Che caratterizza la composizione molecolare di motori su Moving assonale Cargo Utilizzo dell&#39;analisi &quot;Cargo Mapping&quot;

Sylvia Neumann; George E. Campbell; Lukasz Szpankowski; Lawrence S.B. Goldstein; Sandra E. Encalada

doi:10.3791/52029

Articolo metodologico

Che caratterizza la composizione molecolare di motori su Moving assonale Cargo Utilizzo dell'analisi "Cargo Mapping"

DOI:

10.3791/52029

⸱

30 ottobre 2014

Sylvia Neumann¹ , George E. Campbell^*¹ , Lukasz Szpankowski^*²^,³ , Lawrence S.B. Goldstein²^,⁴ , Sandra E. Encalada¹

¹Department of Molecular and Experimental Medicine, Dorris Neuroscience Center, The Scripps Research Institute, ²Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, ³Department of Bioengineering, University of California San Diego, ⁴Department of Neurosciences, University of California San Diego School of Medicine

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Il trasporto intracellulare di carichi, come vescicole o organelli, è effettuato da proteine motrici molecolari che seguono i microtubuli polarizzati. Questo protocollo descrive la correlazione della direzionalità del trasporto delle singole particelle di carico che si muovono all'interno dei neuroni, con la quantità relativa e il tipo di proteine motorie associate.

Abstract

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La comprensione dei meccanismi attraverso i quali motori molecolari coordinano le loro attività per il trasporto di carichi vescicolari all'interno dei neuroni richiede l'analisi quantitativa delle associazioni motore / carico a livello delle vescicole singolo. Lo scopo di questo protocollo è quello di utilizzare la microscopia a fluorescenza quantitativa correlare ("mappa") la posizione e la direzionalità del movimento di carico vivo per la composizione e la quantità relative di motori associati allo stesso carico. "Mappatura Cargo" è costituito da immagini in diretta di carichi fluorescente che si muovono in assoni coltivate su dispositivi microfluidici, seguita da una sintesi chimica durante la registrazione di movimento dal vivo, e la successiva immunofluorescenza (IF) colorazione delle esatte regioni assoni stessi con anticorpi contro i motori. Colocalizzazione tra i carichi e relativi motori è valutata assegnando posizione sub-pixel coordinate ai canali del motore e del carico, da funzioni gaussiane di montaggio per la diffrazione-lile funzioni di punto di spread tata che rappresentano le singole fonti puntuali fluorescenti. Del carico e del motore le immagini fisse vengono successivamente sovrapposte a trame di movimento merci, di "mappare" ai loro traiettorie tracciate. Il punto di forza di questo protocollo è la combinazione di live e se i dati di registrare sia il trasporto di carichi vescicolari in cellule vive e per determinare i motori associati a queste stesse vescicole esatte. Questa tecnica supera sfide precedenti che utilizzano metodi biochimici per determinare la composizione media del motore di eterogenee popolazioni di vescicole rinfusa purificati, come questi metodi non rivelano composizioni su singoli carichi in movimento. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per l'analisi di altre vie di trasporto e / o di traffico in altri tipi di cellule di correlare il movimento delle singole strutture intracellulari con la loro composizione proteica. Le limitazioni di questo protocollo sono la relativamente bassa velocità a causa delle basse efficienze di trasfezione di colturaneuroni primari e un campo di vista limitato disponibile per imaging ad alta risoluzione. Le applicazioni future potrebbero includere metodi per aumentare il numero di neuroni che esprimono carichi fluorescente.

Introduzione

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Trasporto intracellulare è fondamentale in tutti i tipi di cellule per la consegna di proteine, membrane, organelli e molecole di segnalazione a diversi domini cellulari ^1. I neuroni sono altamente specializzati cellule con lunghi, proiezioni polarizzate che critica dipendono da trasporto intracellulare dei carichi essenziali per la loro consegna a lunga distanza per vari microdomini assonale. Questo trasporto è mediata da kinesins e dineine - due grandi famiglie di proteine motore molecolare - che si legano ai carichi e tenere traccia lungo i microtubuli polarizzati in anterograda e retrograda direzioni, rispettivamente. Mentre il movimento retrogrado è....

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo protocolli approvati e secondo le linee guida istituzionali per la cura umano degli animali di ricerca. Neonati topi sono stati sacrificati per decapitazione.

1. Preparazione di dispositivi microfluidici per colture cellulari

Preparare polidimetilsilossano (PDMS) dispositivi microfluidici per la crescita dei neuroni dell'ippocampo come descritto da Harris e colleghi ^17-19. Qui di seguito sono alcune modifiche che sono state adattate al protocollo mappatura del carico.
NOTA: dispositivi microfluidici sono anche disponibili in commercio (Materials List), così....

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Risultati

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La Figura 1 mostra una panoramica del dispositivo microfluidica utilizzato per la coltivazione neuroni ippocampali (Figura 1A, B). I neuroni sono placcati nel serbatoio 1. La dimensione dei microcanali impedisce la diffusione di corpi cellulari (soma) nel compartimento assonale mentre la lunghezza dei canali impedisce proiezioni dendritiche di attraversare tutta la strada al compartimento assonale. Dopo circa 2-3 giorni di coltura, neuroni cominciano estendendo loro assoni attraverso mi.......

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Discussione

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Il protocollo qui presentata consente la correlazione di direzionalità del movimento delle singole particelle in movimento del carico basato microtubuli-fluorescenti con il tipo e la quantità relativa di proteine motrici collegate a neuroni vivi. In precedenza, la composizione totale del motore di carichi vescicolari assonale è stato analizzato su popolazioni eterogenee di vescicole e organelli ^9,15 biochimicamente purificati. Tuttavia, caratterizzando composizione motore per un singol.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman e Daniel Whisler per l'assistenza nell'adattamento e nello sviluppo del software per quantificare le analisi di mappatura del carico, e Emily Niederst per l'aiuto nella realizzazione dei dispositivi microfluidici. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da AG032180 di sovvenzioni NIH-NIA a LSBG e all'Howard Hughes Medical Institute. L.S. è stato supportato in parte da una sovvenzione di formazione NIH Bioinformatics T32 GM008806, S.E.E. è stata supportata da una Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216 e da una sovvenzione della Ellison Medical Foundation New ....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
poli-L-lisina	Sigma	P5899-20mg
D-MEM (Dulbecco' s Modified Eagle Medium) Alto glucosio, con L-glutammina, senza piruvato di sodio (1x)	Life Technologies	11965092
FBS (siero bovino fetale)	Life Technologies	10082147
Neurobasal-A Medium (1x)	Life Technologies	10888022
Integratore senza siero B-27	Technologies	10888022
GlutaMAX I Supplement (100x)	Life Tecnologie	35050061
HBSS (1x) (Hank' Life	Technologies	24020117
DPBS (Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato, senza magnesio, senza calcio (1x)	Life Technologies	14190250
Penicillina/Streptomicina (100x)	Life Technologies	15140122
Corning cellgro Acqua per colture cellulari	Fisher Scientific	MT46000CM
Papain	USB Corporation	19925
DL-cisteina HCl	Sigma-Aldrich	C9768
BSA (albumina sierica bovina)	Sigma-Aldrich	A7906
D-glucosio	Sigma-Aldrich	G6152
DNAsi I grado II Roche	Applied Sciences	10104159001
Lipofectamina 2000	Tecnologie di vita
Soluzione di formaldeide 16% EM Grade	Fisher Scientific 50980487		Attenzione: Nocivo per inalazione, a contatto con la pelle e se ingerito. Irritante per gli occhi, il sistema respiratorio e la pelle. Smaltire secondo le normative ufficiali.
Saccarosio	Fisher Scientific	S5-500
HEPES	Sigma	H-3375
Siero d'asino normale	Jackson Immuno Research	017-000-0121
Senza acidi grassi BSA e IgG	Jackson Immuno Research	001-000-162
Acetone	Fisher Scientific	BP2403-4
Etanolo	Fisher Scientific	BP2818-100
Reagente antisbiadimento ProLong Gold	Life Technologies	P36934
Vetro di copertura 1 1/2. 24 x 40 mm	Corning	2980-244
Dispositivo microfluidico Axis, 450 &; m	Millipore	AX450
Adobe Photoshop	Adobe
Nikon Eclipse TE2000-U	Fotocamera Nikon
Coolsnap HQ	Roper Scientific
60 mm	Fisher Scientific	12-565-95
Piastra per coltura cellulare da 150 mm	Fisher Scientific	12-565-100
Anticorpi utilizzati:
Catena leggera anti-chinesina, V-17	Santa Cruz	Specificità sc-13362	verificata utilizzando neuroni KLC1-/- (Rif. 16), diluizione consigliata 1:100.
Catena pesante anti dineina 1, R-325	Santa Cruz	Specificità sc-9115	verificata utilizzando shRNA contro DYN1HC1 (Rif. 16), diluizione consigliata 1:100
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody	Life Technologies	A10042	Diluizione consigliata 1:200.
Alexa Fluor 647 Asino Anti-Coniglio IgG (H + L) Anticorpo	Life Technologies	A31573	Diluizione consigliata 1:200.
Alexa Fluor 568 asino anti-capra IgG (H+L) anticorpo IgG anticorpo	Life Technologies	A11057	Diluizione consigliata 1:200.
Alexa Fluor 647 Asino Anti-Capra IgG (H + L) Anticorpo	Life Technologies	A21447	Diluizione consigliata 1:200.
Plugin e Macro
ImageJ			http://imagej.nih.gov/ij/index.html.
ImageJ Kymograph Plugin			http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.

Life 11668027Piastra per coltura cellulare

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science.

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Microscopia a fluorescenza imaging in vivo colorazione immunofluorescente dispositivi microfluidici colocalizzazione sub pixel fitting gaussiano colocalizzazione dei motori trasporto assonale

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