Articolo metodologico

L'uso di MALDI-TOF spettrometria di massa e un database personalizzato per caratterizzare batteri indigeni ad un unico ambiente di Cave (Kartchner Caverns, AZ, USA)

DOI:

10.3791/52064

⸱

2 gennaio 2015

 ,  ,  , 
1School of Mathematical and Natural Sciences, Arizona State University, 2Applied Maths NV

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro descrive in dettaglio le procedure per l'identificazione rapida dei batteri utilizzando MALDI-TOF MS. Le procedure di identificazione includono l'acquisizione dello spettro, la costruzione di database e le analisi di follow-up. Vengono presentati due metodi di identificazione, quelli basati sul coefficiente di somiglianza e quelli basati sui biomarcatori.

Abstract

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La spettrometria di massa MALDI-TOF ha dimostrato di essere uno strumento rapido e affidabile per l'identificazione di batteri a livello di genere e specie e, in alcuni casi, di ceppo. Sono stati sviluppati strumenti software disponibili in commercio e open source per facilitare l'identificazione; Tuttavia, in letteratura non è stata descritta alcuna pipeline di analisi dei dati universale/standardizzata. Qui, forniamo una dimostrazione completa e dettagliata delle procedure di identificazione batterica utilizzando uno spettrometro di massa MALDI-TOF. Gli spettri di massa sono stati raccolti da 15 diversi batteri isolati da Kartchner Caverns, AZ, USA, e identificati mediante sequenziamento dell'rDNA 16S. I database sono stati costruiti in BioNumerics 7.1. Sono state eseguite analisi di follow-up degli spettri di massa, tra cui analisi dei cluster, corrispondenza dei picchi e analisi statistiche. L'identificazione è stata eseguita utilizzando campioni codificati in cieco selezionati casualmente tra questi 15 batteri. Vengono presentati due metodi di identificazione: quelli basati sul coefficiente di somiglianza e quelli basati sui biomarcatori. I risultati mostrano che entrambi i metodi di identificazione possono identificare i batteri a livello di specie.

Introduzione

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La spettrometria di massa (MS) a tempo di volo/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-TOF) ha dimostrato di essere uno strumento rapido e affidabile per l'identificazione di batteri a livello di genere, specie e, in alcuni casi, di ceppo1-4. MALDI-TOF MS ionizza molecole biologiche (tipicamente proteine) che originano dalle superfici cellulari, dalle membrane intracellulari e dai ribosomi da cellule batteriche intere o estratti proteici1,5. I picchi risultanti formano modelli caratteristici o "impronte digitali" dei batteri analizzati1. L'identificazione dei batteri si basa su queste "impronte digitali" massa-carica.

Due delle strategie di identificazione più comunemente utilizzate sono le strategie basate su librerie e quelle basate sulla bioinformatica1. Gli approcci basati su librerie prevedono il confronto degli spettri di massa di incognite con gli spettri di massa precedentemente raccolti di batteri noti in database/librerie per l'identificazione. Sono disponibili software disponibili in commercio, come i pacchetti software BioNumerics, Biotyper e SARACIS, nonché strumenti software open source, come SpectraBank6, per facilitare il confronto e la quantificazione della somiglianza tra gli spettri di massa di batteri sconosciuti e quelli di riferimento. Gli approcci basati sulla bioinformatica di solito si basano su genomi di batteri completamente sequenziati per l'identificazione. A differenza degli approcci basati su librerie che non implicano l'identificazione della natura biologica di particolari picchi, gli approcci basati sulla bioinformatica implicano l'identificazione delle proteine1.

La maggior parte dei recenti studi basati sulle impronte digitali MALDI ha utilizzato approcci basati su librerie per identificare i batteri1. Gli approcci basati su librerie richiedono la costruzione di database e il confronto della somiglianza tra gli spettri di massa. Gli studi dimostrano che molte procedure sperimentali, come il terreno3,7, il tempo di coltivazione8, il metodo di preparazione del campione3 e la matrice utilizzata9, influenzano gli spettri di massa ottenuti. Inoltre, alcune specie e ceppi strettamente imparentati generano spettri con solo sottili differenze. Pertanto, gli approcci basati su librerie richiedono procedure rigorosamente standardizzate per generare spettri di massa altamente riproducibili tra le repliche. Piccole variazioni nei protocolli possono compromettere l'efficacia dell'identificazione, specialmente a livello di sottospecie e ceppo1,3,10. Tuttavia, né i database di riferimento forniti dal produttore né i database personalizzati riportati includono procedure visivamente documentate per la costruzione del database e/o l'applicazione di una pipeline di analisi dei dati. Per questo motivo, l'obiettivo di questo lavoro è stato quello di sviluppare, applicare e dimostrare una procedura completa e dettagliata per l'identificazione batterica basata su libreria utilizzando MALDI-TOF MS.

In questa dimostrazione, sono stati raccolti e importati nel software spettri di massa di 15 batteri isolati da un ambiente carsico (Kartchner Cavern, AZ, USA) per costruire un database di modelli. L'elaborazione dei dati e la pipeline di analisi sono state dettagliate utilizzando il database del modello. Infine, gli spettri di massa dei batteri codificati in cieco che sono stati selezionati casualmente da questi 15 batteri sono stati nuovamente raccolti e confrontati con gli spettri di riferimento nel database del modello per l'identificazione. I risultati mostrano che i batteri possono essere identificati correttamente in base ai coefficienti di somiglianza o ai potenziali biomarcatori/classi di picco.

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Protocollo

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Attenzione: i batteri non identificati da qualsiasi ambiente possono essere patogeni e devono essere trattati con cautela utilizzando protocolli di biosicurezza adeguate. Lavora con fermenti vivi deve essere eseguita in un armadio biosicurezza Classe II utilizzando biologica Livello di sicurezza 2 (BSL-2) procedure. Maggiori informazioni su BSL-2 procedure sono disponibili nel manuale CDC / NIH intitolato "biosicurezza in microbiologiche e Biomediche Laboratories," pagine 33-38. Il documento è disponibile online all'indirizzo http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI), tra cui camici / camici, occhiali di sicurezza e guanti di lattice o di nitrile, deve essere indossato. Pratiche microbiologiche standard e precauzioni devono essere seguite, e rifiuti biologici devono essere eliminati in modo appropriato.

I batteri utilizzati in questa manifestazione sono stati isolati da Kartchner Caverns,AZ, USA, da quattro ambienti, tra cui speleothem secca, pietra flusso, speleothem umido e stalattiti gocciolatoio (Tabella 1). Tutti gli isolati sono stati identificati mediante sequenziamento del 16S rDNA e conservati a -80 ° C in 25% glicerolo-R media 2 B. Tutti gli esperimenti sono stati completati a RT.

Nota: Si consiglia di utilizzare lo stesso metodo di preparazione del campione per acquisire spettri di massa per la costruzione di database e gli spettri di massa di incognite. Metodo di preparazione del campione è stato dimostrato in precedenza di influenzare la qualità dello spettro e riproducibilità 3. Utilizzando un metodo di preparazione del campione diverso può causare non corretta identificazione di incognite, soprattutto quando a risoluzione più elevata tassonomica (es, a livello del ceppo) è desiderato.

1. Deposizione sul MALDI destinazione

Attenzione: Diversi protocolli per ottenere estratti di proteine ​​richiedono l'uso di acidi e solventi organici che devono essere utilizzati in conformità con guidElines e le informazioni contenute nei rispettivi Schede di sicurezza dei materiali (MSDS). Adeguato DPI devono essere indossati e varia in base al tipo e il volume di prodotti chimici utilizzati (ad esempio, camici / camici, guanti, occhiali di sicurezza, e la protezione delle vie respiratorie devono essere utilizzati quando si lavora con grandi quantità di solventi infiammabili, tossiche, come acetonitrile, e acidi corrosivi, come acidi formico e trifluoroacetico).

  1. Deposito 1 ml estratto proteico che non contiene cellule vitali (ottenute utilizzando opportuni protocolli, descritte in precedenza 11-13) su una piastra segnale MALDI acciaio inox e lasciarlo asciugare. Sovrapporre l'estratto proteico secco con una soluzione di matrice 1 ml (soluzione di acido-4-idrossi cinnamico α-ciano-), e lasciarlo asciugare.
  2. Per ogni replica biologica, individuare un numero adeguato di repliche tecnici (da 5 a 20 replicati tecnici). Qui, individuare 10 replicati tecnici per ogni replica biologica e 3 repliche biologiche were preparati.
    Nota: Si consiglia di utilizzare una piastra segnale MALDI acciaio lucido quando si utilizza il metodo di preparazione del campione di estrazione di proteine. Utilizzando piastre di acciaio di destinazione terra può causare la diffusione e la miscelazione involontaria di diversi campioni di fuori dei singoli pozzetti del campione.
  3. Deposito 1 ml calibrante di serie sulla piastra segnale e lasciare asciugare. Sovrapposizione con la soluzione di matrice 1 ml e lasciare asciugare.
  4. Deposito soluzione di matrice 2 microlitri sulla piastra porta come controllo negativo.

2. Mass Spectra Acquisition

  1. Utilizzare uno spettrometro di massa MALDI-TOF dotato di un laser di azoto (λ = 337 nm) e gestito utilizzando il software Bruker FlexControl.
  2. Raccogliere ogni spettro di massa in modalità lineare positiva da accumulo di colpi 500 laser con incrementi colpo 100. Impostare la tensione della sorgente di ioni 1 a 20 kV; sorgente di ioni 2 tensione 18.15 kV; e la tensione lenti a 9,05 kV. Si noti che questi parametri sono strumento di specific e potrebbe richiedere una regolazione su altri strumenti per ottenere risultati ottimali.
  3. Impostare l'intervallo di massa-a-charge per la valutazione dello spettro automatica da 2 a 20 kDa per carica. Utilizzare l'algoritmo di rilevamento di picco baricentro. Impostare la soglia minima risoluzione a 100 Da. Impostare il rapporto segnale rumore (S: N) soglia 2. Impostare la soglia minima di intensità a 100.

3. Database di costruzione

  1. Progettazione di database
    1. Creare un nuovo database in BioNumerics 7.1 utilizzando la "procedura guidata Nuovo database".
    2. Creare un tipo di esperimento spettro, ad esempio, Maldi, utilizzando i comandi nel pannello "Tipi di esperimento".
    3. Creare i livelli utilizzando il "pannello di progettazione del database". Aggiungere nuovi livelli utilizzando il "Livello> Aggiungi nuovo livello ..." comando nel menu "Database". Qui, creare "specie" di livello, "replica biologica" "e" replica tecnici "livello, respectively.
  2. Importazione e pre-elaborazione spettri di massa grezza
    1. Esportare gli spettri di massa crudo come file .txt utilizzando FlexAnalysis cliccando sul pulsante "Esporta> Spettro di massa" comando nel menu "File".
    2. Importare gli spettri di massa grezza (.txt) nel database del livello dei replicati tecnici.
    3. Pre-elaborazione spettri di massa grezza.
      1. Importazione e resample (utilizzando un algoritmo quadratico raccordo).
      2. Eseguire una sottrazione della linea di base (con un disco di rotolamento con una dimensione di 50 punti).
      3. Calcola rumore [continua Wavelet Transformation (CWT)], liscia (Finestra Kaiser con una dimensione della finestra di 20 punti e beta di 10 punti), ed effettuare una seconda sottrazione di base (disco a rotazione con dimensioni di 200 punti).
      4. Rileva picchi [CWT con un segnale minimo di rumore (S: N) di 10].
    4. Dopo la pre-elaborazione, salvare modelli caratteristici di ogni spettro di massa, come le liste contenenti picco piccodimensioni, intensità dei picchi, S: N, ecc, nel database.
  3. Creazione di spettri di massa composita
    1. Creare spettri composito da spettri già preparati usando il comando "Riassumere ..." nel menu "Analisi". Scegliere la "replica biologica" come livello target.
    2. Qui, unire spettri di massa di 10 replicati tecnici della stessa colonia per produrre uno spettro di massa composito per quella colonia, con conseguente tre composito spettri di massa per isolare che a livello "replica biologica".
    3. Qui, riassumere i tre spettri composito per creare uno spettro composito per isolare che a livello "Specie".
      Nota: Lo spettro composito è la media punto per punto dei replicati tecnici. Replica con una similitudine (Pearson di correlazione) alla media di inferiore al 95% (impostazione di default) sono esclusi dal composito. Peaks sul spettri compositi sono chiamati solo se sono presenti nel 75% (impostazione di default) dei replicati inclusi. Per le repliche biologiche, queste impostazioni sono state 90 e 60%, rispettivamente.

Analisi 4. Messa Spectrum dati

  1. Selezionare le voci nel database e creare un confronto facendo clic sul comando "Crea nuovo confronto" nel pannello "Confronti".
  2. Qui, utilizzare gli spettri di massa al "replicare tecnici" e / o livelli "replicati biologica" per visualizzare i confronti e analisi.
  3. Analisi cluster basato somiglianza e scalabilità multi-dimensionale (MDS)
    1. Creare gruppi di colori. Selezionare i tre biologica spettri di massa composita e fare clic su "Crea nuovo gruppo dalla selezione" comando nel menu "gruppi" di creare un gruppo per la corrispondente isolato. Designare un colore usato automaticamente per questi tre spettri di massa.
    2. In alternativa, definire gli stati di campo con i colori corrispondenti utilizzando i comandi del "Database voci pannello "tale che qualsiasi raggruppamento basato su questo campo definito utilizza lo stesso colore definito per questo gruppo.
    3. Eseguire l'analisi cluster. Fare clic sul comando "Calcola cluster analysis" nel menu "Clustering". In Impostazioni di confronto Page 1, selezionare il "Pearson di correlazione" e lasciare gli altri parametri di default. A pagina 2, selezionare "UPGMA". Quindi fare clic su "Fine".
    4. Ottenere una trama MDS utilizzando il "ridimensionamento Multi-dimensionale ..." comando nel menu "Statistica".
  4. Corrispondenza Peak
    1. Cliccate sul tipo di spettro "Maldi" nel pannello "Esperimenti". Quindi selezionare "Layout> Immagine". Spectra sono presenti come bande gel.
    2. Eseguire corrispondenza picco con il comando "Do corrispondente picco" nel menu "Spectra".
  5. Individuazione delle classi di punta
    1. Effettuare analisi delle componenti principali (PCA). Evidenziare il "Maldi "tipo di esperimento nel" sperimentale "del pannello e utilizzare la funzione" Analisi delle Componenti Principali ... "comando nel menu" statistico "per eseguire PCA.
    2. Eseguire due vie clustering. Fare clic su "Statistiche> mining Matrix" ... nella finestra "Confronto". L'intensità dei picchi corrispondenti alle classi di punta è rappresentata utilizzando colori diversi (mappa di calore).

5. Batteri identificazione con un database personalizzato

  1. Metodo coefficiente a base di somiglianza
    1. Creare un confronto e generare un dendrogramma basato su spettri di massa a livello di "replicare tecnici" come descritto al punto 4.3.3. Salvare il dendrogramma per il confronto di similarità.
    2. Selezionare uno spettro di massa sconosciuta, e fare clic su "Analisi> Identificare le voci selezionate". Verrà visualizzata la finestra di dialogo di identificazione.
    3. Selezionare la "base di confronto" tipo classificatore (o un classif memorizzataier) e cliccare su "Avanti". Nella pagina successiva, scegli il dendrogramma salvato come un confronto di riferimento e quindi fare clic su "Avanti".
    4. Scegliere la "somiglianza di base" come un metodo di identificazione e quindi fare clic su "Avanti".
    5. Scegliere la "somiglianza Massimo" come metodo di punteggio. Digitare appropriati valori soglia e valori minimi di differenza per ogni parametro e quindi fare clic su "Avanti".
    6. Una volta che i calcoli sono stati completati, viene visualizzata la finestra di identificazione. Nel "Risultati" pannello, vengono elencati i membri del database che meglio corrispondono l'ignoto.
    7. Salvare il progetto di identificazione e validare l'identificazione con il "analisi cross-validazione" comando nel pannello "progetto di identificazione".
  2. Potenziale metodo basato biomarcatore-
    1. Definire le classi di picco. Nella finestra "Matrix Mining", selezionare serie di cime che condividono caratteristiche comuni e definire questi picchi come speciclassi fic picco (potenziali biomarkers) usando "Spectra> Gestisci tipi di classe picco ..." nella "finestra di confronto".
    2. Qui, definire classi di picco specifici per ogni isolano per tutti i 15 isolati.
    3. Selezionare spettri di massa di incognite e abbinare i picchi di questi spettri alle classi picchi definiti come precedentemente descritto.

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Risultati

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Le basi di dati costruiti in questa manifestazione ha avuto quattro livelli, dal più alto al più basso livello, tra cui "tutti i livelli", "Species", "replica biologica" e "replicare tecnici", rispettivamente (Figura 1A). La "replica tecnici" livello conteneva tutti gli spettri di pre-elaborato replicati tecnici. La "replica Biologica" e livelli di "specie" contenevano il (sommario) spettri composito. "Tutti i livelli" contenevano tutta la replica spettri tecnica così come tutti gli spettri composito. <...

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Discussione

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Questa dimostrazione ha mostrato le procedure dettagliate di caratterizzazione e identificazione di batteri utilizzando MALDI-TOF MS e un database personalizzato. Rispetto ai metodi tradizionali molecolari, per esempio, metodi di impronte 16S rDNA sequenziamento, MS MALDI-TOF facilitano più rapida identificazione di diversi batteri. A causa della sua robustezza, questa tecnica è ampiamente utilizzata per caratterizzare i batteri, virus, funghi e lieviti dall'ambiente e in ambito clinico 1,14-16. Inoltre, ...

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Dichiarazioni

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Gli autori Vranckx e Janssens sono dipendenti di Applied Maths NV, il produttore del software di analisi dei dati utilizzato in questo video. Applied Maths NV ha fornito alcuni moduli software evidenziati in questo video, nonché una parte dei costi di pubblicazione associati a questo video.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dal New College of Interdisciplinary Arts and Sciences dell'Arizona State University, Applied Maths NV, e dalla National Science Foundation (ROA Supplement to Award No. MCB0604300). Tutte le opinioni, i risultati, le conclusioni o le raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni della National Science Foundation.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acido &alfa;-ciano-4-idrossi-cinnamicoACROS Organics163440050≥ 97%, CAS 28168-41-8
Software Bruker FlexControlBruker Daltonicsversione 3.0
Software Bruker FlexAnalysisBruker Daltonicsversione 3.0
Software BionumericaMatematicaapplicata versione 7.1

Riferimenti

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