Per analizzare i profili di espressione genica cardiaco durante lo sviluppo del cuore zebrafish, RNA totale deve essere estratto dai cuori isolati. Qui, vi presentiamo un protocollo per la raccolta funzionali / cuori che battono per una rapida dissezione manuale da embrioni di zebrafish per ottenere mRNA specifici cardiaco.
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Articolo metodologico
Su larga scala Zebrafish embrionali Cuore dissezione per l'analisi trascrizionale
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il cuore embrionale zebrafish è composto da poche centinaia di cellule, che rappresentano solo una piccola frazione dell'intero dell'embrione. Pertanto, per evitare che il trascrittoma cardiaco venga mascherato dal trascrittoma embrionale globale, è necessario raccogliere un numero sufficiente di cuore per ulteriori analisi. Inoltre, lo sviluppo cardiaco zebrafish procede rapidamente, raccolta cuore e metodi di estrazione di RNA devono essere veloce per garantire l'omogeneità dei campioni. Qui, vi presentiamo un protocollo dissezione manuale rapido per la raccolta funzionali / cuori che battono da embrioni di zebrafish. Questo è un presupposto essenziale per la successiva estrazione di RNA specifico cardiaco-per determinare cardiaco-specifici livelli di espressione genica per analisi trascrittomica, come ad esempio Real time PCR quantitativa (RT-qPCR). Il metodo si basa sulle proprietà adesive differenziali del cuore embrionale zebrafish rispetto ad altri tessuti; questo permette la rapida PHYSeparazione Sical di cardiaca dal tessuto extracardiache da una combinazione di fluidica perturbazione forza di taglio, filtrazione graduale e la raccolta manuale dei transgenici cuori fluorescente.
Introduzione
Zebrafish (Danio rerio) è ampiamente usato in biologia dello sviluppo per studiare organogenesi in vivo per la sua veloce, trasparente e extrauterina sviluppo embrionale, combinato con dimensioni ridotte e la disponibilità di linee giornalista transgeniche con espressione tessuto-specifica di proteine fluorescenti. Questo piccolo vertebrato è particolarmente adatto per studiare lo sviluppo cuore perché l'ossigenazione del primo embrione zebrafish non si basa sul battito cardiaco e il flusso di sangue; queste caratteristiche hanno permesso la caratterizzazione di un gran numero di mutanti cardiovascolari 1,2 e il pesce zebra è ora un....
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Protocollo
Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali della legge tedesca e lo stato di Berlino; gestione zebrafish è stato monitorato dalle autorità locali per la protezione degli animali (LAGeSo, Berlin-Brandenburg).
1. Ottenere embrioni di zebrafish per Cuore Estrazione
- Croce zebrafish giornalista cardiaca come il Tg (myl7: EGFP) twu34 linea transgenica 9 al fine di ottenere embrioni con espressione GFP-specific cuore.
- Mantenere gli embrioni in acqua uovo a 28,5 ° C, fino alla fase embrionale desiderato 10,11. Assicurarsi che la popolazione embrione raccolto è om....
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Risultati
Qui, descriviamo un esperimento rappresentativo dissezione cuore con il pesce zebra Tg (myl7: GFP) twu34 transgenici linea 9, che esprime la proteina verde fluorescente (GFP) esclusivamente all'interno del miocardio (Fig. 1). Abbiamo raccolto sia il cuore sezionato e gli embrioni da cui sono stati ricavati per valutare la purezza del campione cuore. In breve, omozigote Tg (myl7: GFP) twu34 zebrafish 9 sono stati outcrossed con wild-type in modo che tutti i cu.......
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Discussione
Questo protocollo permette il rapido arricchimento di zebrafish tessuto cardiaco embrionale per analisi dell'espressione genica. La quantità e la qualità del campione RNA cardio-specifica dipende molto pochi passi fondamentali: in primo luogo, la quantità di campione viene notevolmente migliorata se la perdita di cuori è impedito ad ogni passo del protocollo, poiché la purificazione dell'RNA funziona solo con sufficiente materiale di partenza. In secondo luogo, la purezza del campione, che dipende interamente sp.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare C. Burns, C. McRae per aver delineato il principio di base di questo protocollo di purificazione e F. Priller per l'implementazione iniziale di questo metodo nel nostro laboratorio. S.A.-S. è sostenuto da una cattedra Heisenberg della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione DFG SE2016/7-1.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Attrezzature per l'allevamento dei pesci e la raccolta delle uova | vedere il Zebrafish Book11 per i dettagli | ||
| Stereomicroscopio | |||
| Microcentrifuga | |||
| Spettrofotometro | UVad es. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| di elettroforesi degli acidi nucleiciPiastre di Petri da 4 cm Ø, rivestite con agarosio all'1% in terreno | |||
| Micropipette e puntali (P20, P100, P1000) | |||
| Provette da centrifugazione da 1,5 ml Provette | |||
| da centrifugazione da 15 ml e 50 ml | |||
| Coppia di pinze | |||
| Dumont #5ExactaCruz&commercio; Puntali rotondi per il caricamento di gel in rack sterile, 1-200μ l | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μ m filtro (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μ m filtro (Filtri di pre-separazione-30 & micro; m) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Gel ad aggancio di fase, pesante, tubi da 1,5 ml | Prime | 2302810 | |
| Acqua d'uovo media | 60 μ g/ml Sali marini oceanici istantanei in ddH2O, 0,00001% (p/v) blu di metilene | ||
| E3 medio | 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 | ||
| Tricaina (acido 3-amminobenzoicoestere) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 mg/ml Soluzione madre di tricaina, pH 7 |
| 1% agarosio (in terreno E3) | |||
| 1% gel di agarosio (in tampone TBE) | |||
| Leibovitz´ s L-15 medio | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Siero Fetale Bovino) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glicogeno | Invitrogen | 10814-010 | 20 µ g/µ l in acqua priva di RNasi, |
| cloroformio, | |||
| isopropanolo | |||
| al 75% (in DEPC-ddH2O) | |||
| Acqua priva di nucleasi o ddH2O | |||
| tampone | |||
| , tampone TBE (Tris/Borato/EDTA) per elettroforesi |
Riferimenti
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular ....
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Ristampe e permessi
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