Questo lavoro descrive in dettaglio le procedure per l'identificazione rapida dei batteri utilizzando MALDI-TOF MS. Le procedure di identificazione includono l'acquisizione dello spettro, la costruzione di database e le analisi di follow-up. Vengono presentati due metodi di identificazione, quelli basati sul coefficiente di somiglianza e quelli basati sui biomarcatori.
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Articolo metodologico
L'uso di MALDI-TOF spettrometria di massa e un database personalizzato per caratterizzare batteri indigeni ad un unico ambiente di Cave (Kartchner Caverns, AZ, USA)
In questo articolo
Sommario
Abstract
La spettrometria di massa MALDI-TOF ha dimostrato di essere uno strumento rapido e affidabile per l'identificazione di batteri a livello di genere e specie e, in alcuni casi, di ceppo. Sono stati sviluppati strumenti software disponibili in commercio e open source per facilitare l'identificazione; Tuttavia, in letteratura non è stata descritta alcuna pipeline di analisi dei dati universale/standardizzata. Qui, forniamo una dimostrazione completa e dettagliata delle procedure di identificazione batterica utilizzando uno spettrometro di massa MALDI-TOF. Gli spettri di massa sono stati raccolti da 15 diversi batteri isolati da Kartchner Caverns, AZ, USA, e identificati mediante sequenziamento dell'rDNA 16S. I database sono stati costruiti in BioNumerics 7.1. Sono state eseguite analisi di follow-up degli spettri di massa, tra cui analisi dei cluster, corrispondenza dei picchi e analisi statistiche. L'identificazione è stata eseguita utilizzando campioni codificati in cieco selezionati casualmente tra questi 15 batteri. Vengono presentati due metodi di identificazione: quelli basati sul coefficiente di somiglianza e quelli basati sui biomarcatori. I risultati mostrano che entrambi i metodi di identificazione possono identificare i batteri a livello di specie.
Introduzione
La spettrometria di massa (MS) a tempo di volo/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-TOF) ha dimostrato di essere uno strumento rapido e affidabile per l'identificazione di batteri a livello di genere, specie e, in alcuni casi, di ceppo1-4. MALDI-TOF MS ionizza molecole biologiche (tipicamente proteine) che originano dalle superfici cellulari, dalle membrane intracellulari e dai ribosomi da cellule batteriche intere o estratti proteici1,5. I picchi risultanti formano modelli caratteristici o "impronte digitali" dei batteri analizzati1. L'identificazione dei batteri si basa su queste "impronte digitali" massa-carica.
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Protocollo
Attenzione: i batteri non identificati da qualsiasi ambiente possono essere patogeni e devono essere trattati con cautela utilizzando protocolli di biosicurezza adeguate. Lavora con fermenti vivi deve essere eseguita in un armadio biosicurezza Classe II utilizzando biologica Livello di sicurezza 2 (BSL-2) procedure. Maggiori informazioni su BSL-2 procedure sono disponibili nel manuale CDC / NIH intitolato "biosicurezza in microbiologiche e Biomediche Laboratories," pagine 33-38. Il documento è disponibile online all'indirizzo http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pd....
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Risultati
Le basi di dati costruiti in questa manifestazione ha avuto quattro livelli, dal più alto al più basso livello, tra cui "tutti i livelli", "Species", "replica biologica" e "replicare tecnici", rispettivamente (Figura 1A). La "replica tecnici" livello conteneva tutti gli spettri di pre-elaborato replicati tecnici. La "replica Biologica" e livelli di "specie" contenevano il (sommario) spettri composito. "Tutti i livelli" contenevano tutta la replica spettri tecnica così come tutti gli spettri composito. <.......
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Discussione
Questa dimostrazione ha mostrato le procedure dettagliate di caratterizzazione e identificazione di batteri utilizzando MALDI-TOF MS e un database personalizzato. Rispetto ai metodi tradizionali molecolari, per esempio, metodi di impronte 16S rDNA sequenziamento, MS MALDI-TOF facilitano più rapida identificazione di diversi batteri. A causa della sua robustezza, questa tecnica è ampiamente utilizzata per caratterizzare i batteri, virus, funghi e lieviti dall'ambiente e in ambito clinico 1,14-16. Inoltre, .......
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Dichiarazioni
Gli autori Vranckx e Janssens sono dipendenti di Applied Maths NV, il produttore del software di analisi dei dati utilizzato in questo video. Applied Maths NV ha fornito alcuni moduli software evidenziati in questo video, nonché una parte dei costi di pubblicazione associati a questo video.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal New College of Interdisciplinary Arts and Sciences dell'Arizona State University, Applied Maths NV, e dalla National Science Foundation (ROA Supplement to Award No. MCB0604300). Tutte le opinioni, i risultati, le conclusioni o le raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni della National Science Foundation.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido &alfa;-ciano-4-idrossi-cinnamico | ACROS Organics | 163440050 | ≥ 97%, CAS 28168-41-8 |
| Software Bruker FlexControl | Bruker Daltonics | versione 3.0 | |
| Software Bruker FlexAnalysis | Bruker Daltonics | versione 3.0 | |
| Software Bionumerica | Matematica | applicata versione 7.1 |
Riferimenti
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
- Siegrist, T. J., et al.
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Ristampe e permessi
