Il pacchetto software basato su MATLAB open source, plusTipTracker, può essere utilizzato per analizzare serie di immagini di + TIP fluorescenza marcata per quantificare la dinamica dei microtubuli.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Utilizzo plusTipTracker software per misurare Microtubulo Dynamics in Xenopus laevis coni di crescita
In questo articolo
Sommario
Abstract
Microtubuli (MT) più-end-tracking proteine (+ TIP) localizzano alle crescenti più-estremità di MTS e regolano le dinamiche MT 1,2. Uno dei suggerimenti più noti e ampiamente utilizzati + per l'analisi dinamica MT è l'End-binding protein, EB1, che lega tutte le crescenti MT plus-end, e, quindi, è un marker per MT polimerizzazione 1. Molti studi del comportamento EB1 entro coni di crescita hanno utilizzato in termini di tempo e di parte assistita da computer, i metodi a mano-tracking per analizzare singoli MT 1-3. Il nostro approccio è quello di quantificare i parametri globali della dinamica MT utilizzando il pacchetto software, plusTipTracker 4, a seguito dell'acquisizione di alta risoluzione, immagini in diretta di EB1 taggato in coltura coni di crescita embrionali 5. Questo software è un basato su MATLAB, open-source, pacchetto user-friendly che combina il rilevamento automatico, il monitoraggio, la visualizzazione e l'analisi per i film di fluorescenza marcata + TIP. Qui, vi presentiamo il protocollo per l'utilizzo di plusTipTRacker per l'analisi delle comete fluorescenza marcata + TIP in colture di Xenopus laevis coni di crescita. Tuttavia, questo software può anche essere utilizzato per caratterizzare la dinamica MT in vari tipi di cellule 6-8.
Introduzione
L'obiettivo di questo metodo è quello di ottenere informazioni quantitative in materia di microtubuli (MT) più--end inseguimento dinamica a vivere coni di crescita di proteine (+ TIP). MT + TIP sono un gruppo di proteine che localizzano ai più-end di MTS 9,10. Essi svolgono una serie di funzioni per regolare i parametri di instabilità dinamica MT 11, compresi i tassi di polimerizzazione, catastrofe, e soccorso. Un metodo ben utilizzato per analizzare le dinamiche MT è quello di monitorare il comportamento del EB1 TIP +, che si lega specificamente alla crescente MT plus-conclude 1,12. EB1 è conosciuto per reclutare diverse altr....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Questo protocollo e il video hanno lo scopo di servire come un compagno per la carta originale che descrive il pacchetto software in modo più dettagliato 4, così come la relazione tecnica che accompagna il download del software sul sito web di Danuser Lab. I lettori sono invitati a rivedere questi documenti con attenzione se ci sono domande supplementari per quanto riguarda l'utilizzo del software.
1 Prima di Image Analysis
- Convertire ogni filmato time-lapse in una sequenza di TIFF (Tagged Image File Format) file di immagine. Se ci sono più coni di crescita / cellule in un determinato film, primo raccolto ogni co....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Usando questo software, come descritto qui fornirà diversi file di informazioni che quantificano + dinamiche TIP nelle cellule viventi.
I plusTipGetTracks funzione identifica le tracce (con esempio impostazioni mostrate nella figura 1), e quindi fornisce parametri relativi alle tracce TIP +. Per visualizzare le informazioni che il software ha ottenuto, andare nella directory roi_X creata nel passaggio 2.2. La cartella "impresa" contiene "overlayImages", che è una serie di im.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
PlusTipTracker fornisce una semplice interfaccia grafica per rilevare rapidamente e automaticamente quasi tutti visibili comete EB1-GFP in un cono di cellulare o di crescita, collegare le comete in tracce, e calcolare i parametri MT. Altre pubblicazioni hanno riportato la progettazione di simili tipi di software (per esempio, Marx et al. Analisi quantitativa anche utilizzato delle dinamiche EB1 taggati in coni di crescita 18). Ma, questo software sembra essere unico nella sua facilità di accesso, in .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Gaudenz Danuser e i membri del suo laboratorio per aver creato il software plusTipTracker e per l'utile discussione riguardante l'utilizzo del software, in particolare Maria Bagonis e Sebastien Besson. Ringraziamo in particolare il Boston College Media Center per l'assistenza e il supporto nella creazione e nel montaggio del video. Ringraziamo anche i membri del Lowery Lab per le utili discussioni e le critiche costruttive, e Abigail Antoine per la correzione delle bozze del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da un premio NIH R00 MH095768 a LAL.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| software plusTipTracker | Danuser Lab | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | Questo software potrebbe essere ospitato da un altro sito web in futuro. Se il sito elencato non esiste, cerca "Danuser Lab Software" su un motore di ricerca web per trovare il sito. |
| Software MATLAB | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ |
Riferimenti
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).
- Lee, H., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
