Mouse trapianto renale: Modelli di Allograft Rifiuto

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per studiare l'immunologia del rigetto. Il modello chirurgico presentato riporta un breve tempo operatorio e una tecnica concisa. A seconda della combinazione di ceppo donatore-ricevente, il rene trapiantato può sviluppare rigetto cellulare acuto o danno cronico da allotrapianto, definito da fibrosi interstiziale e atrofia tubulare.

Abstract

Il rigetto del rene trapiantato nell'uomo è ancora una delle principali cause di morbilità e mortalità. Il modello murino di trapianto renale replica fedelmente sia i processi tecnici che patologici che si verificano nel trapianto renale umano. Sebbene esistano modelli murini di rigetto allogenico in organi diversi dal rene e siano tecnicamente più fattibili, ci sono prove che organi diversi suscitano modalità e dinamiche di rigetto disparate, ad esempio il decorso temporale del rigetto nell'allotrapianto cardiaco e renale differisce significativamente in alcune combinazioni di ceppi. Questo modello è uno strumento interessante per molte ragioni, nonostante le sue sfide tecniche. Poiché gli aplotipi del ceppo di topo consanguineo sono ben caratterizzati, è possibile scegliere combinazioni di donatore e ricevente per modellare il rigetto acuto dell'allotrapianto mediante trapianto in loci MHC di classe I e II. Al contrario, con il trapianto tra ceppi con aplotipi simili, può essere indotto un processo cronico in cui il rene allotrapianto sviluppa fibrosi interstiziale e atrofia tubulare. Abbiamo modificato la tecnica chirurgica per ridurre i tempi operatori e migliorare la facilità dell'intervento, tuttavia è ancora necessario superare una curva di apprendimento per replicare fedelmente il modello. Questo studio fornirà i punti chiave della procedura chirurgica e aiuterà il processo di creazione di questa tecnica.

Introduzione

Trapianto renale con successo per il trattamento di insufficienza renale è stata descritta per la prima nel 1955 tra gemelli monozigoti ^1, da allora è diventato un rivoluzionario trattamento per i pazienti con insufficienza renale allo stadio terminale in tutto il mondo, che offre sia un miglioramento nella durata e la qualità della vita ^2. Tuttavia la sopravvivenza del trapianto a lungo termine è stata ostacolata da una moltitudine di processi patologici con conseguente danno cronica del trapianto ^3.

Rifiuto del rene trapiantato negli esseri umani rimane una delle principali cause di morbilità, nonostante i significativi miglioramenti nei regimi immunosupporessive. L'obiettivo di sviluppare un modello murino di trapianto renale è replicare da vicino il processo e la patologia trovato nel trapianto renale umano ^4. Skoskiewicz et al. Prima descritto il modello murino di trapianto di rene nel 1973 ^5. Anche se sono richieste competenze avanzate microchirurgiche, è una preziosa tool per diversi motivi: il genoma del topo è stato ben caratterizzato e c'è una grande varietà di metodi e tecniche disponibili per studi sui topi sperimentali.

Molti gruppi che utilizzano il modello murino di trapianto renale hanno usato il rene trapiantato come un organo di supporto vitale, ma in altri studi e nella nostra metodologia descritta uno dei reni nativi del topo destinatario viene lasciato in situ per tutta la durata dell'esperimento ^4. Il vantaggio è che il mouse subisce una sola anestesia e il funzionamento riducendo la morbilità per il mouse e il rischio di morte per una seconda procedura. Inoltre, il mouse non soffre gli effetti negativi di insufficienza renale progressiva.

Sebbene esistano modelli di rigetto allogenico in altri organi come il cuore e la pelle, queste non sono sempre direttamente rilevanti per il trapianto renale. Ci sono prove che questi modelli suscitano diverse modalità e dynamics di rifiuto, per esempio, l'andamento nel tempo del rigetto in allotrapianto cardiaco e trapianto renale differisce in modo significativo in determinate combinazioni di deformazione ^6. Abbiamo descritto i modelli renale acuta rigetto allogenico in BALB donatori / c in non-transgenici topi FVB / NJ, questo modello ha mostrato lesioni mediato cellulare con accumulo di cellule T e macrofagi ^7. In alternativa abbiamo anche descritto un modello di danno cronica del trapianto che presenta fibrosi interstiziale e atrofia tubulare, questo risulta dal trapianto di un rene da C57BL / 6 ^BM12 donatori in C57BL / 6 destinatari, in quanto questi mouse sono caratterizzati da un unico MHC di classe II mis loci -match ^8.

Molteplici aspetti del trapianto sono stati studiati utilizzando il modello murino di trapianto renale tra cui rigetto acuto, rigetto cellulare e umorale, ischemia riperfusione, e sperimentando nuovi agenti terapeutici. Abbiamo modificato la t chirurgicaecnica per ridurre il tempo di funzionamento e migliorare la facilità di intervento chirurgico. In particolare abbiamo descritto donatore simultanea e la preparazione destinatario e un semplificato tecnica di anastomosi vascolare utilizzando un continuo aortica patch di anastomosi. Questo video e manoscritto forniranno punti chiave per aiutare nella creazione di questa tecnica.

Protocollo

Adeguati etica istituzionali nazionali e locali dovrebbero essere a posto prima di eseguire esperimenti su animali. In particolare nel Regno Unito i seguenti esperimenti sono stati intrapresi sotto gli Animali (Scientific Procedures) Act 1986, in cui sono disponibili ad operare contemporaneamente due microsurgeons il chirurgo donatore deve eseguire i passaggi 1,1-1,16 poi da 3.1 a 3.5, mentre il chirurgo destinatario esegue 2.1 a 2.8 . Per un singolo operatore le fasi possono essere seguite in modo sequenziale.

1 donatore Preparazione

Nota: La procedura qui presentata è un donatore C57BL / 6 ^BM12 e destinatario C57BL / 6 topi di sesso maschile di età compresa tra 8 a 16 settimane di vita con un peso corporeo superiore a 20 g. Tuttavia questa procedura può essere eseguita in modo riproducibile su una varietà di ceppi di topi. I dati presentati nella sezione risultati rappresentativi sono stati ottenuti da C57BL / 6, C57BL / 6 ^BM12 e topi BALB / c.

1. Procedure di Condotta Using strumenti chirurgici sterili e di consumo (autoclave), con sforza di mantenere il campo operatorio sterile come possibile. Eseguire la preparazione del donatore in contemporanea con la preparazione destinatario, se due chirurghi sono disponibili.
2. Anestetizzare il mouse con un'iniezione intraperitoneale (31G ago) di medetomidina (0,5 mg / kg) e ketamina cloridrato (200 mg / kg). Questo si traduce in un piano anestetico che viene mantenuta per 4 ore fornire tempo sufficiente per l'intera procedura da eseguire. Anestesia supplementare non è necessario.
3. Verificare che il mouse è anestetizzato (nessuna risposta a pizzico tep).
4. Shave addome del mouse e rimuovere tutti i capelli sciolti con nastro adesivo.
5. Posizionare il mouse sulla sua schiena su una stuoia riscaldata sterilmente drappeggiato e vagamente immobilizzare gli arti con nastro adesivo sterile.
6. Monitorare il mouse durante tutta la procedura per le ustioni termiche. Se possibile, utilizzare una fonte di calore non elettriche.
7. Applicare un lubrificante occhio e sanitize la parete addominale con una soluzione diluita di iodio.
8. Eseguire un'incisione mediana nell'addome per entrare nella cavità peritoneale e inserire un tre centimetri Calibri divaricatore addominale.
9. Applicare salina riscaldata per mantenere l'intestino e l'area chirurgica umida ed evitare inutili essiccazione dei visceri.
10. Coprire il mouse con teli sterili e spostare l'intestino alla sinistra dell'operatore (a destra del mouse) per esporre l'aorta, vena cava e il rene sinistro.
11. Applicare una pinza sfogo allo stomaco e tirare superiormente per esporre i principali vasi e rene sinistro completamente. Confezione umidi tamponi sterili (da 2 mm x 2 mm) nell'addome di ritrattare tessuti lontano dalla zona chirurgica, come ad esempio i lobi del fegato, vescicole seminali, e intestino.
12. Isolare il rene sinistro da nell'avventizia circostante, il grasso e la ghiandola surrenale sinistra nella cavità peritoneale senza mezzi termini dalla dissezione del tessuto connettivo con pinze punta fine. Posizionare le punte chiuse della pinza tra le aree che neEd da separare e lentamente lasciare le punte forcep per aprire a sezionare lo spazio.
13. Isolare la vena renale sinistra legando e dividendo la vena surrenalica e gonadica sinistra vena sinistra con 9 / O nylon. Posizionare la sutura vicino alla vena renale.
14. Legare e sezionare l'uretere con 7 / O sutura di seta vicino alla vescica lasciando la sutura termina lungo. Queste estremità lunga di sutura verranno utilizzati quando il rene è raccolto e sono necessari per l'anastomosi ureterale.
15. Per mobilitare e sezionare completamente l'aorta e vena cava inferiore e superiormente l'arteria renale e la vena utilizzare pinze punta fine di sezionare senza mezzi termini vasi linfatici e il grasso dalla parte anteriore e sui lati dei vasi.
16. Trovare il piano di tessuto tra l'aorta e vena cava e diffondere lentamente il forcipe. Aprire lentamente le punte delle belle pinze a punta a diffondere il tessuto con il minimo trauma.
17. Legare un sciolto 7 / O seta intorno all'aorta superiore ed inferiore per l'arteria renale passando un bel angolatopinze punta intorno alla parte posteriore dei vasi e di disegno attraverso una sutura. Questi punti di sutura saranno serrati prima di recupero rene per consentire la perfusione retrograda della University of Wisconsin soluzione.

2 Destinatario Preparazione

Come per la preparazione donatore follow passi da 1.2 a 1.8.

1. Spostare l'intestino alla destra dell'operatore (a sinistra del mouse) per esporre l'aorta, vena cava. Coprire l'intestino con una soluzione salina sterile tampone imbevuto.
2. Eseguire una nefrectomia destra legando l'arteria renale destra e la vena con 7/0 sutura di seta e poi dividere.
3. Legare l'uretere destro con 7 / O sutura di seta e dividere.
4. Mobilitare e sezionare completamente l'aorta e vena cava inferiore per l'arteria renale e la vena come descritto al punto 1.14 e 1.15. Garantire la completa dissezione tra l'aorta e vena cava. Fare attenzione a preservare l'arteria spermatica interna che corre anteriormente alla vena cava e aortun insieme con il fascio linfatico.
5. Identificare i vasi lombari esecuzione in retroperitoneo dalla vena cava e vena alla colonna vertebrale, legare con 9 / O seta in continuità, non c'è bisogno di dividere i vasi.
6. Identificare lo spazio sufficiente per posizionare i morsetti microvascolari con spazio tra di anastomosi vascolari.
7. Somministrare eparina per via endovenosa (5 unità) con pene dorsale vena.

3. donatori di rene Retrieval

Serrare i 7 / O cravatte di seta che sono stati posti in giro per l'aorta inferiore e superiore per isolare il rene dalla circolazione arteriosa.

1. Infondere retrograde freddo 0,2-0,5 ml della University of Wisconsin soluzione con un ago (31G) nell'aorta.
2. Dividere l'aorta entro le suture e dividere la vena renale alla sua giunzione con la vena cava per rimuovere il rene e l'arteria renale con una lunghezza dell'aorta. Dividere vasi lombari derivanti dall'aorta, se presenti, wenza legatura.
3. Posizionare il rene in soluzione salina fredda su un tampone sterile in un piatto di cultura.
4. Euthanize il topo donatore per dislocazione cervicale.

4. Trapianto di Rene - Rene Preparazione

1. Creare una patch aortica dividendo la parete dell'aorta longitudinalmente di fronte l'arteria renale. Identificare i lumi dei vasi nella patch che devono essere ligato o evitati quando si esegue l'anastomosi arteriosa.
2. Collocare una sutura 10 / O dall'esterno all'interno del lume della vena renale superiormente ed una seconda sutura separata inferiormente. Le suture utilizzati per dividere la vena surrenale e vena gonadica possono essere utilizzati per orientare la nave.
3. Posizionare il rene nel fianco destro del destinatario (Figura 1.1) e verificare che i punti di sutura sono in grado di garantire la anastomosi vascolari possono essere completate senza suture diventare intrecciati in tamponi o altri strumenti.

5. Rene Transplanzione - anastomosi vascolare

Applicare fascette microvascolari prima inferiormente poi superiormente che comprende la vena cava e aorta.

1. Fare un ventomy con un ago (31G) per pungere la parete anteriore della vena cava. Lavare il sangue dalla vena cava iniettando circa 50 microlitri di 0.9% NaCl.
2. Ampliare la venotomy utilizzando una pinza punta fine con la loro apertura nel venotomy modo che la lunghezza è equivalente al diametro della vena renale donatore.
3. Inserire la sutura superiore 10 / O (che è già nel lume della vena renale) prima all'apice del venotomy (Figura 1.2) ed entra nella parete posteriore della anastomosi in una sutura continua fino a raggiungere l'apice inferiore (Figura 1.3).
4. Posizionare il 10 / O sutura inferiore e legare prima con un singolo nodo (Figura 1.4), poi legare la sutura che va dalla parete di fondo.
5. Utilizzando la sutura inferiore creare il fronte wall della anastomosi (Figura 1.5) con una sutura continua e legare alla fine sutura superiore al vertice superiore (Figura 1.6).
6. Crea un aortotomy sollevando la parete dell'aorta con una pinza e taglio di una patch ellittica con le forbici (circa il aortotomy dovrebbe essere un quinto della circonferenza dell'aorta e tre volte il lume dell'arteria renale di lunghezza).
7. Inserire un 10 / O sutura nel punto superiore della patch aortico dall'esterno all'interno (Figura 1.7) e passare attraverso l'aorta per legare fuori dei vasi all'apice superiore della aortotomy.
8. Creare l'anastomosi arteriosa con una sutura continua a partire superiormente (Figura 1.8) anastomosing la patch donatore al destinatario aorta, fare attenzione a non costringere l'anastomosi legando la sutura troppo stretto (Figura 1.9).
9. Rimuovere le pinze vascolari inferiori prima poi il morsetto superiore al reperfuse rene (Figura 1.10 e 1.11). Visibile peristalsi dell'uretere forse vede se viene raggiunto un adeguato apporto di sangue al uretere.

6 Trapianto di Rene - Anastomosi Ureteric

1. Dividere eventuali allegati della vescica dalla parete addominale.
2. Far passare un ago (21G) da sinistra a destra della vescica attraverso entrambe le pareti.
3. Inserire punte forcep diritte nel lume dell'ago e passare sia indietro attraverso la vescica tale che le pinze sono ora passando da destra a sinistra dal lato sinistro della vescica.
4. Tracciare la sutura sul uretere donatore attraverso la vescica tale che l'uretere passa nel difetto vescica sinistra poi dal lato destro.
5. Suturare la avventizia dell'uretere alla avventizia della vescica con tre singoli punti staccati in giro per il punto di ingresso con 9 / O nylon sutura su un ago rotondo e corposo.
6. Tagliare il prossimale dell'uretere alla legatura, aprendo così the uretere per consentire l'urina di fluire e permettere al fine uretere per ritrarre nel corpo della vescica. Visibile produzione di urina può essere osservata con sanguinamento da peri-ureterali vasi.
7. Chiudere il diritto difetto vescicale laterale con un solo interrotto 9 / O sutura di seta.

7 Recupero e assistenza post-operatoria

Sostituire i visceri gastro-intestinale in addome secondo l'orientamento originale e chiudere la parete addominale mediante il ravvicinamento delle muscoli retti con 6 / O sutura assorbibile.

1. Approssimare la pelle con clip in metallo pelle.
2. Parzialmente invertire l'anestesia con una iniezione sottocutanea di cloridrato atipamazole (10 ml / g).
3. Somministrare analgesia sottocutanea buprenorfina cloridrato (0,05 mg / kg) e il supporto per l'iniezione di fluido 1 ml di sottocutanea 0,9% NaCl.
4. Recuperare il mouse in un armadio riscaldamento a 28 ° C per 24-48 ore. Osservare il mouse per malattia fino allacompletamento dell'esperimento.
5. Rimuovere le clip di pelle metallo 7 - 10 giorni dopo l'intervento.
6. Una volta che l'esperimento è completo eutanasia il mouse per dislocazione cervicale.
7. Togliere e raccogliere il rene controlaterale e allogenico per l'analisi istologica.

Risultati

Renale rigetto del trapianto allogenico può essere valutata mediante analisi istologica di sezioni di tessuto incluse in paraffina methacarn-fisso del rene trapiantato (Figura 2). Trapianto di reni tra Isograft risultati topi singenici in renale danno da riperfusione ischemica, comunque da 4 settimane di tubuli hanno recuperato e sono istologicamente paragonabili a reni nativi. Rigetto acuto può essere modellato da C57BL / 6 trapianto renale in riceventi BALB / c, entro 1 settimana non vi è diffusa infi...

Discussione

Il modo più ben descritto effettuare l'anastomosi arteriosa è utilizzare l'aorta distale del donatore, con l'arteria renale in continuazione, in modo end-to-side all'aorta destinatario. Descriviamo l'uso di una patch aortica, simile al mirroring 'Carrell cerotto' che ha effettuato nel trapianto di rene umano che riteniamo essere più conveniente. Anche se segnalazioni in letteratura di tempo donatore e ricevente operativa sono scarsi crediamo che utilizzando una patch aortico al destinatario a...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Strumenti chirurgici Forbici
dissezione smussate	Strumenti per la scienza fine	14072-10	Per il taglio della pelle
Forbici curve Castoviejo	Strumenti per la scienza fine	15017-10	Per il taglio dei tessuti
Forbici a molla - dritte	Strumenti per la scienza	15000-08	Per il taglio della sutura
Pinze dentate 1x2 denti	Strumenti per le scienze	11021-12
2 pinze a punta fine (Dumont No.5)	Strumenti per le scienze fini	11251-20
Pinze angolate a punta fine (Dumont n. 5/45)	Strumenti per le scienze	11253-25	Per la dissezione smussata
Pinze a punta fine curva (Dumont n. 7)	Strumenti per le scienze	11273-22	Utile per passare intorno ai vasi
Crile Haemostat curvo	Strumenti per le scienze	1300-04
Applicatore di micro clip con blocco	Strumenti per le scienze	18056-14
2 x Micro serrefines larghezza molla 2 mm, lunghezza ganascia 4 mm	Fine Science Tools	18055-04	Morsetti microvascolari
2 x Divaricatore a filo Colibri da 3 cm	Fine Science Tools	17000-03
Porta aghi Castroviejo con blocco	Fine Science Tools	120660-01
Applicatore di clip per ferite	Fine Science Tools	12031-07
Clip per ferite da 7 mm	Fine Science Strumenti	12032-07	Rimuovere da 7 a 10 giorni dopo l'intervento
Attrezzatura
Microscopio OPMI pico	Carl Zeiss	S100
Unità di cauterizzazione termica con punta fine	Geiger	150A
Pad elettronico termico	Cozee Cumfort	n/a
Euroklav 23-S	Melag	n/a	Autoclave
Monouso attrezzatura
7/O Sutura intrecciata in seta	Pearsall	30514
10/O Sutura Dafilon (poliammide)	B-Braun
6/O Vicryl (plygalectin)	Ethicon	W9537
Ago smussato regolare, 1 pollice, 21G	Bection, Dickinson and Company	305175	Per anastamosi ureterale
Ago smussato regolare, 5/8 pollici, 25G	Bection, Dickinson and Company	305122
Ago smussato regolare, 1/2 pollice, 30G	Bection, Dickinson and Company	304000
Ago da insulina 1ml, 29G	Bection, Dickinson and Company	324827
Ago da insulina 0,3ml, 30G	Bection, Dickinson and Company	324826
1 ml con punta a slitta	Bection, Dickinson and Company	300184
siringa da 5 ml con punta a slitta	Bection, Dickinson and Company	302187
Tamponi di carta Wypall	Kimberley-Clark	L40	sterilizzato in autoclave
Cotton fioc	Johnson and Johnson	n/a	sterilizzato in autoclave
Teli lisci	Guardian	CB03	sterilizzato in autoclave
Piatto di coltura cellulare 60 mm x 15 mm	Corning Incorporated	430166
Spillo di erogazione	B-Braun	DP3500L / 413501	Utilizzato con NaCl 0,9%
Reagenti e farmaci
(Lacri-Lube) Paraffina morbida bianca 57,3%, olio minerale 42,5% e alcoli di lanolina 0,2%	Allergan Ltd	21956GB10X
(Videne) Povidone-iodio 10%	Ecolab Ltd	PL 04509/0041
(Vetalar V) Ketamina cloridrato	Pfizer Animal Health	Vm 42058/4165	100mg/ml soluzione (dose 200mg/kg)
(Domitor) Medetomidina cloridrato	Orion Pharma	Vm 06043/4003	1mg/ml (dose 0,5mg/kg)
(Vetergesic) Bupernorfina cloridrato	Alsto Animal Health	Vm 00063/4002	0,3 mg/ml (dose 0,05 mg/kg)
(Antisedan) Atipamezolo idrocoruro	Orion Pharma	Vm 06043/4004	5 mg/ml (dose 2 mg/kg)
Soluzione dell'Università del Wisconsin	Belzer Bridge to Life	n/a	dose circa 500 microlitri/topo
NaCl 0,9%	Baxter	FKE1323
Eparina solfato	non proprietario	n/a	5000 unità/ml (dose 5 unità/mouse)

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