblico di biologi cellulari, tra cui quelli che studiano il traffico e il trasporto nei neuroni o in altri tipi di cellule.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo protocolli approvati e secondo le linee guida istituzionali per la cura umano degli animali di ricerca. Neonati topi sono stati sacrificati per decapitazione.

1. Preparazione di dispositivi microfluidici per colture cellulari

  1. Preparare polidimetilsilossano (PDMS) dispositivi microfluidici per la crescita dei neuroni dell'ippocampo come descritto da Harris e colleghi 17-19. Qui di seguito sono alcune modifiche che sono state adattate al protocollo mappatura del carico.
    NOTA: dispositivi microfluidici sono anche disponibili in commercio (Materials List), così l'accesso ad un impianto di fabbricazione non è necessario.
  2. Preparare No. 1½ vetrini coprioggetto (24 x 40 mm) per lavarli tre volte con acetone, seguita da tre lavaggi con il 100% di etanolo e tre lavaggi di acqua. Conservare coprioggetto in acqua a 4 ° C fino al momento dell'uso. Questi trattamenti aiutano a garantire che lamelle siano pulite da detriti che potrebbero interferire con la placcatura di cells, la contaminazione, e la sopravvivenza.
    NOTA: acetone ed etanolo sono infiammabili e pericolosi in caso di contatto cutaneo (irritante), di contatto con gli occhi (irritante), di ingestione, di inalazione. Smaltire conformemente alla normativa vigente.
  3. Quando si è pronti ad utilizzare, mettere un vetro di copertura in un piatto di coltura cellulare 60 millimetri per dispositivo microfluidica, e lasciare asciugare all'aria scoperto per 45 minuti all'interno di un quadro di biosicurezza per evitare la contaminazione.
  4. Dopo che i dispositivi sono tagliati fuori da maestri e pugni sono stati tagliati per creare serbatoi (Figura 1A, B), metterli con i canali microfluidici lato-up all'interno di un armadio biosicurezza dotato di una lampada UV per 45 minuti per la sterilizzazione.
    NOTA: Lasciare i dispositivi in ​​trattamento UV per più di 2 ore potrebbe influenzare l'integrità dei PDMS.
  5. Montare i dispositivi inserendo un dispositivo su ogni vetro di copertura all'interno del piatto di coltura cellulare di plastica 60 millimetri in modo che i canali microfluidici a faccia in giù. Applicare una leggera pressione al o superioref il dispositivo (non toccare i microcanali) per fornire una tenuta non permanente del dispositivo al vetro di copertura. Coprire ogni piatto di coltura cellulare 60 mm Con un coperchio.
  6. Usando una micropipetta, idratare i dispositivi aggiungendo acqua coltura cellulare di grado all'inizio due serbatoi microfluidica (1 e 2 in Figura 1A), permettendo all'acqua di fluire attraverso. Rimuovere acqua con una micropipetta e aggiungere 1 mg / ml di poli-L-lisina nel serbatoio microfluidica 1 (200 ml) e 2 (100 mL). Il volume differenziale consentirà il poli-L-lisina a fluire attraverso i microcanali (Figura 1A, B).
  7. Per garantire che i dispositivi all'interno dei piatti di coltura cellulare 60 millimetri non rovesciarsi all'interno di un incubatore a 37 ° C, posizionare tre piatti 60 millimetri di coltura cellulare contenente i dispositivi in ​​un piatto di coltura cellulare in plastica 150 mm e coprire il piatto con un coperchio. Incubare O / N in un incubatore a 37 ° C con il 5% di CO 2. Tipicamente più del 90% dei canali utilizzabili per dispositivo e farenon contenere bolle d'aria o il blocco fisico.
  8. Il giorno successivo, sostituire poli-L-lisina con acqua e lasciare dispositivo in incubatore per almeno 1 ora. Ripetere questo lavaggio tre volte. Rimuovere l'acqua e aggiungere Neurobasal-A mezzo di crescita (contenente 2% B-27 supplemento e 500 mM Glutamax) a ciascun dispositivo. Lascia O / N in un incubatore a 37 ° C con il 5% di CO 2.
  9. Il giorno successivo, piastra cellule dell'ippocampo come descritto di seguito.

2. placcatura di topo ippocampale Primaria neuroni in dispositivi microfluidici

NOTA: La preparazione di colture di neuroni ippocampali di topi neonati è stato precedentemente pubblicato in Giove 25. Qui di seguito sono alcune modifiche che sono state adattate per i neuroni dell'ippocampo di topo piatto in dispositivi microfluidici, e che erano ottimali per trasfezioni.

  1. Prima del mouse dissezione del cervello, contenente siero fetale bovino al 10% della coltura di Dulbecco modificato (DMEM) pre-caldo(FBS; senza antibiotici), miscela A (125 mg di DL-cisteina, 125 mg di sieroalbumina bovina (BSA) e 3,125 g di D-glucosio in 500 ml di tampone fosfato salino (PBS), filtro sterilizzare attraverso un filtro di 0,22 micron) e deossiribonucleasi io soluzione (DNasi I: 50 mg di DNasi I e 0,5 ml di una 4 soluzione 1,2 M MgSO in 100 ml soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) filtro sterilizzare attraverso un filtro da 0,22 micron) in un bagno d'acqua a 37 °.
    1. Pre-calda Neurobasal-A mezzo di crescita all'interno di un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 per equilibrare il pH.
  2. Sezionare ippocampi 1-3 giorno topi neonati secondo i protocolli stabiliti 26. Mantenere dell'ippocampo in una provetta conica da 15 ml contenente 10 ml di tampone di dissezione (HBSS contenente 10 mM HEPES pH 7,4, glucosio 50 mM, 100 U / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina), su ghiaccio. Mettere fino a 4 ippocampi per tubo da 15 ml.
  3. Eseguire il protocollo rimanente è in condizioni sterilis all'interno di un armadio biosicurezza.
  4. Diluire 45 unità di papaina in 5 ml di miscela A, vortex e incubare per 5 minuti a 37 ° C fino papaina dissoluzione della polvere. Aggiungere 1 ml di soluzione di DNasi I. Filtrare la miscela attraverso un filtro di 0,22 micron unità siringa.
  5. Attenzione aspirare HBSS 'da 15 ml coniche ippocampi tubo contenente. Aggiungere 10 ml di freddo (4 ° C) HBSS di ippocampi e farli depositano sul fondo della provetta. Con attenzione aspirare HBSS da tubo da 15 ml.
  6. Aggiungere 1 ml papaina / DNasi impasto fino a 4 ippocampi e incubare per 20-30 minuti a 37 ° C. Inclinare tubo conico ogni 5 minuti per fare il bagno ippocampi con la miscela. In alternativa, inserire ippocampi a 37 ° C Acque bagno shaker con agitando delicatamente (~ 100 rpm).
  7. Aspirare papaina / DNasi impasto e lavo ippocampi due volte con pre-riscaldato DMEM (37 ° C) contenente 10% FBS.
  8. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 2 ml di DMEM pre-riscaldato contenente 10% FBS di ippocampi e ippocampi manualmente triturare pipettandosu e giù ~ 10-12 volte con una punta di pipetta 1 ml a dissociarsi neuroni.
  9. Let triturare accontentarsi di ~ 1 min in modo da poter neuroni non dissociati di depositarsi sul fondo della provetta conica. Trasferire il surnatante contenente neuroni dissociati in un tubo da 15 ml evitando il trasferimento di tessuto più grande che si è posata sul fondo della provetta.
  10. Spin cellule a 1.000 xg per 2 minuti e rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet di cellule. Risospendere le cellule in 80 ml Neurobasal-A mezzo di crescita pipettando delicatamente.
  11. Rimuovere media dal serbatoio microfluidica 1 e 1 '. Applicare 20 ml di cellule (~ 275.000) al serbatoio microfluidica 1, e consentire loro di fluire attraverso. Inserire dispositivo 37 ° C incubatore con 5% di CO 2 per 20 min.
  12. Guardare sotto il microscopio per assicurare che le cellule hanno aderito al vetro di copertura. Aggiungi Neurobasal-A mezzo di crescita per concludere tutti i serbatoi. Dispositivo ritorno con celle di un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2.
  13. Controllare i dispositivi di evaporazione ~ ogni 2-3 giorni e rabboccare serbatoi con Neurobasal-A contenente 2% B-27 supplemento (senza Glutamax) da evitare. I neuroni cominciano a estendere le loro assoni attraverso canali microfluidici ~ 2-3 giorni dopo la placcatura. Neuroni riserva di trasfezione in genere 7-10 giorni dopo la placcatura.

3. La trasfezione di neuroni ippocampali Cresciuta in Device Microfluidic

  1. Per dispositivo, preparare una miscela di 1,2 ml Lipofectamine 2000 a 30 microlitri Neurobasal-A, e un mix di 0,5 mg fluorescente plasmide carico fusione in 30 ml Neurobasal-A e incubare 5 minuti a temperatura ambiente. Aggiungi mix Lipofectamine al mix DNA e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 60 ml di Neurobasal-A contenente 4% B-27 supplemento del DNA / Lipofectamine mix e mescolare muovendo il tubo.
  2. Rimuovere tutti i supporti dal serbatoio microfluidica 2 e 2 'e riempire con cura fino pozzi con Neurobasal-A contenenti 2% B-27 supplemento senza versare nel medio into gli altri comparti.
  3. Rimuovere i supporti dal serbatoio microfluidica 1 e 1 '. Aggiungere 120 ml di DNA / Lipofectamine mix di serbatoio microfluidica 1 e lasciare fluire. Dispositivo di ritorno a 37 ° C incubatore con 5% di CO 2 per 3-4 ore.
  4. Rimuovere tutti i supporti dal serbatoio microfluidica 1 e 1 'e sostituire con Neurobasal-A contenente 2% B-27 supplemento per 24 ore (o fino al momento di immagine). In genere, 5-7 assoni che si sviluppano attraverso microcanali sono trasfettate in queste condizioni, che rappresentano circa il 1-3% l'efficienza di trasfezione in linea con efficienze pubblicati per cellule in coltura ippocampali 26.

4. Analisi "Cargo Mapping"

  1. Immagini dal vivo di movimento merci
    1. Eseguire l'imaging di un microscopio ottico invertito epifluorescenza dotato di un incubatore a 37 ° e di una camera di controllo di CO 2.
    2. Montare il vetrino con i neuroni dell'ippocampo coltivate in un micrdispositivo ofluidic sul palco microscopio. Per evitare la morte neuronale, lavorare rapidamente per mantenere i campioni al microscopio per non più di 1 ora.
    3. Usando un obiettivo ad alta risoluzione (100X), trovare gli assoni delle cellule transfettate che si estendono attraverso i canali di camere di microfluidica e registrare il numero dei canali in cui è stato trovato l'assone transfettate. Contare il numero di canali utilizzando un contatore tally mano.
      1. Per una registrazione ottimale circolazione vivo e successiva analisi colocalizzazione, scegliere assoni che crescono relativamente piatta attraverso i canali in modo che l'immagine della maggior vescicole può essere eseguita a fuoco.
    4. Rimuovere la maggior parte del mezzo da serbatoi 2 e 2 'con 1 ml di trasferimento pipetta. Per facilitare la successiva allineamento delle immagini fisse con traiettorie di movimento sulla kymographs, allineare il bordo destro dei microcanali con il campo visivo durante l'imaging (Figura 1B, C).
    5. Per facilitare fixing dei campioni durante l'imaging, eseguire l'imaging dal vivo con due persone. In alternativa, se l'imaging in tempo reale viene eseguita da una sola persona, utilizzare un sistema microscopio dotato di correzione della deriva.
    6. Avviare l'imaging movimento merci dal vivo con le specifiche time-lapse specifiche per le dinamiche di trasporto del carico in fase di analisi (specifiche microscopio e le impostazioni per l'imaging YFP-PrP C sono specificati nella legenda della figura 2 ed elenca le materie).
    7. Dopo sufficienti dati in tempo reale del movimento sono stati raccolti, avere una persona riempire serbatoi 2 e 2 'con pre-riscaldato 4% paraformaldeide in PBS contenente 0,04 g / ml di saccarosio per riparare le cellule. Evitare di toccare il dispositivo di microfluidica, per evitare di falsare il focus della immagini dal vivo. Avere l'altra persona regolare la messa a fuoco mentre si aggiunge il fissativo. Fissazione è successo quando si osserva arresto immediato del movimento. Aggiungi fissativo al serbatoio 1 e 1 'dopo.
      NOTA: photoblea temporaneoching della fluorescenza carico potrebbe anche essere osservato, ma la fluorescenza persiste dopo se la colorazione per le proteine ​​del motore è completata (fase successiva).
      NOTA: Paraformaldeide è nocivo per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione. Irritante per gli occhi, le vie respiratorie e la pelle. Smaltire conformemente alla normativa vigente.
  2. Se la colorazione delle proteine ​​motrici per l'analisi co-localizzazione
    NOTA: Per la quantificazione dei livelli relativi di proteine ​​motrici (come determinato dalla colorazione degli anticorpi), associati ai carichi in movimento individuali, validare e titolare anticorpi per garantire che il legame antigene-anticorpo è saturo. Questo viene fatto determinando la specificità dell'anticorpo usando neuroni in cui la proteina di interesse è stato né knock-out o smontati, ed effettuando IF analisi con concentrazioni crescenti di anticorpi. Per i controlli negativi, i neuroni sono colorate con anticorpi secondari in assenza di anticorpi primari. Più dettagliateDescrizione della convalida anticorpo può essere trovato in Encalada et al. 16, e Szpankowski et al. 20.
    1. Rimuovere il vetrino con i neuroni dell'ippocampo coltivate in un dispositivo di microfluidica dal palco microscopio. Non scollegare il dispositivo di microfluidica dal coprioggetto, come i microcanali devono rimanere intatto per sovrapporre le immagini in diretta e fisse. Effettuare le seguenti operazioni in una camera umida.
    2. Per garantire il flusso di soluzioni nei microcanali, mantenere un volume differenziale cuscinetto tra serbatoi 1, 1 'e 2, 2' di almeno 30 microlitri. in tutte le fasi successive. Ad esempio, aggiungere il volume di 100 microlitri mezzi di serbatoio microfluidica 2, 2 ', e 70 ml di volume media per serbatoio microfluidica 1, 1'.
    3. Rimuovere fissativo delle camere di dispositivo di microfluidica e lavare le cellule tre volte con PBS di attesa di 10 minuti tra un lavaggio.
    4. Permeabilize cellule aggiungendo 0,1% Triton X-100 Diluta in PBS per 5 minuti per tutti i serbatoi.
    5. Rimuovere la soluzione di tutti i serbatoi e lavare con PBS. Ripetere il lavaggio e tre tempi di attesa di 10 minuti tra un lavaggio.
    6. Rimuovere la soluzione di tutti i serbatoi e applicare un tampone di bloccaggio contenente il 10% di siero normale Asino e il 3% della proteasi libera e immunoglobuline G (IgG) -free BSA in PBS e incubare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.
    7. Spin anticorpi soluzione madre primaria a 20.000 xg per 5 minuti per rimuovere precipitati. Diluire l'anticorpo ad una concentrazione adeguata nel tampone di bloccaggio. Sostituire il tampone bloccante dal dispositivo di microfluidica con soluzione di anticorpi. Incubare i campioni per 2 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C.
    8. Rimuovere la soluzione di tutti i serbatoi e lavare tre volte con PBS, in attesa 10 minuti tra un lavaggio.
    9. Spin anticorpi soluzione madre secondario a 20.000 xg per 5 minuti per rimuovere precipitati. Diluire l'anticorpo ad una concentrazione adeguata nel tampone di bloccaggio. Sostituire PBS con la soluzione di anticorpo secondario. Covarecampioni per 1 ora a RT.
    10. Rimuovere la soluzione di tutti i serbatoi e lavare tre volte con PBS, in attesa 10 minuti tra un lavaggio.
    11. Sostituire PBS con ~ mezzo di montaggio 10-20 microlitri pipettando direttamente mezzo di montaggio nell'apertura dei canali che collegano i serbatoi. Lasciate il montaggio di mezzi a secco per ~ 20 min - 1 ora a temperatura ambiente.
    12. Dispositivi Conservare a 4 ° C al riparo dalla luce per evitare photobleaching, e assoni immagine entro due giorni (massimo una settimana) di colorazione.
    13. Dopo la colorazione è stata completata, montare coprioggetto con i neuroni dell'ippocampo coltivate in un dispositivo di microfluidica sul palco microscopio. Individuare la regione del assone trasfettate ripreso al punto 4.1.1-4.1.7.
    14. Acquisire immagini Z-stack (300 gradini nm) per ciascuno dei tre canali: carico, il motore 1, motore 2, utilizzando un obiettivo ad alta risoluzione (ad esempio, un alto obiettivo di olio o acqua apertura numerica).
      NOTA: Acquisizione di Z-stack è importante in quanto assoni spesso non crescono perfettamente pianain microcanali e quindi non tutti puncta fluorescenti sono nello stesso piano focale.
  3. Mappatura Cargo
    1. Genera un chimografo di movimento del carico utilizzando il software di analisi delle immagini. Il plugin ImageJ sviluppato da Rietdorf e Seitz (EMBL) è consigliato per la generazione di kymographs (vedi per il download Elenco materiali).
      NOTA: ImageJ è un dominio pubblico, basata su Java programma di elaborazione delle immagini sviluppato presso il National Institutes of Health 27,28 (per il download vedi Materials List).
    2. Allineate le immagini fisse del carico fluorescente (generato nel passaggio 4.2.14) manualmente sovrapponendoli sulla posizione delle traiettorie nel chimografo nel punto di fissaggio (figura 2A, B), utilizzando un programma software grafica disponibile in commercio (Materiali List). Allineare manualmente dal primo sovrapponendo l'immagine del carico fissato sul chimografo e scegliendo manualmente il puncta carico che corrisponde ad una traiettoria determinata sullail chimografo. Per ottenere i migliori risultati di allineamento, utilizzare la fetta Z che è nel migliore messa a fuoco per il carico mappato. Possono essere utilizzate diverse sezioni Z.
    3. Per ogni immagine nella Z-stack (carico motore 1 e motore 2; generato nel passaggio 4.2.14) determinare le coordinate XY e ampiezze di intensità per ogni puncta fluorescenza utilizzando un algoritmo stabilito per adattarsi gaussiane 2D alla funzione di diffusione del punto che rappresenta ciascuna sorgente puntiforme in ciascuno dei tre canali 16,20,21 (Figura 2D).
      NOTA: Per ottenere le coordinate XY, un pacchetto software MATLAB su misura denominata "Motor Colocalizzazione" è stato sviluppato 16,20, che incorpora un algoritmo di raccordo gaussiano sviluppato da Jaqaman, Danuser e colleghi 21-23. Il pacchetto software e dettagliate istruzioni per l'uso possono essere richiesti.
    4. Per ciascuno di carico puncta singolarmente che sono stati mappati sulle traiettorie mobili o fissi sul chimografo, selezionare tha coordinate XY e ampiezze intensità dai risultati del programma "Motor Colocalizzazione" (questi carichi sono singolarmente etichettati in Figura 2B). Utilizzare diverse immagini Z-stack acquisite in fase 4.2.14) per mappare più carichi che si trovano su diversi piani focali.
    5. Confrontare coordinate XY individuale per il carico mappato a quelli ottenuti per ciascuno dei canali motore nella corrispondente sezione Z (Figura 2D). Determinare e selezionare le coordinate XY del motore che si trovano entro un raggio di 300 nm del carico. Per i carichi e motori che hanno il segnale all'interno dello stesso piano focale, utilizzare il pacchetto software "Motor Colocalizzazione" per determinare il puncta che si trovano entro un raggio di 300 nm.

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Risultati

La Figura 1 mostra una panoramica del dispositivo microfluidica utilizzato per la coltivazione neuroni ippocampali (Figura 1A, B). I neuroni sono placcati nel serbatoio 1. La dimensione dei microcanali impedisce la diffusione di corpi cellulari (soma) nel compartimento assonale mentre la lunghezza dei canali impedisce proiezioni dendritiche di attraversare tutta la strada al compartimento assonale. Dopo circa 2-3 giorni di coltura, neuroni cominciano estendendo loro assoni attraverso mi...

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Discussione

Il protocollo qui presentata consente la correlazione di direzionalità del movimento delle singole particelle in movimento del carico basato microtubuli-fluorescenti con il tipo e la quantità relativa di proteine ​​motrici collegate a neuroni vivi. In precedenza, la composizione totale del motore di carichi vescicolari assonale è stato analizzato su popolazioni eterogenee di vescicole e organelli 9,15 biochimicamente purificati. Tuttavia, caratterizzando composizione motore per un singol...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman e Daniel Whisler per l'assistenza nell'adattamento e nello sviluppo del software per quantificare le analisi di mappatura del carico, e Emily Niederst per l'aiuto nella realizzazione dei dispositivi microfluidici. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da AG032180 di sovvenzioni NIH-NIA a LSBG e all'Howard Hughes Medical Institute. L.S. è stato supportato in parte da una sovvenzione di formazione NIH Bioinformatics T32 GM008806, S.E.E. è stata supportata da una Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216 e da una sovvenzione della Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C. è stata supportata da un premio NIH/NCATS 1 TL1 TR001114 e dalla fondazione Achievement Rewards for College Scientists.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
poli-L-lisinaSigmaP5899-20mg
D-MEM (Dulbecco' s Modified Eagle Medium) Alto glucosio, con L-glutammina, senza piruvato di sodio (1x)Life Technologies11965092
FBS (siero bovino fetale)Life Technologies10082147
Neurobasal-A Medium (1x)Life Technologies10888022
Integratore senza siero B-27Technologies10888022
GlutaMAX I Supplement (100x)Life Tecnologie35050061
HBSS (1x) (Hank' LifeTechnologies24020117
DPBS (Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato, senza magnesio, senza calcio (1x)Life Technologies14190250
Penicillina/Streptomicina (100x)Life Technologies15140122
Corning cellgro Acqua per colture cellulari Fisher ScientificMT46000CM
PapainUSB Corporation19925
DL-cisteina HClSigma-AldrichC9768
BSA (albumina sierica bovina)Sigma-AldrichA7906
D-glucosioSigma-AldrichG6152
DNAsi I grado II RocheApplied Sciences10104159001
Lipofectamina 2000Tecnologie di vita 
Soluzione di formaldeide 16% EM GradeFisher Scientific 50980487Attenzione: Nocivo per inalazione, a contatto con la pelle e se ingerito. Irritante per gli occhi, il sistema respiratorio e la pelle. Smaltire secondo le normative ufficiali.
SaccarosioFisher ScientificS5-500
HEPESSigmaH-3375
Siero d'asino normaleJackson Immuno Research017-000-0121
Senza acidi grassi BSA e IgGJackson Immuno Research001-000-162
AcetoneFisher ScientificBP2403-4
EtanoloFisher ScientificBP2818-100
Reagente antisbiadimento ProLong GoldLife TechnologiesP36934
Vetro di copertura 1 1/2. 24 x 40 mmCorning2980-244
Dispositivo microfluidico Axis, 450 &; mMilliporeAX450
Adobe PhotoshopAdobe
Nikon Eclipse TE2000-U Fotocamera Nikon
Coolsnap HQ Roper Scientific
60 mmFisher Scientific12-565-95
Piastra per coltura cellulare da 150 mmFisher Scientific12-565-100
Anticorpi utilizzati:
Catena leggera anti-chinesina, V-17Santa Cruz Specificità sc-13362verificata utilizzando neuroni KLC1-/- (Rif. 16), diluizione consigliata 1:100.
Catena pesante anti dineina 1, R-325Santa CruzSpecificità sc-9115verificata utilizzando shRNA contro DYN1HC1 (Rif. 16), diluizione consigliata 1:100
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG AntibodyLife TechnologiesA10042  Diluizione consigliata 1:200.
Alexa Fluor 647 Asino Anti-Coniglio IgG (H + L) AnticorpoLife TechnologiesA31573  Diluizione consigliata 1:200.
Alexa Fluor 568 asino anti-capra IgG (H+L) anticorpo IgG anticorpoLife TechnologiesA11057  Diluizione consigliata 1:200.
Alexa Fluor 647 Asino Anti-Capra IgG (H + L) AnticorpoLife TechnologiesA21447  Diluizione consigliata 1:200.
Plugin e Macro
ImageJ  http://imagej.nih.gov/ij/index.html. 
ImageJ Kymograph Pluginhttp://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.
Life 11668027Piastra per coltura cellulare

Riferimenti

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