Articolo metodologico

Utilizzo plusTipTracker software per misurare Microtubulo Dynamics in Xenopus laevis coni di crescita

DOI:

10.3791/52138

⸱

7 settembre 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Boston College

In questo articolo

Sommario

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Il pacchetto software basato su MATLAB open source, plusTipTracker, può essere utilizzato per analizzare serie di immagini di + TIP fluorescenza marcata per quantificare la dinamica dei microtubuli.

Abstract

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Microtubuli (MT) più-end-tracking proteine ​​(+ TIP) localizzano alle crescenti più-estremità di MTS e regolano le dinamiche MT 1,2. Uno dei suggerimenti più noti e ampiamente utilizzati + per l'analisi dinamica MT è l'End-binding protein, EB1, che lega tutte le crescenti MT plus-end, e, quindi, è un marker per MT polimerizzazione 1. Molti studi del comportamento EB1 entro coni di crescita hanno utilizzato in termini di tempo e di parte assistita da computer, i metodi a mano-tracking per analizzare singoli MT 1-3. Il nostro approccio è quello di quantificare i parametri globali della dinamica MT utilizzando il pacchetto software, plusTipTracker 4, a seguito dell'acquisizione di alta risoluzione, immagini in diretta di EB1 taggato in coltura coni di crescita embrionali 5. Questo software è un basato su MATLAB, open-source, pacchetto user-friendly che combina il rilevamento automatico, il monitoraggio, la visualizzazione e l'analisi per i film di fluorescenza marcata + TIP. Qui, vi presentiamo il protocollo per l'utilizzo di plusTipTRacker per l'analisi delle comete fluorescenza marcata + TIP in colture di Xenopus laevis coni di crescita. Tuttavia, questo software può anche essere utilizzato per caratterizzare la dinamica MT in vari tipi di cellule 6-8.

Introduzione

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L'obiettivo di questo metodo è quello di ottenere informazioni quantitative in materia di microtubuli (MT) più--end inseguimento dinamica a vivere coni di crescita di proteine ​​(+ TIP). MT + TIP sono un gruppo di proteine ​​che localizzano ai più-end di MTS 9,10. Essi svolgono una serie di funzioni per regolare i parametri di instabilità dinamica MT 11, compresi i tassi di polimerizzazione, catastrofe, e soccorso. Un metodo ben utilizzato per analizzare le dinamiche MT è quello di monitorare il comportamento del EB1 TIP +, che si lega specificamente alla crescente MT plus-conclude 1,12. EB1 è conosciuto per reclutare diverse altre proteine ​​per crescere MT plus-conclude 13,14, ed è stato recentemente istituito come un fattore di maturazione MT 15, MT promuovere sia la crescita e la frequenza catastrofe 15,16.

Molti studi di dinamica MT all'interno di coni di crescita hanno utilizzato metodi di mano-tracking per misurare i cambiamenti nelle dinamiche EB1-GFP nel tempo 1-3, come EB1 localizatia MT, più-end possono essere usati come marker per MT polimerizzazione. Uno dei principali vantaggi per l'esame comete EB1-GFP come proxy per la crescita MT è che la dinamica MT possono essere misurati anche nelle regioni di sovrapposizione significativa MT. Mentre il metodo di tracciamento a mano comete EB1-GFP ha fornito indicazioni utili in MT comportamenti 1-3, è che richiede tempo e può essere prevenuto. Inoltre, come la crescita aberrante comportamenti cono sono probabilmente il risultato di cambiamenti minute dinamica del citoscheletro, analizzando solo un piccolo sottoinsieme di MTS (di solito necessario quando la mano-tracking) possono perdere informazioni significative.

Così, misuriamo globali parametri delle dinamiche MT utilizzando il pacchetto software, plusTipTracker 4, dopo l'acquisizione ad alta risoluzione, immagini in diretta di EB1 taggato in coltura coni di crescita embrionali 5. Questo software, sviluppato in Danuser Lab, è stata utilizzata in diversi studi che caratterizzano dinamiche MT in vari tipi di cellule 6-8. Si tratta di un open-source, cier-amichevole, pacchetto basato su MATLAB, che comprende il rilevamento automatico, il monitoraggio, la visualizzazione e l'analisi per i film di fluorescenza marcata + TIP. Una lunga lista di parametri specifici della dinamica MT sono calcolati da questo software (vedi riferimento 4 per i dettagli), ma per l'analisi delle dinamiche MT in coni di crescita, i parametri più utili sono la velocità pista crescita MT (in micron / minuto), traccia la crescita durata (in secondi), e la lunghezza della traccia crescita (in micron). Il software può essere scaricato direttamente dal sito web Danuser Lab (sotto "Software"). Mentre il Danuser Lab supporta attualmente una nuova interfaccia per il monitoraggio TIP + analisi, che è integrata in un pacchetto software chiamato u-track 2.0, l'originale, software stand-alone rimarrà disponibile. Gli algoritmi sottostanti tra i due programmi sono uguali (almeno dal 2014), con solo una differenza di uscite dell'interfaccia e di analisi. Per l'utente inesperto con poco MATLAB e / o l'analisi computazionale esperimentiza, plusTipTracker ha più caratteristiche user-friendly, tra cui le uscite dei parametri statistici automatizzati.

Qui, descriviamo la procedura per l'analisi di immagini dinamiche EB1-GFP in coltura Xenopus laevis coni di crescita. Questo protocollo è stato utilizzato in un recente documento esamina le dinamiche MT 17. Per istruzioni dettagliate relative coni di crescita coltura esprimono EB1-GFP Vedi anche Lowery et al. 2012 5. Anche se questo documento è concentrata principalmente sull'esame dinamiche EB1-GFP in coni di crescita, lo stesso protocollo può essere utilizzato per altri tipi di cellule 17. Per tutti i tipi di cellule, l'intervallo di tempo tra i fotogrammi deve essere compresa tra 0,5-2 sec per il monitoraggio ottimale + TIP. Un intervallo di tempo di fino a 4 secondi tra i frame è possibile, ma questo aumento risultati in tempo intervallo di tracking error supplementari.

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Protocollo

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Questo protocollo e il video hanno lo scopo di servire come un compagno per la carta originale che descrive il pacchetto software in modo più dettagliato 4, così come la relazione tecnica che accompagna il download del software sul sito web di Danuser Lab. I lettori sono invitati a rivedere questi documenti con attenzione se ci sono domande supplementari per quanto riguarda l'utilizzo del software.

1 Prima di Image Analysis

  1. Convertire ogni filmato time-lapse in una sequenza di TIFF (Tagged Image File Format) file di immagine. Se ci sono più coni di crescita / cellule in un determinato film, primo raccolto ogni cono di crescita / cellulare per creare la propria sequenza di immagini.
    Nota: Questo non è necessario, in quanto possono essere selezionati singole regioni-di-interesse (ROI) entro plusTipTracker. Tuttavia, utilizzando dimensioni immagine inferiori aumenta la velocità del trattamento computazionale, quindi questo passaggio è consigliata in caso di notevole spazio vuoto nell'immagine.
  2. Salva ogni serie TIFF nel propriocartella chiamata "images" all'interno di un percorso che MATLAB è impostato su Accesso (notare che "le immagini" è case-sensitive). Per aggiungere un nuovo percorso, passare alla directory del file corrispondente nella finestra "Current Folder", fare clic destro sull'icona della cartella e selezionare "Aggiungi a Path - Cartelle selezionate e sottocartelle". E 'importante che la cartella del software plusTipTracker essere aggiunta al Sentiero, pure.

2. plusTipGetTracks

Nota: Il primo passo per l'analisi delle immagini è quello di individuare le comete EB1-GFP, collegare le comete in tracce, e determinare i parametri della dinamica dei microtubuli. Questo si ottiene con il comando "plusTipGetTracks" 4.

  1. Per iniziare l'analisi, applicazioni MATLAB aperto e digitare "plusTipGetTracks" nella finestra di comando. Ciò causerà una nuova finestra di dialogo deve.
  2. Clicca su "Imposta nuovi progetti" e selezionare uno (o more), della precedente serie di immagini TIFF selezionando il "immagini" appropriate cartella (o directory contenenti "immagini" cartelle). Al termine di questa fase, una directory di file (roi_1) verrà creato (nella stessa cartella che contiene "immagini") che conterrà i file di dati futuri. Nota: la fase di "creare nuovi progetti" può essere completato prima del tempo, nel corso di una sessione separata.
  3. Una nuova finestra apparirà: "Seleziona un poligono, fare clic destro su quest'ultimo punto, e fare clic su 'Create Mask'". Fare clic su "OK". Verrà visualizzata la prima immagine della serie dell'immagine selezionata. Usa il mouse per fare clic e creare un poligono che racchiude la totalità del cono di crescita. Fare doppio clic con il mouse per chiudere il poligono.
  4. Una volta che il poligono è stato chiuso, una finestra di dialogo apparirà: "Vuoi selezionare un altro ROI?" Se l'immagine ha un altro cono di crescita per analizzare, selezionare "Sì"; altrimenti seletti "No".
  5. Selezionare i progetti che verranno immediatamente analizzati. Clicca su "Seleziona Projects" e selezionare la cartella (roi_X) analizzare.
  6. Viene visualizzata una schermata listSelectGUI. Selezionare il progetto (s) dal lato sinistro dello schermo e spostarli sul lato destro dello schermo. Fare clic su "OK". Scegliere un percorso per salvare l'elenco di progetti e fare clic su "Salva".
  7. Selezionare "Detection", "monitoraggio", e "Post-Processing". Una volta effettuate queste selezioni, il lato destro della finestra di dialogo sarà configurabile. Configurare ogni opzione.
    1. Questi parametri vengono utilizzati per collegare le comete rilevati in tracce MT. Dettagli per la scelta di questi parametri di controllo per il monitoraggio sono inclusi nelle pagine 9-10 della relazione tecnica in formato PDF che accompagna il pacchetto di download del software; leggere questo rapporto con attenzione se si verificano problemi. Ai fini del monitoraggio comete EB1-GFP in Xenopci laevis coni di crescita, utilizzare le seguenti impostazioni di rilevamento: Cerca Raggio Gamma (5-12 pixel), lunghezza minima Sub-Track (frame) 3; Max Gap Lunghezza (fotogrammi) 8; Max Factor Ritiro 0.8, angolo di andata massima 50, angolo di Max indietro 10, Fluctuation Radius 2.5. Queste impostazioni sono mostrate nella Figura 1.

    Nota: Max Factor Il restringimento è impostato per ridurre il numero di "lacune arretrate" rilevati, come "lacune arretrati" non sono utili per analizzare nel contesto di coni di crescita, date le condizioni di sovraffollamento e le probabili errori nei collegamenti della pista. Inoltre, sia l'angolo di andata massima ed anche cambiamenti Radius sono impostati relativamente alta, come MTS cono di crescita presentano piccoli traslocazioni frequenti oltre alle crescite e ritiri, e aumentando le impostazioni di controllo permette di questa maggiore movimento durante la fase di collegamento.
    1. Compilare i post-elaborazione delle impostazioni a seconda delle impostazioni di acquisizione di immagini specifiche desiderate.
  8. Una volta configurate le impostazioni, fare clic su "Start". Il software verrà eseguito a seconda delle impostazioni sono stati selezionati. Questo può richiedere minuti o ore, a seconda del numero di progetti selezionati e le loro dimensioni. La Finestra di comando visualizza il tempo residuo stimato per ogni funzione. Quando il passo plusTipGetTracks è completata, la finestra di comando visualizzerà "Finito!"
    Nota: Una lunga lista di parametri specifici della dinamica MT sono ora calcolato da questo software (vedi riferimento 4 per i dettagli), ma per l'analisi delle dinamiche di MT in coni di crescita, i parametri più utili per esaminare sono la velocità pista crescita MT (in micron / minuto), durata percorso di crescita (in secondi), e la lunghezza della traccia crescita (in micron).

3. plusTipSeeTracks

Nota: Ora che le tracce microtubuli sono state definite, la funzione "plustipSeeTracks" viene utilizzato per la visualizzazione traccia 4. Questa funzionein grado di fornire le uscite multiple per la visualizzazione, tra cui dinamica MT spaziali mappe e filmati di velocità, ma qui, l'attenzione è rivolta esclusivamente sull'utilizzo di "Movies Track" per visualizzare i brani MT sovrapposte le immagini cono di crescita. Mentre plusTipGetTracks possono analizzare più filmati alla volta, plusTipSeeTracks possono analizzare solo un film alla volta.

  1. Digitare "plusTipSeeTracks" nella finestra di comando.
  2. Dopo il caricamento della finestra di dialogo, cliccare su "Select Progetto". Selezionare la directory principale che contiene il progetto per visualizzare e clicca su "Seleziona cartella". Una nuova finestra apparirà: "Selezionare il progetto che si desidera visualizzare". Scegliere il file da visualizzare e fare clic su "OK".
  3. Avanti, fare clic su "Select Saved ROI". Passare alla stessa cartella roi_X come quello selezionato nel passo precedente e selezionare il file denominato "roiYX".
  4. Clicca su "Seleziona directory di output" per designare wqui MATLAB salverà i file di visualizzazione delle tracce. Nota: si consiglia di utilizzare la stessa cartella che contiene il resto dei dati.
  5. Selezionare "Crea Traccia di un film" e apparirà una schermata che visualizza tutte le tracce plusTipGetTracks calcolati dalle comete TIP +. Questo passaggio consente di risparmiare la serie storica rintracciato in un formato video, nel file "allTracks_X_X_X". C'è un'opzione per salvare il filmato come AVI, altrimenti il ​​formato predefinito è come un file Quicktime.mov.

4. plusTipGroupAnalysis

Nota: Questa funzione finale è utilizzata per creare gruppi di film per l'analisi e il confronto dei parametri di traccia MT.

  1. Digitare "plusTipGroupAnalysis" nella finestra di comando. Per selezionare manualmente i gruppi per confrontare, prima de-selezionare "gruppo di Auto da gerarchia". Quindi, fare clic su "Seleziona progetti". Passare alla directory superiori che contengono tutte le cartelle roi_Xanalizzare.
  2. Viene visualizzata una schermata listSelectGUI. Selezionare tutti i progetti da includere nei gruppi dal lato sinistro dello schermo e spostarli sul lato destro dello schermo. Fare clic su "OK". Scegliere un percorso per salvare l'elenco di progetti e fare clic su "Salva".
  3. Apparirà una finestra: "Si prega di selezionare primo gruppo dall'elenco". Fare clic su "OK". La finestra listSelectGUI mostrerà di nuovo. Questa volta, selezionare solo i file che corrispondono al primo gruppo che dovrebbe essere raggruppate. Fare clic su "OK".
  4. Quindi, immettere il nome del gruppo e fare clic su "OK". Apparirà una finestra: "Selezionare un altro gruppo?" Risposta di conseguenza e continuare a selezionare gruppi. Apparirà una finestra: "Selezionare una posizione per salvare la lista del gruppo". Passare alla posizione e fare clic su "Salva".
  5. Clicca su "Select Output Directory" per scegliere dove le cartelle di output sarannomemorizzato.
  6. Selezionare il tipo di analisi di gruppo per condurre - se le tracce MT devono essere raggruppati per ciascun gruppo o per l'analisi delle cellule dovrebbe essere eseguita. I test statistici raccomandati sono già designati. Per includere tutti i brani nell'analisi, de-selezionare "Rimuovi le tracce a inizio / fine del film". In caso contrario, avendo questa casella selezionata rimuove eventuali tracce di crescita MT che sono in corso come il film inizia o termina.
  7. Una volta effettuata la selezione Analysis Group, selezionare "Confronta i gruppi".

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Risultati

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Usando questo software, come descritto qui fornirà diversi file di informazioni che quantificano + dinamiche TIP nelle cellule viventi.

I plusTipGetTracks funzione identifica le tracce (con esempio impostazioni mostrate nella figura 1), e quindi fornisce parametri relativi alle tracce TIP +. Per visualizzare le informazioni che il software ha ottenuto, andare nella directory roi_X creata nel passaggio 2.2. La cartella "impresa" contiene "overlayImages", che è una serie di im...

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Discussione

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PlusTipTracker fornisce una semplice interfaccia grafica per rilevare rapidamente e automaticamente quasi tutti visibili comete EB1-GFP in un cono di cellulare o di crescita, collegare le comete in tracce, e calcolare i parametri MT. Altre pubblicazioni hanno riportato la progettazione di simili tipi di software (per esempio, Marx et al. Analisi quantitativa anche utilizzato delle dinamiche EB1 taggati in coni di crescita 18). Ma, questo software sembra essere unico nella sua facilità di accesso, in ...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il Dr. Gaudenz Danuser e i membri del suo laboratorio per aver creato il software plusTipTracker e per l'utile discussione riguardante l'utilizzo del software, in particolare Maria Bagonis e Sebastien Besson. Ringraziamo in particolare il Boston College Media Center per l'assistenza e il supporto nella creazione e nel montaggio del video. Ringraziamo anche i membri del Lowery Lab per le utili discussioni e le critiche costruttive, e Abigail Antoine per la correzione delle bozze del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da un premio NIH R00 MH095768 a LAL.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
software plusTipTrackerDanuser Labhttp://lccb.hms.harvard.edu/software.htmlQuesto software potrebbe essere ospitato da un altro sito web in futuro. Se il sito elencato non esiste, cerca "Danuser Lab Software" su un motore di ricerca web per trovare il sito.
Software MATLABMathworkshttp://www.mathworks.com/products/matlab/

Riferimenti

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