L'uso di fluorofori per l'imaging in vivo può essere notevolmente limitato dall'opsonizzazione, dalla rapida eliminazione, dalla bassa sensibilità di rilevamento e dagli effetti citotossici sull'ospite. L'incapsulamento dei fluorofori nei liposomi mediante idratazione ed estrusione del film porta al quenching e alla protezione della fluorescenza, consentendo l'imaging in vivo con un'elevata sensibilità di rilevamento.
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Articolo metodologico
Fluorescenza tempra di un vicino infrarosso Fluoroforo incapsulata all'interno di liposomi come strumento per In Vivo Optical Imaging
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In questo articolo
Sommario
Abstract
L'imaging ottico offre un'ampia gamma di modalità diagnostiche e ha suscitato molto interesse come strumento per l'imaging biomedico. Nonostante l'enorme numero di tecniche di imaging attualmente disponibili e i progressi nella strumentazione, c'è ancora bisogno di sonde altamente sensibili che siano adatte all'imaging in vivo. Un problema tipico delle sonde fluorescenti precliniche disponibili è la loro rapida clearance in vivo, che riduce la loro sensibilità di imaging. Per aggirare la clearance rapida, aumentare il numero di molecole di colorante nel sito bersaglio e quindi ridurre l'autofluorescenza di fondo, è stato effettuato l'incapsulamento del colorante fluorescente nel vicino infrarosso, DY-676-COOH in liposomi e la verifica del suo potenziale per l'imaging in vivo dell'infiammazione. DY-676 è noto per la sua capacità di autoestinguersi ad alte concentrazioni. Per prima cosa abbiamo determinato la concentrazione adatta per l'autoestinzione, quindi abbiamo incapsulato questa concentrazione di estinzione all'interno acquoso dei liposomi PEGilati. Per convalidare il potenziale di estinzione e attivazione dei liposomi utilizziamo un metodo di congelamento duro che porta al danneggiamento delle membrane liposomiali senza intaccare il colorante incapsulato. I liposomi caratterizzati da un alto livello di quenching della fluorescenza sono stati chiamati Lip-Q. Abbiamo dimostrato con esperimenti con diverse linee cellulari che l'assorbimento di Lip-Q avviene prevalentemente per fagocitosi, che a sua volta ha permesso la caratterizzazione del suo potenziale come strumento per l'imaging in vivo dell'infiammazione in modelli murini. Inoltre, utilizziamo un modello di edema indotto da zymosan nei topi per convalidare il potenziale di Lip-Q nell'imaging ottico dell'infiammazione in vivo. Considerando il possibile assorbimento dovuto all'effetto di maggiore permeabilità e ritenzione (EPR) indotto dall'infiammazione, una formulazione liposomica sempre attiva con una bassa concentrazione non spenta di DY-676-COOH (denominato Lip-dQ) e il DY-676-COOH libero sono stati confrontati con Lip-Q in studi sugli animali.
Introduzione
I liposomi sono stati intensamente studiato e servire come uno dei sistemi di rilascio di farmaci biomedici più biocompatibili per applicazioni cliniche 1,2. Essi sono composti principalmente di fosfolipidi e colesterolo, che sono entrambi composti biocompatibili mimano parti di membrane cellulari naturali. Considerando sostanze idrofile possono essere intrappolati all'interno acquosa, agenti lipofili possono essere incorporati all'interno liposomiale doppio strato fosfolipidico 3. Incapsulamento di sostanze entro l'interno acquosa di liposomi garantisce la protezione contro la degradazione in vivo e impedisce anche il sistema host da effetti tossici di farmaci citotossici utilizzati per la terapia di malattie, per esempio chemioterapici volti a distruggere le cellule tumorali. La modifica della superficie liposomiale con polimeri come polietilenglicole (PEGylation) si estende ulteriormente il tempo di circolazione sanguigna liposomiale in vivo a causa di stabilizzazione sterica 4. Moreover, liposomi possono sequestrare elevate concentrazioni di varie sostanze quali proteine, sostanze idrofile 5,6 7,8 e 9 enzimi. Servono pertanto strumenti terapeutici e diagnostici clinici affidabili che meritano la loro approvazione per la consegna di farmaci citotossici, come doxorubicina per la terapia del cancro 4. Grazie alla loro flessibilità, liposomi possono essere caricati con fluorocromi per uso chirurgico di diagnostica e di immagine-guidata.
Imaging di fluorescenza prevede un costo-efficace e non invasivo in strumento diagnostico vivo che però, richiede alcuni requisiti di base. Si potrebbe dimostrare che fluorocromi che si adattano meglio per l'imaging in vivo hanno assorbimento caratteristico e massimi delle emissioni nel range in cui dispersione della luce e dispersione, nonché autofluorescenza dei tessuti d'origine da acqua ed emoglobina è bassa. Pertanto, tali sonde hanno il loro massimi abs / em tra 650 e 900 nm 10. Oltre a questo, la stabilità di fluorocromi sia in vitro che in vivo è critica, come opsonizzazione e rapida clearance possono limitare notevolmente la loro applicazione per imaging in vivo 11. Altri effetti quali la scarsa stabilità e bassa sensibilità o effetti citotossici sugli organi bersaglio come si è visto con verde di indocianina (ICG) 12-16, sono indesiderati e devono essere presi in considerazione quando si progetta le sonde per l'imaging in vivo. Queste osservazioni hanno portato allo sviluppo attivo di diversi fluorocromi NIR preclinici, nanoparticelle nonché nuove tecniche di imaging in vivo di processi infiammatori, cancro e per immagine guidata chirurgia 17-20. Nonostante la stabilità di più (fluorescenza vicino infrarosso) NIRF preclinico coloranti in vitro, la perfusione rapida e passaggio attraverso il fegato ei reni impediscono il loro uso in imaging ottico in vivo di malattie e processi infiammatori.
S copi "> Abbiamo quindi presentiamo un protocollo per l'incapsulamento di fluorocromi come il ben caratterizzato vicino infrarosso colorante fluorescente DY-676-COOH, noto per la sua tendenza ad auto-estinzione alle concentrazioni relativamente elevate di 21 in liposomi. Ad alte concentrazioni H- formazione di dimero e / o-pi stacking interazioni tra molecole fluoroforo situate all'interno di ciascun altro risultato raggio Förster in Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) tra le molecole fluorocromi. In bassa concentrazione lo spazio tra le molecole fluoroforo aumenta, impedendo in tal modo l'interazione-pi impilamento e H-dimero formazione e la conseguente elevata emissione di fluorescenza. La commutazione tra alta e bassa concentrazione e l'accompagnamento della fluorescenza e l'attivazione è una strategia promettente che può essere sfruttata per l'imaging ottico 22. A questo proposito, incapsulamento di alte concentrazioni di colorante NIRF DY-676-COOH all'interno acquosa di liposomi è più favorable per l'imaging in vivo che il colorante libera. La sfida del metodo consiste innanzitutto nel incapsulamento corretta e in secondo luogo, la validazione dei benefici derivanti da incapsulare alte concentrazioni di colorante. Confrontando le proprietà di imaging di liposomi bonifica con quello del colorante libero ed anche con una formulazione non quenched liposomi con basse concentrazioni di colorante è indispensabile. Mostriamo da un protocollo pellicola idratazione ed estrusione semplice, ma molto efficace in combinazione con gelo e disgelo alternative che l'incapsulamento delle concentrazioni tempra di DY-676-COOH in liposomi è fattibile. Altri metodi utilizzati per preparare liposomi come il metodo di evaporazione a fase inversa 23 nonché il metodo di iniezione di etanolo 24 consentono la preparazione di liposomi con alte efficienze di incapsulamento per molte sostanze idrofile. Tuttavia, la natura della sostanza da incapsulare può influenzare l'efficienza di incapsulamento. In effetti,il protocollo pellicola idratazione ed estrusione presentato qui ha rivelato la più alta efficienza per l'incapsulamento di DY-676-COOH. Per illustrare i vantaggi di incapsulamento liposomiale di DY-676-COOH, un modello edema zymosan indotta, che consente lo studio dei processi infiammatori in poche ore, è stato utilizzato. Qui, è dimostrato che liposomi con alte concentrazioni della incapsulato DY-676-COOH sono più adatti per tutto il corpo in imaging ottico vivo di processi infiammatori rispetto colorante libero o la formulazione liposomiale non quenched con concentrazioni basse colorante. Così il protocollo sottostante fornisce un metodo semplice e veloce per produrre liposomi fluorescenti bonifica e la validazione della loro attivazione e di imaging potenziale sia in vitro che in vivo.Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
NOTA: Tutte le procedure sono approvate dal Comitato regionale animali e in conformità con le linee guida internazionali sull'uso etico degli animali.
1. Preparazione dei Materiali e strumenti
- Preparazione della dispersione delle vescicole spontaneamente formate (SFV)
- Sciogliere e preparare le soluzioni madre delle seguenti fosfolipidi: 214 mg / ml fosfatidilcolina d'uovo (EPC), 134 mg / ml di colesterolo, 122 mg / ml 1,2-distearoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [metossi (polietilene glicole) -2000] (sale di ammonio) (mPEG 2000 -DSPE) e 2 mg / ml di 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine- N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4 -yl) (sale di ammonio) (NBD-DOPE) in cloroformio e conservare in fiale di vetro.
- Furnish circa 3 ml di cloroformio in un pallone a fondo rotondo e trasferire il volume appropriato di fosfolipidi magazzino soluzione nel pallone a fondo tondo di preparare liposomi composti da EPC: Chol: mPEG 2000 -DSPE ad un rapporto molare di 6,5: 3: 0.5. Per l'etichettatura doppia fluorescenza di liposomi aggiungere 0,3 mol% NBD-DOPE alla soluzione lipidica.
- Si evapora il cloroformio dalla soluzione fosfolipide organica a pressione ridotta (300 mbar) a 55 ° C utilizzando un evaporatore rotante.
- Dopo si forma una pellicola fosfolipide omogenea, ridurre la pressione a 10 mbar per 1-2 ore per rimuovere depositi cloroformio residuo.
- Mentre il cloroformio evapora, sciogliere DY-676-COOH (6,181 mM) in Tris 10 mM pH 7,4 e riempire un contenitore Dewar con azoto liquido. Accendere un bagno ad ultrasuoni e impostare a 50 ° C.
- Trasferire un volume adeguato (0,5-1 ml) di DY-676-COOH (6,181 micron) soluzione del pallone a fondo tondo per idratare la pellicola fosfolipide asciutto e vortice vigorosamente fino a vescicole spontaneamente formate (SFV) forme di dispersione. Assicurarsi che tutti i fosfolipidi sono dispersi per evitare la perdita dei lipidi.
- Tra attenzionensfer il pallone a fondo rotondo contenente la dispersione SFV in azoto liquido e congelare la dispersione per 3-5 min. Posizionare il pallone a fondo tondo in un bagno ad ultrasuoni a 50 ° C per scongelare la dispersione quindi agitare la dispersione vigorosamente per 1-2 min. Ripetere questa procedura sei volte, per un totale di sette cicli di gelo e disgelo.
- Estrusione di SFV per formare vescicole di liposoma omogenei
- Trasferire la dispersione SFV in una siringa da 1 ml (siringa a) e estrudere la dispersione attraverso una membrana di policarbonato 100 nm con un estrusore LiposoFast-Basic nella siringa-b.
- Estrudere la dispersione dalla siringa-b, di nuovo in una siringa, quindi ripetere il ciclo di dieci volte. A causa di estrusione, la soluzione nei cambiamenti siringa da un aspetto opalescente a una dispersione chiara con il tempo. Dopo dieci cicli (venti singoli gradini estrusione) rimuovere la siringa-b dal dispositivo e estrudere la dispersione per l'ultima volta da una siringa direttamente in un sterile1,5 ml tubo di reazione.
- Purificazione di liposomiale incapsulato DY-676-COOH dal colorante libero
- Preparare una colonna cromatografica di gel utilizzando G25 perline imbevuti di 10 Tris mM tampone pH 7.4 (colonna lunghezza 28 cm, diametro 0,8 centimetri).
- Trasferire 0,5 ml di estrusi di dispersione delle vescicole sul letto di gel e lasciare che la fuga del campione nella matrice gel.
- Eluire liposomi con Tris 10 mM pH 7,4 (Figura 1A) e lavare la colonna fino scarichi colorante libero completamente dalla colonna. Se necessario, raccogliere e riciclare il colorante libero da dissalazione e disidratazione secondo le istruzioni del produttore.
- Concentrare liposomi eluiti mediante ultracentrifugazione (200.000 xg, 2 ore a 8 ° C) poi disperdono in adeguato volume di 10 mM Tris sterile tampone di pH, 7,4.
- Quantificazione dei incapsulato concentrazione DY-676-COOH
- Preparare una curva di calibrazione sciogliendo DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 nM) in tampone Tris 10 mM, pH 7,4 contenente 0,1% Triton X100.
- Sciogliere 2 microlitri (100 nmol finale lipidi del 50 mmol / L stock) dei liposomi per 5 minuti a temperatura ambiente in 100 microlitri tampone Tris contenente 1% Triton X100 per distruggere le vescicole e rilasciare il colorante incapsulato. Poi diluire campioni con tampone Tris 10 mM, pH 7,4 ad una concentrazione finale Triton-X100 del 0,1% (v / v) fare un volume totale di 1 ml. Preparare tutti i campioni in duplicato.
- Misurare l'assorbimento e l'emissione di tutti i campioni (gratuito DY-676-COOH e Triton-X100 trattati liposomi) ad una eccitazione λ = 645 nm e un'emissione λ = 700 nm. Stabilire e utilizzare una curva di taratura del colorante libero per determinare la concentrazione di colorante incapsulato.
- Caratterizzazione Liposome
- Determinare la dimensione e zeta potenziale di liposomi di dispersione della luce dinamica. Diluire i campioni liposomiali con filtro sterilizzato (0,2 micron) Tris 10 mM a pH 7,4 per aconcentration di 100-300 micron (lipidi). Trasferire i campioni diluiti in un volume basso cuvetta monouso e misurare il campione in base alle istruzioni del produttore.
- Caratterizzare i liposomi mediante microscopia elettronica a sostegno delle dimensioni, l'integrità e l'omogeneità delle vescicole liposomiali secondo protocolli standard.
2. Convalida della fluorescenza tempra e attivazione di liposomi preparati
- Analisi fisico-chimiche di fluorescenza tempra e l'attivazione
- Preparare due da 1,5 ml tubi per il Lip-Q e 2 tubi per la libera DY-676-COOH. Trasferire 100 nmol lipidi totali (2.38 microlitri di una / L Lip-Q soluzione stock 42 mmol, contenenti 138 mg / ml di incapsulato DY-676-COOH) nelle provette corrispondenti. Trasferimento libero DY-676-COOH equivalente al contenuto di colorante di Lip-Q (0.38 mg che risulta ad esempio da 138 mg / ml 1,000 x 2,38 microlitri Lip-Q utilizzato). Incubare una vascae di ogni sonda a 4 ° C e congelare il secondo tubo a -80 ° C per una notte (16 ore).
- Riscaldare un blocco riscaldante a 30 ° C. Riempire una scatola di raffreddamento con ghiaccio tritato e equilibrare una aliquota di 10 mM Tris pH 7,4 tampone a temperatura ambiente.
- Rimuovere le sonde da 4 ° C ed equilibrare a temperatura ambiente (avvolti in carta stagnola per proteggere dalla luce) e rapidamente scongelare sonde da -80 ° C a 30 ° C per 5 min. Raffreddare le sonde scongelati in ghiaccio per 1 minuto prima di trasferirli a temperatura ambiente (anche avvolti in carta stagnola per proteggere dalla luce).
- Aggiungere 10 mM tampone Tris (pH 7,4) per ciascuna delle sonde al volume finale di 100 microlitri ed equilibrare tutte le sonde a RT per 10 min.
- Pipettare 80 ml di ciascuna sonda in un bicchiere provetta basso volume e misurare l'assorbimento di ogni sonda 400-900 nm su uno spettrometro. Ritorna la sonda di loro tubi corrispondenti.
- Trasferire 80 ml di ciascuna sonda nella cuvetta bicchiere adattoe misurare l'emissione di fluorescenza su un spettrofluorimetro eccitando le sonde a 674 nm e misurando la fluorescenza 694-800 nm.
- Assorbimento cellulare e l'attivazione di fluorescenza
- Prendi e cultura le seguenti linee cellulari in loro terreni di coltura corrispondente in base alle condizioni standard (37 ° C, 5% di CO 2 e il 95% atmosfera umidificata). Qui, usare la linea cellulare murina J774A.1 macrofagi (Dulbecco modificati su terreno di Eagle integrato con 10% (v / v) di siero fetale di vitello), la linea cellulare glioblastoma umano, U-118mg (MEM contenente vitamine essenziali e 10% (v / v) di siero fetale di vitello) e la linea cellulare fibrosarcoma umano, HT-1080 (RPMI con FCS 5%).
- Cappotto 8-ben diapositive camera con poli-L-lisina (aggiungere 100 ml 0,001% poli-L-lisina in ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per 10 min. Soluzione Aspirare e lasciare che i vetrini camera ad asciugare per almeno 4 ore a RT su un banco di lavoro sterile. Sciacquare i vetrini camera 3volte con soluzione salina tamponata 200 microlitri di Hank poi sigillare con paraffina e un foglio di alluminio e conservare a 4 ° C fino al necessario.
- Mentre le diapositive da camera si stanno prosciugando, filtro sterilizzare i liposomi e soluzione colorante e conservare a 4 ° C fino al necessario.
- Per l'analisi della sonda assorbimento con tutto il corpo in vivo sistema di imaging di fluorescenza NIR, preparare 5 piccole fiasche di coltura per ciascuna delle linee cellulari 3 di prova (15 boccette in totale). Seed 2 x 10 6 J774A.1, U-118mg e cellule HT-1080 per pallone di coltura con 5 ml del rispettivo mezzo di coltura (in quintuplica) e crescere per 16-24 ore. Parallelamente alla cultura palloni, sementi 30.000 cellule di ciascuna linea cellulare (J774A.1 e HT-1080) o 20.000 celle (U-118mg) per 2 pozzi della slitta da camera rispettivamente e crescere in 500 microlitri terreno di coltura per 16-24 ore .
- Il giorno successivo, aggiungere 100 nmol (importo lipidi finale) di Lip-Q per 2 palloni per linea cellulare e ad un pozzo di ciascuna linea cellulare sul vetrino della camera.Immediatamente trasferire 1 pallone per linea cellulare a 4 ° C e il secondo pallone indietro al incubatore.
NOTA: Il volume delle sonde aggiunto nei flaconi e le diapositive camera sono gli stessi, rendendo la concentrazione su vetrini camera 10 volte superiore (5 ml è di 500 microlitri terreno di coltura). Questo è necessario perché la rilevazione microscopica è meno sensibile rispetto al sistema di imaging di fluorescenza NIR dove vengono esposte pellet cellulari dai fiaschi. - Aggiungere libera DY-676-COOH in concentrazione pari al contenuto di colorante di Lip-Q alle cellule in 2 palloni per linea cellulare e ad un pozzetto di ciascuna linea cellulare sul vetrino camera, poi trasferire immediatamente 1 pallone per linea cellulare a 4 ° C (svuotamento di energia) e l'altra beuta con la slitta camera posteriore al incubatore. Incubare tutte le cellule per 24 ore nelle condizioni corrispondenti. Le cellule nel pallone senza sonde servono come controllo non trattato.
- NIRF imaging e di analisi semi-quantitativa
- Dopo 24 ore la durata dell'incubazione, raccogliere le cellule in fiaschi lavando cellule 2 volte con Hanks tamponata soluzione salina (HBSS) poi raschiare le cellule in 500 microlitri HBSS e pellet per centrifugazione (5 min a 200 xg) in tubi microlitri 500.
- Posizionare i tubi con il pellet di cellule (e HBSS) in un imager NIRF e immagini utilizzando filtri di eccitazione (615-665 nm) e l'emissione (taglio> 700 nm).
- Sottrarre autofluorescenza e valutare l'intensità del target rispetto autofluorescenza secondo le istruzioni del produttore. Questo darà i livelli semi-quantitativi della intensità di fluorescenza come segnale medio (conteggi scalati / sec), che rappresenta i livelli di conteggio dopo la scalatura per tempo di esposizione, guadagno della telecamera, binning e profondità di bit, in modo che le misurazioni sono confrontabili tra loro.
- Analisi microscopica confocale
- Dopo 24 ore di incubazione, raccogliere le cellule su vetrini da camera lavando 2 volte con 500 microlitri HBSS.
- Fissare il cells con 200 microlitri HBSS contenente 3,7% (v / v) di formaldeide per 30 minuti a RT.
- Mentre è in corso di fissazione, diluire la macchia DNA, Hoechst-33258 1:50 con soluzione di montaggio.
- Dopo la fissazione, lavare le cellule due volte con HBSS quindi separare le camere dai vetrini. Aggiungere soluzione di montaggio 50 ml contenente il DNA-macchia su ogni posto corrispondente ai pozzi delle diapositive da camera. Coprire le cellule con vetrino, sigillare i bordi con smalto trasparente e asciugare per 10 minuti a RT (scuro).
- Celle di immagine su un microscopio a fluorescenza adatto o microscopio confocale. Utilizzare le seguenti impostazioni di eccitazione e di emissione per la visualizzazione dei componenti corrispondenti: nuclei (Hoechst-33258: eccitazione 405 nm, emissione 420-480 nm). NBD-DOPE (liposomiale lipidico: eccitazione 488 nm, emissione 530 nm). DY-676-COOH (colorante fluorescente NIR: eccitazione 633-645 nm, emissione 650-700 nm).
NOTA: Assicurarsi che la fluorescenza del microscopio available è dotato di filtri idonei che consentono di eccitazione ed emissione di lunghezze d'onda superiore a 630 nm.
3. liposomi a base di In Vivo imaging di fluorescenza di infiammazione
- Preparazione degli animali e materiali
- Casa 8-12 week-old topi NMRI maschi di peso di circa 36 g in condizioni standard con cibo e acqua ad libitum.
- Sette giorni prima dell'inizio della sperimentazione, invia tutti i topi una dieta povera pheophorbide per ridurre autofluorescenza tessuti.
- Ventiquattro ore prima dell'inizio di ogni esperimento, radere topi nella zona desiderata (ad esempio, l'intera area del lotto se si desidera l'imaging di edema hind gamba).
- Pesare gli animali e calcolare la quantità di sonde da iniettare per mouse (Lip-Q e Lip-DQ a 10 micromol (concentrazione di lipidi) per kg di peso e senza DY-676-COOH (equivalente a tingere contenuto di Lip-Q utilizzata) .
- Immagine gli animali inun corpo intero NIR Fluorescenza imager con le stesse impostazioni utilizzate per i pellet cellulari. Questa misurazione fornisce autofluorescenza degli animali.
- Disciogliere 10 mg zymosan-A in 1 ml di soluzione salina isotonica e memorizzare una notte a 4 ° C.
- Induzione di infiammazione e in vivo NIRF immagini
- Preparare 3 siringhe per topo contenenti le seguenti soluzioni. Riempire una siringa con 50 microlitri zymosan-Una soluzione (10 mg / ml) e la seconda siringa con 50 microlitri di soluzione salina isotonica. Riempire la terza siringa con le sonde, per cui Lip-Q e Lip-DQ (10 mmol / kg di peso (lipidi)) sono designati per gli animali di prova e la connessione DY-676-COOH (concentrazione in Lip-Q) per gli animali di controllo. Assicurarsi che le sonde sono diluiti con sterili HBSS a 150 microlitri volume finale.
- Applicare la crema occhio gli occhi degli animali per evitare secchezza e anestetizzare gli animali con il 2% isoflurano fino a quando non sono profondamente addormentati e non reagiscono al tocco sulle zampe (questo richiede circa 2 minuti).
- Posizionare il mouse su una stuoia calda (ancora sotto anestesia) e iniettare il zymosan-A sottocutanea soluzione sul zampa posteriore destra e la soluzione salina sulla zampa posteriore sinistra. Iniettare immediatamente la sonda per via endovenosa e l'immagine dell'animale, successivamente poi tempo record di iniezione / misura (come t = 0 ore). Salvare le immagini risultanti come cubetti di immagine e ripetere i passi precedenti per tutti gli altri animali e le rispettive sonde.
- Fotografia gli animali ogni 2 hr per 10 ore dopo l'iniezione e poi a 24 ore dopo l'iniezione, facendo in modo che la fase della camera di misura è caldo (per esempio, posizionando una stuoia calda sotto), al fine di evitare l'ipotermia. Dopo ogni misura, mettere gli animali in una gabbia con cibo e acqua ad libitum e posizionare la gabbia in una camera di animali temperato. Eutanasia gli animali di primo anestetizzante con il 2% isoflurano fino gli animali reagiscono più a toccare, poi eutanasia con anidride carbonica per 5-10 minuti, rendendoAssicurarsi che gli animali smettono di respirare completamente e si verifica rigor mortis.
- Staccare i topi secondo protocolli standard che possono essere valutati online (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) e l'immagine gli organi.
- Valutare i risultati delle misure secondo le istruzioni del produttore per la prima sottraendo la fluorescenza complessiva degli animali (unmixing) poi regioni assegnazione di interesse per autofluorescenza (sinistra zampa posteriore con soluzione salina) e l'obiettivo di fluorescenza di zona infiammata (destra zampa posteriore con zymosan-A).
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Risultati
L'incapsulamento di alte concentrazioni di coloranti fluorescenti come la NIRF dye DY676-COOH qui utilizzato all'interno acquosa di liposomi porta ad un elevato livello di estinzione della fluorescenza. Fluorescenza tempra, un fenomeno visto con molti fluorofori ad alta concentrazione, può essere sfruttata in diversi in applicazioni di imaging in vivo in cui una elevata sensibilità e rilevamento affidabile dell'area di destinazione sono richiesti. L'uso di liposomi fornisce anche una protezione del col...
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Discussione
Dal liposomi possono anche servire come sistemi di consegna per tinture fluorescenti, che permettono l'imaging di malattie in questione. L'incapsulamento di alte concentrazioni di coloranti fluorescenti come il colorante NIRF, DY676-COOH usato qui, porta ad un elevato livello di estinzione della fluorescenza del colorante intrappolato. Fluorescenza tempra, un fenomeno visto con molti fluorofori ad alta concentrazione può essere sfruttata in diversi in applicazioni di imaging in vivo, dove è ric...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni Deutsche Forschungsgemeinschaft HI-698 / 10-1 e RU-1652 / 1-1. Ringraziamo Doreen maggio per l'eccellente assistenza tecnica e la società DYOMICS GmbH, Jena per il loro supporto gentile.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiali e attrezzature per la preparazione di liposomi | |||
| uovo fosfatidilcolina | Avanti Polar Lipids | 840051P | Sciogliere in cloroformio e conservare in fiale di vetro (214 mg/ml) |
| colesterolo | Sigma | C8667 | Sciogliere in cloroformio e conservare in fiale di vetro (134 mg/ml) |
| 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilenglicole)-2000] (sale di ammonio) | Avanti Polar Lipids | 880120P | Sciogliere in cloroformio e conservare in fiale di vetro (122 mg/ml) |
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-(7-nitro-2-1, 3-benzossadiazol-4-il) (sale di ammonio) | Avanti Polar Lipids | 810145P | Sciogliere in cloroformio e conservare in fiale di vetro (2 mg/ml) |
| Sartorius MC1 (d = 0,01 mg) | Sartorius AG | Research RC 210 P | utilizzato per pesare i fosfolipidi |
| Rotavapor | Bü chi Labortechnik AG | R-114 | utilizzato per l'idratazione del film fosfolipidico |
| Bagnomaria | Bü chi Labortechnik AG | R-481 | utilizzato per l'idratazione del film fosfolipidico |
| Vacuum Controller | Bü chi Labortechnik AG | B-720 | utilizzato per l'idratazione del film fosfolipidico |
| Vacobox | Bü chi Labortechnik AG | B-177 | utilizzato per l'idratazione del film fosfolipidico |
| Refrigeratore di circolazione | LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG | WKL 230 | utilizzato per l'idratazione del film fosfolipidico |
| DY-676-COOH | Dyomics GmbH | 676-00 | Sciogliere in 10 mM Tris e conservare le scorte a -20° C |
| Tris-(Idrossimetil)-aminometano | Applichem | A1086 | tampone 10 mM, pH 7,4 |
| Triclormetano | Carl Roth GmbH + Co. KG | Y015.2 | utilizzato per la preparazione dei liposomi |
| Sonicatore | Merck Eurolab GmbH | USR 170 H | utilizzato per la preparazione dei liposomi |
| Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, n. 146-3011-00) | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | utilizzato per la preparazione dei liposomi |
| Sephadex G25 medium | GE Healthcare Europe GmbH | 17-0033-01 | utilizzato per la purificazione dei liposomi |
| Triton X100 | Ferak Berlin GmbH | 505002 | utilizzato per distruggere i liposomi per la quantificazione del colorante |
| LiposoFast-Basic | Avestin Inc. | utilizzato per l'estrusione di liposomi Membrana | |
| filtrante in policarbonato, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U) | VWR | utilizzato per l'estrusione di liposomi tramite LiposoFast-Basic | |
| Fluostar Optima | BMG Labtech | utilizzato per la quantificazione del colorante | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | utilizzato per la determinazione delle dimensioni dei liposomi e dello zetapotenziale | |
| Ultracentrifuga | Beckmann Coulter GmbH | XL 80 | utilizzato per la concentrazione dei campioni |
| Rotor | Beckmann Coulter GmbH | SW 55 TI | utilizzato per la concentrazione dei campioni |
| Materiali e attrezzature per la valutazione dei liposomi e l'imaging ottico | |||
| Zymosan-A da Saccharomyces cereviciae | Sigma | Z4250-250MG | utilizzato per l'induzione dell'infiammazione |
| Soluzione salina isotonica (0,9%) | Fresenius GmbH | PZN-2159621 | utilizzato per la diluizione del vaporizzatore Zymosan-A |
| Isoflurane | Ohmeda Isotec 4 | utilizzato per l'anestetizzazione degli animali | |
| Isoflurane | Actavis GmbH | PZN-7253744 | anestesia |
| Thermo Mat Pro 20 W | Lucky Reptile | 61202-HTP-20 | utilizzato per mantenere gli animali al caldo durante l'anestesia |
| Omnican-F (1 ml di iniezione) | Braun | PZN-3115465 | utilizzato per l'applicazione sottocutanea ed endovenosa di sonde |
| Pantenolo crema per gli occhi | Jenapharm | PZN-3524531 | utilizzata per prevenire la secchezza degli occhi degli animali durante l'anestesia |
| Hanks soluzione salina tamponata | PAA Laboratories /Biochrom AG | L2045 | senza Mg2+, Ca2+ e rosso fenolo. Per la diluizione delle sonde e per il lavaggio delle cellule |
| I vetrini da camera a 8 pozzetti | BD Biosciences | 354108 | utilizzati per la coltura cellulare seguita da microscopia. |
| Fiasche per colture cellulari | Greiner BioOne | ||
| Terreni per colture cellulari | Gibco (life technologies GmbH) | ||
| Siero fetale di vitello | Invitrogen | ||
| Soluzione di poli-L-lisina (0,01%, 50 ml) | Sigma | P4832 | utilizzato per rivestire i vetrini della camera di coltura cellulare |
| Mountant Permafluor | ThermoScientific | S21022-3 | Soluzione di montaggio per microscopia |
| Hoechst-33258 | AppliChem | Colorazione DNA per microscopia | |
| Hera-Safe | Heraeus Instruments | banco di lavoro sterile utilizzato per la coltura cellulare | |
| Incubatore | Heraeus Instruments | utilizzato per la coltura cellulare | |
| LSM510-Meta | Zeiss | utilizzato per la microscopia | |
| confocaleMaestro-TM in vivo fluorescence imaging | CRi, Woburn | utilizzato per l'imaging a fluorescenza di tutto il corpo di piccoli animali | |
| Spettrofotometro (Ultrospec 4300 pro UV) | GE Healthcare | utilizzato per la misurazione dell'assorbimento | |
| Spettrofluorimetro (Jasco FP-6200) | Jasco | utilizzato per la misurazione dell'emissione | |
| Animals | |||
| Topi NMRI (8-12 settimane, maschio) | Elevage Janvier, Francia | utilizzato per studi sull'infiammazione | |
Riferimenti
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