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Articolo metodologico

Il Coniglio Blood-shunt modello per lo studio di acuta e sequele tardive di emorragia subaracnoidea: Aspetti tecnici

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DOI:

10.3791/52132

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2 ottobre 2014

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1Department of Intensive Care Medicine, University and Bern University Hospital (Inselspital), 2Department of Neurosurgery, Kantonsspital Aarau, 3Laboratories for Neuroscience Research in Neurosurgery, Boston Children's Hospital, 4Harvard Medical School, Boston Children's Hospital, 5Department of Neurosurgery, University and Bern University Hospital (Inselspital), 6Department of Neurosurgery, University Hospital Cologne, 7Institute of Pathology, Länggasse Bern

In questo articolo

Sommario

Il modello sperimentale di emorragia subaracnoidea (SAH) con shunt sanguigno controllato a pressione intracranica nel coniglio combina le procedure standard: incannulamento dell'arteria succlavia e puntura transcutanea della cisterna magna, che consente di imitare da vicino le condizioni fisiopatologiche umane dopo SAH. Presentiamo istruzioni dettagliate e discutiamo i punti chirurgici chiave per una creazione sperimentale di SAH di successo.

Abstract

Lesione cerebrale precoce e ritardata vasospasmo cerebrale entrambi contribuiscono a risultati sfavorevoli dopo emorragia subaracnoidea (SAH). Modelli animali riproducibili e controllabili che simulano entrambe le condizioni sono al momento raro. Pertanto, sono necessari nuovi modelli, al fine di mimare condizioni fisiopatologiche umani derivanti da SAH.

Questo rapporto descrive le sfumature tecniche di un sangue-shunt modello SAH coniglio che consente il controllo della pressione intracerebrale (ICP). Un shunt extracorporea è posto tra il sistema arterioso e lo spazio subaracnoideo, che consente esaminatore indipendente SAH in un cranio chiuso. Step-by-step istruzioni procedurali e le attrezzature necessarie sono descritte, così come considerazioni tecniche per produrre il modello con mortalità minima e morbilità. Dettagli importanti necessarie per la riuscita creazione chirurgica di questo modello SAH coniglio robusto, semplice e coerente ICP-controllato sono descritti.

Introduzione

Emorragia subaracnoidea aneurismatica (SAH) è uno dei più in pericolo di vita condizioni neuropatologici, spesso portando a danni neurologici permanenti o la morte 1. Precedenti ricerche si è concentrata sul vasospasmo cerebrale ritardata (DCVS) come l'eziologia primaria di deficit neurologici associati con SAH 2. Tuttavia, generalmente i poveri risultati clinici di pazienti affetti da emorragia subaracnoidea dopo il trattamento del vasospasmo ha portato ad un ampliamento del centro di ricerca per includere gli effetti della lesione cerebrale precoce (EBI) dopo SAH 3. Maggiore comprensione del significato di entrambi EBI e DCVS nel contribuire a poveri risultati clinici dopo SAH è essenziale per lo sviluppo di più efficaci strategie terapeutiche.

Fino ad oggi, singola e doppia iniezione di sangue autologo nella cisterna magna è stato il metodo standard per l'induzione SAH per lo studio di DCVS 2-6. Anche se comunemente usato in studi precedenti,questo modello molto probabilmente non riprodurre le modifiche principali neuropatologici associati SAH indotto EBI 7. Al contrario, la perforazione endovascolare è noto per produrre gravi alterazioni fisiopatologiche acute che in parte imitano i sintomi di EBI 7.

La relazione descrive un modello di coniglio romanzo SAH progettato per consentire indagine sia EBI e DCVS, consentendo caratterizzazione più accurata della patologia SAH indotta 8-10. Con la tecnica descritta, modello standard cisterna magna è adattato collegando il sistema arterioso dell'arteria succlavia e la cisterna magna tramite uno shunt extracorporea. Il flusso di sangue è quindi legata alla fisiologia del coniglio e guidato dalla differenza di pressione tra il sangue arterioso e la pressione intracranica. L'emorragia si arresta quando la pressione intracerebrale (ICP) è uguale pressione diastolica e il sangue nel sistema shunt coagula. Utilizzando l'host & #8217; s fisiologia riduce SAH induzione esaminatore-dipendenti, portando ad un modello più coerente di SAH che produce in modo affidabile sia EBI e DCVS fenotipi 3,8-10.

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Protocollo

Tre mesi di età femminile conigli New Zealand che pesano 2,5-3,5 kg sono stati utilizzati per questa procedura. Lo studio è stato eseguito in conformità con il National Institutes of linee guida sanitarie per la cura e l'uso di animali da esperimento e con l'approvazione del Comitato del Cantone di Berna, Svizzera (approvazione N ° 105/13) Animal Care. Tutte le procedure chirurgiche sono state eseguite in condizioni sterili presso l'Istituto Sperimentale Chirurgica del Dipartimento di Ricerca Clinica presso l'Università di Berna Hospital di Berna, in Svizzera. Un anestesista veterinario monitorato gli animali durante l'intervento chirurgico e durante il recupero.

1 Preparazione degli animali, posizionamento e succlavia Cannulazione

  1. Indurre anestesia generale nel coniglio con iniezione intramuscolare di ketamina (30 mg / kg; Ketalar, 50 mg / ml) e xilazina (6 mg / kg; Xylapan 20 mg / ml) e la profondità di controllo dell'anestesia controllando la risposta del coniglio nocivi stimoione (ad esempio, un pizzico tep). Vedere 1.7 in caso di risposta positiva.
  2. Abbassare le palpebre inferiori di entrambi gli occhi e applicare una piccola quantità di pomata per le palpebre per prevenire la secchezza e l'ulteriore irritazione.
  3. Cateterizzarla la vena orecchio laterale con un Gbutterfly venflon 20 (20 G catetere vascolare), fissare con nastro adesivo, e connettersi a un sacchetto di gravità contenente 0,9% di cloruro di sodio (500 ml / 24 hr) e ketamina (40 mg / kg / ora) / xilazina (4 mg / kg / ora) per endovenosa continua (iv) l'anestesia. Somministrare analgesici supplementari ogni 15 min iv (Fentanyl, 1 mcg / kg). Nota: Evitare anestetici volatili del gas, che è associato con una diminuzione CPP, aumentando CBF, e la diminuzione del tasso metabolico cerebrale di ossigeno 11 anestetici endovenosi offrono più caratteristiche ideali per Neuroanestesia preservando CBF e vasocostrizione cerebrale, 12, che è di importanza superiore quando si studia cerebrale. vasospasmo. Inoltre, anche se la mortalità è aumentata in SPONTaneously respirazione animali, essa può meglio imitare la situazione umana di SAH acuta.
  4. Fornire ossigeno (1 - 2 L / min) tramite una maschera respiratoria che permette di anidride carbonica di fine espirazione (EtCO2) monitoraggio.
  5. Installare un elettrocardiogramma a 3 canali (ECG) .Montare tre elettrodi sottocutanei in una disposizione triangolare sul lato ventrale del coniglio; in particolare, posizionare un elettrodo sulla regione mediotoracico destra (con distanza dal campo sterile rasata per l'arteria succlavia incannulamento) e due elettrodi nel basso addome distribuiti su entrambi gli arti.
  6. Monitorare la profondità dell'anestesia ogni 15 minuti durante l'intervento seguendo frequenza respiratoria, frequenza cardiaca (HR) controllato dal segnale ECG, e la reazione alla stimolazione nociva.
  7. In caso di risposta positiva alla stimolazione nocicettiva (pizzico tep), adeguare la profondità dell'anestesia da ketamina bolo (6 mg / kg) e xilazina ev in bolo (0,05 mg / kg) ev e / o un bolo analgesia supplementare con Fentanyl (1 mcg / kg) iv
  8. Fissare il coniglio in posizione supina su una piastra riscaldante corpo, inclinando la testa di 20 ° verso il basso e ruotando leggermente controlateralmente al lato su cui sarà esposta l'arteria succlavia.
  9. applicare unguento occhio e preparare l'area per un intervento chirurgico con la rasatura dei capelli sopra il muscolo pettorale destro intorno al terzo medio della clavicola, e sopra il cranio frontal-, parietal- e occipitale, il collo, e sul diritto arteria femorale comune.
  10. Disinfettare la pelle per 3 minuti con un ampio spettro di antisettico, ad es., Povidone-iodio.
  11. Coprire il coniglio con teli sterili. Eseguire tutte le altre procedure in condizioni sterili e spesso applicano il 4% papaverina HCl e soluzione antibiotica (neomicina solfato 5 mg / ml) per via topica per prevenire il vasospasmo arterioso dalla manipolazione nave e infezioni locali.
  12. Infiltrati il ​​muscolo pettorale con anestetici locali (lidocaina 1% massimo 6 mg / kg). Fare un incisione cutanea parasternale e preparare ilmuscolo pettorale. Utilizzando il microscopio, sezionare l'arteria succlavia e fissare con una prossimale e distale legature (4-0 suture polifilamento) intorno l'estremità esposta. Mantenere una legatura vicino al controllo prossimale in posizione per fissare il catetere e legare il vaso distale.
  13. Eseguire un arteriotomia nella parete dell'arteria succlavia incidendo la arteria con un microscissor curvo e cannulate succlavia retrograda con un piccolo intravasale rubinetto a 3 vie. Fissare il catetere doppio nodo legatura verso la legatura distale al fine di impedire la torsione arteriosa o piegatura della parte prossimale dell'arteria e di evitare la fuoriuscita slittamento o massiccio.

2. Pressione del sangue e monitoraggio arterioso Sangue Gas

  1. Collegare il 3-way rubinetto di arresto per i) la cannula intravasale di gas del sangue arterioso (ABG) analisi, pH, PaCO2, PaO2, il bicarbonato, l'eccesso di base, e SO 2, ii) il sangue arterioso invasivapressione dispositivo di misurazione, e iii) il dispositivo shunt.
  2. Raccogliere campioni di sangue per lo stato ABG (PaCO2, PAO 2) e monitorare costantemente parametri standard cardiovascolari e respiratorie (pressione sanguigna, HR, ECG, frequenza respiratoria e di fine espirazione di CO 2) e di trasferimento dei dati tramite l'interfaccia di uscita analogica ad un analogico- convertitore digitale / registratore di dati e memorizzare.
    NOTA: Le pressioni saranno azzerati a livello del cuore prima e dopo ogni sessione, e la calibrazione pressione analogico / digitale-convertitore e sistema di registrazione dei dati sarà fatto una volta prima che la serie si avvia.

3 Baseline Digital sottrazione angiografia

  1. Inserire un dispositivo di dimensionamento esterno (piccola sfera) su entrambi gli angoli mandibolari per calibrare l'angiografia.
    NOTA: Questo permette di confronto esatto delle misurazioni post-hoc di basale e follow-up diametro del vaso.
  2. Eseguire la sottrazione angiografia digitale (DSA) da retrograda intra-abolo rterial di non ionico Iopamidolo (0,6 ml / kg, 5 ml / sec per 2 sec) attraverso l'arteria cannulata e lavare immediatamente la cannula dopo l'iniezione del bolo di soluzione fisiologica per evitare occlusione di quest'ultimo.
  3. Ottenere immagini (7 immagini a 14 sec) del sistema vertebrobasilare utilizzando una rapida registrazione angiografia sequenziale in posizione obliqua 5 ° sinistro anteriore.
  4. Infiltrati l'area intorno alla destra arteria femorale comune con anestetici locali (lidocaina 1%, massimo 6 mg / kg). Fai una piccola incisione cutanea inguinale. Utilizzando il microscopio per la visualizzazione, sezionare l'arteria femorale comune e fissare con una prossimale e distale legature (4-0 suture polifilamento) intorno l'estremità esposta.
  5. Dopo arteriotomia, incannulare l'arteria femorale con una guaina 5-F. Lavare l'attacco laterale della guaina con soluzione fisiologica.
  6. Avanzare un catetere 5-F nell'arteria brachiocefalica attraverso la guaina sotto fluoroscopia. Creare una mappa stradale, poi avanzare un filo guida di the sistema vertebro-basilare. Iniettare un bolo di non ionico Iopamidolo (0,6 ml / kg, 5 ml / sec a 2 sec) per DSA come descritto al punto 3.2.

4. rotazione alla posizione prona

  1. Dopo basale DSA, riposizionare il coniglio da posizione supina a quella prona. Fare attenzione a non manipolare o spostare la posizione dei cateteri intra-arteriose.
  2. Posizionare la testa in un testa-porta ad un angolo di 30 °, orientato a testa in giù.

5. Cisterna Magna Puncture

  1. Disinfettare la pelle sopra la testa e il collo con Povidone-iodio 3 volte per 1 minuto ciascuna, e coprire l'area chirurgica con teli sterili.
  2. Inserire un 22 G x 40 mm pediatrica ago accesso spinale transcutanea nella cisterna magna, senza alcuna incisione cutanea preventiva o spostamento muscolare.
  3. Verificare che l'animale è completamente anestetizzato garantendo una mancanza di risposta toe-pinch prima di far scorrere l'ago verso il basso lungo la osseo protuberanza occipitale esternafinché non viene rilevato un gap; non spingere ulteriormente l'ago.
  4. Verificare il corretto posizionamento dell'ago osservando sgocciolatura spontanea del liquido cerebrospinale con la testa di coniglio inclinato verso il basso con un angolo di 20 ° per pochi minuti.

6 Installazione di pressione intracranica e cerebrale monitoraggio del flusso sanguigno

  1. Dopo la pelle linea mediana e galea incisione, inserire un piccolo divaricatore chirurgico.
  2. Fai tre turno osteotomie (2 mm di diametro) con un microdrill ad alta velocità nella parte frontale del cranio secondo i punti di riferimento cranio esterne (Figura 1) 9, vale a dire, il bulbo olfattivo e frontale bilaterale per il posizionamento di un dispositivo neuromonitoring se necessario. Usare un righello scala millimetrata per determinare le coordinate di bava posizionamento del foro come segue: pressione intracranica (ICP) di monitoraggio in linea midpupillary, 1-2 mm dalla linea sagittale mediano; intraparenchimali sonde laser-Dopplerquattro a cinque mm anteriormente e lateralmente al bregma (Figura 1).
  3. Visualizza la dura madre, ed eseguire l'emostasi meticolosa: usare la cera ossea per l'emostasi ossea in virtù della sua azione tamponamento ed eseguire l'emostasi locale utilizzando la coagulazione bipolare della dura.
  4. Posizionare il intraparenchimale pressione intracranica (ICP) tip monitor nel bulbo olfattivo di destra ad una profondità di 2 mm e quindi calibrare.
  5. Bel posto sonde ad ago i due laser-Doppler flussimetria con un sistema di bloccaggio esterno e inserirli nei fori corrispondenti bave sia gli emisferi destro e sinistro frontali laterali al sistema ventricolare, cioè, sulla linea mediana per evitare interferenze con il liquido cerebrospinale. Posizionare una sonda ad ago a una profondità di 2,5 mm.
  6. Dopo il posizionamento delle sonde neuromonitoring, sigillare tutti i fori bave con uno spesso tappo di cera ossea al fine di mantenere il cranio tenuta di fluido.
  7. Misurare i parametri di base della pressione arteriosa media (MAP), ICP e il flusso ematico cerebrale (CBF) utilizzando un monitor multiparametrico e tessuti laser-Doppler Monitor perfusione sanguigna a quattro canali.

7 Shunt induzione

  1. Collegare l'ago di accesso vertebrale nella cisterna magna per l'arteria succlavia in precedenza cateterismo attraverso tubi monitoraggio della pressione sanguigna-riempita. Utilizzare il rubinetto a 3 vie per la misurazione della pressione arteriosa e come porta di prelievo di sangue.
    NOTA: La gravità di SAH dipende dalla quantità di sangue, e può essere approssimativamente stimato l'ampiezza di coaguli subaracnoidea al momento del raccolto cervello 5,11.
  2. Monitorare costantemente MAP, HR, ECG, frequenza respiratoria e di fine espirazione di CO 2 ad una frequenza di campionamento di 1 Hz da 6 min prima fino a almeno 20 min dopo SAH.
  3. Verificare che l'animale è completamente anestetizzato garantendo una mancanza di risposta pizzico punta prima di aprire il collegamento shunt tra l'arteria succlavia e la cisterna magna per indurre SAH dal Tem pressionent.
    NOTA: Un SAH controllato può essere ottenuto chiudendo lo shunt in qualsiasi punto di tempo (ad esempio, ad un livello desiderato di ICP.).
  4. Registrare i valori di stato stazionario per un periodo di tempo di circa 15 min.
  5. Dopo ICP raggiunge il suo picco, tenere l'ago di accesso spinale in vigore fino ICP ritorna a uno stato stazionario vicino ai valori basali. Se l'altopiano ICP viene mantenuta per più di 10 secondi o se ICP diminuisce spontaneamente, chiudere lo shunt.
  6. Rimuovere CBF sonde fine-ago e sonda ICP, tappare buchi bave con la cera ossea, rimuovere tutti i cateteri (compresi catetere succlavia, dal momento che la manipolazione del catetere con emorragia consecutiva è associata ad alta morbilità e mortalità, e aumenta il tasso di infezione), effettuare una rigorosa irrigazione ferita con solfato di neomicina e suturare la pelle.

8 Gestione postoperatoria

  1. La procedura dura circa 2 ore. A causa delle emivite di ketamina e xilazina, il tempo di recupero di animal è abbastanza breve - circa 1 ora. Gli animali sono tenuti sotto una lampada riscaldante durante il recupero. Non sono forniti altri liquidi. Durante questa prima fase di recupero post-operatorio, si applicano buprenorfina 0,02 mg / kg sc ogni 8 ore per 24 ore.
  2. Applicare le patch fentanil transdermico a matrice rilasciando 12,5 mcg / ora nella regione del collo rasato degli animali per l'analgesia efficace nei prossimi 72 hr.
  3. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
  4. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico in compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.

9 Follow-up digitale sottrazione angiografia per valutare DCVS al Day 3

  1. Eseguire i passaggi 1,1-3,6 come descritto sopra.
  2. Euthanize gli animali per iniezione intra-arteriosa bolo di thiopenthal sodio (40 mg / kg) (Pentothal, Ospedalia AG, Hünenberg, Svizzera). Nei casi in cui istologia e immunohistochemistry è necessario, effettuare una perfusione-fissazione intracardiaco a temperatura ambiente ad una pressione di perfusione 100 cm H 2 O.

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Risultati

Il modello di shunt sangue di coniglio di SAH descritto in questo rapporto produce EBI nell'ippocampo (Figura 2A, B), la corteccia basale (Figura 2A, B), e la vascolarizzazione cerebrale (Figura 2C) già a partire 24 ore dopo l'infortunio e mostra una caratteristica distribuzione del sangue (Figura 2D) 8. Inoltre, il modello attiva da moderata a grave gradi di DCVS in tre giorni dopo SAH induzione (Figura 3) 10. Il ...

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Discussione

Il modello di shunt produce patologia simile a quello osservato negli esseri umani dopo SAH acuta 3,8,10. E 'stato suggerito che EBI può esacerbare, mantenere e persino scatenare DCVS 12, e come tale questo modello può essere di aiuto nelle indagini sia nella fase DCVS precoce e tardiva, tra cui EBI e DCVS interazioni seguenti SAH. In particolare, ripetibile in vivo DCVS tecniche di monitoraggio, compresi i DSA 13, tomografia computerizzata angiografia 14, e Doppl...

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Dichiarazioni

Nessuno. Gli autori non hanno alcun interesse finanziario o commerciale in nessuno dei farmaci, materiali o attrezzature utilizzate. Non sono stati ricevuti finanziamenti specifici per questo lavoro. Gli autori sono gli unici responsabili della progettazione e della conduzione dello studio presentato e non riportano alcun conflitto di interessi riguardo ai materiali e ai metodi utilizzati in questo studio o ai risultati specificati nell'articolo. Confermano l'aderenza agli standard etici. Lo studio è stato condotto in conformità con le linee guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da esperimento e con l'approvazione del Comitato per la cura degli animali del Cantone di Berna, Svizzera (approvazione #109/07 e #107/09).

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Laurie von Melchner, Bern University Hospital, Dipartimento di Neurochirurgia, Berna, in Svizzera, per la revisione e la modifica del manoscritto e Paskus Geremia, Hospital di Boston per bambini, Boston, MA per la correzione della bozza iniziale. Apprezziamo la gestione sapiente di cura degli animali, anestesia e assistenza operativa da Daniel Mettler, DVM, Max Müller, DVM, Daniel Zalokar, e Olgica Beslac, Experimental Surgical Institute, Dipartimento di Ricerca Clinica, Università di Berna, Berna, Svizzera. Ringraziamo Michael Lensch, Responsabile Ricerca Infermiere, Dipartimento di Terapia Intensiva, Università di Berna Hospital e Università di Berna, Berna, Svizzera, per il monitoraggio dei dati in tempo reale e post-elaborazione dei parametri fisiologici. Ringraziamo Edin Nevzati, Carl Muroi, e Salome Erhardt, per la loro eccellente laboratorio di assistenza tecnica ed operativa.

Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento della Intensive Care Medicine, Università di Berna Hospital e Università di Berna, Berna, Svizzera, il Dipartimento di Ricerca Clinica, Università di Berna, Berna, Svizzera, e il Fondo di ricerca del Kantonsspital Aarau, Aarau, Svizzera. Ringraziamo Elsevier, il permesso di ristampa per figure 1 e 2.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Attrezzatura
Microscopio operatorioZeiss, Jena, GermaniaZeiss, OPMI-MD
microscopio operatorio Attrezzatura chirurgicaB. Braun, GermaniaPinze mediche n. 5; forbici per vasi 8 cm; microclip 4 mm
RespiratoreHugo Sachs
Tagliacapelli3M Surgical Clipper Starter Kit 9667A
Piastra calda corporeaFHC
Analizzatore di gas ematiciRadiometro, Copenaghen, DanimarcaABL 725
Monitoraggio cardiacoMonitor multiparametrico Camino, Integra, Plainsboro, NJ, USAP-05
Analisi softwareBIOPAC Systems, Inc., Goleta, CA, USABiopac MP100 e software acqKnowledge, versione 3.8.1
Analisi del softwareImagePro Discovery, MediaCybernetics, Silver Spring, MD, USAVersione Image-Pro Plus 
Apparecchio per angiografiaDFP 2000 A-ToshibaMIIXR0001EAA
monitor ICPCamino Laboratories, San Diego, CA, USAMonitor ICP, Modello 110-4B
Monitor di flusso sanguignoOxford Optronix Ltd., Oxford, Regno UnitoSoluzione di microsfere KIT
CAL Sonde ad ago sottile per flussimetria laser DopplerOxford Optronix Ltd., Oxford, Regno UnitoMNP110XP, diametro 0,48 mm
Tubo a pressioneB. Braun, GermayPE 1,0 mm & volte; 2,0 mm
Monitor per anestesiaGE Medical Systems, Svizzera Datex S5
Monitor 20
GCatetere endovenoso Smiths MedicalJelco, REF 4057
Catetere venoso centrale a tre lumi da 5,5 FConnettori, Tagelswangen, SvizzeraCatetere in silicone STH-C040
ago da 22 G x 40 mm.Emergo Group Inc., Paesi Bassi
Microtrapano ad alta velocitàStryker, Soletta, Svizzera5400-15 
Cera d'ossoEthicon, Johnson & Johnson, NJ, USAETHW31G
Forcipe bipolareAesculap, Inc., PA, Stati UnitiUS349SP 
KetaminQualsiasi prodotto generico
XilazinaQualsiasi prodotto generico
BuprenorfinaQualsiasi prodotto generico
FentanylQualsiasi prodotto
generico Cerotti transdermici alla matrice di fentanil Qualsiasi prodotto generico
Lidocaina 1%Qualsiasi prodotto generico
4% papaverin HCl Qualsiasi prodotto generico
Neomicina solfato Research Organics Inc., OH, USAQualsiasi prodotto generico
Povidone-iodio Qualsiasi prodotto generico
0,9% cloruro diQualsiasi prodotto generico
IopamidoloAbott Laboratories, IL, USAQualsiasi prodotto generico
Sutura riassorbibile 3-0Ethicon Inc., USASutura VCP824G
5-0 non assorbibileEthicon Inc., USASuture in polifilamento 8618G
4-0Ethicon Inc., USAVCP284G
Catetere vascolare sodio

Riferimenti

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