Per affrontare i meccanismi di demielinizzazione e apoptosi neuronale nelle lesioni corticali dei disturbi demielinizzanti infiammatori, vengono utilizzati diversi modelli animali. Qui descriviamo un approccio ex vivo utilizzando cellule T CD8+ specifiche per gli oligodendrociti su fette di cervello, con conseguente morte oligodendrogliale e neuronale. Vengono discusse le potenziali applicazioni e i limiti del modello.
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Articolo metodologico
Un Ex vivo Modello di un attacco T-Cell Oligodendrocyte-diretto nel acute cervello fette
In questo articolo
Sommario
Abstract
La morte degli oligodendrociti accompagnata dalla distruzione di neuroni e assoni sono reperti istopatologici tipici nelle lesioni della sostanza grigia corticale e sottocorticale nei disturbi infiammatori demielinizzanti come la sclerosi multipla (SM). In questi disturbi, si trovano principalmente cellule T CD8+ di putata specificità per antigeni correlati alla mielina e agli oligodendrociti, per cui l'apoptosi neuronale nelle lesioni della sostanza grigia può essere un effetto collaterale di queste cellule. Vengono stabiliti diversi tipi di modelli animali per studiare i meccanismi alla base dei processi fisiopatologici menzionati. Tuttavia, sebbene imitino alcuni aspetti della SM, è impossibile sezionare l'esatto meccanismo e il decorso temporale della morte delle cellule neuronali "collaterali". Per affrontare questo corso, qui mostriamo un protocollo per studiare i meccanismi e la risposta temporale del danno neuronale a seguito di un attacco di cellule T CD8+ diretto da oligodendrociti. Per colpire solo la guaina mielinica e gli oligodendrociti, le cellule T CD8+ specifiche per gli oligodendrociti attivate in vitro vengono trasferite in fette cerebrali isolate acutamente. Dopo un periodo di incubazione definito, il danno mielinico e neuronale può essere analizzato in diverse regioni di interesse. Verranno discusse le potenziali applicazioni e i limiti di questo modello.
Introduzione
La morte degli oligodendrociti e la distruzione della guaina mielinica accompagnata dalla perdita di neuroni e assoni sono reperti patologici tipici nelle lesioni della sostanza grigia in individui affetti da sclerosi multipla (SM)1,2. Le lesioni corticali possono essere suddivise finora in tre diversi sottotipi2: lesioni subpiali, intracorticali e leucocorticali. Rispetto alle placche di sostanza bianca, gli infiltrati sono caratterizzati da una predominanza di cellule T CD8+, suggerendo un loro possibile ruolo decisivo nell'infiammazione della sostanza grigia3. Inoltre, espansioni oligoclonali nel sangue, nel liquido cerebrospinale (CSF) e all'interno delle lesioni infiammatorie possono essere trovate per le stesse cellule T CD8+ 4-6.
In linea con ciò, si presume che le cellule T CD8+ possano essere specifiche per diverse proteine mieliniche7,8. Infatti, le cellule T CD8+ si trovano vicino agli oligodendrociti e alle guaine mieliniche9,10 che mostrano l'espressioneMHC I 11 e potrebbero quindi essere responsabili della perdita della guaina mielinica. Questo processo è spesso osservato insieme a un esteso danno neuronale e assonale "collaterale" all'interno della materia grigia del sistema nervoso centrale (SNC)1,2. Infatti, la morte diretta e indiretta di oligodendrociti e neuroni è indotta dalle cellule T CD8+ attraverso due diversi meccanismi: (i) rigonfiamento e rottura della membrana cellulare a causa della formazione di granuli citotossici in seguito al rilascio di perforine e granzimi e (ii) legatura ai recettori Fas o esposizione di FasL sulla loro superficie8,12,13.
Diversi tipi di modelli animali sono stabiliti per studiare il meccanismo sottostante dei processi menzionati. A questo proposito, le cellule T CD8+ innescate specifiche per gli autoantigeni con espressione indotta nelle cellule gliali del SNC, come gli oligodendrociti o gli astrociti, possono essere trasferite adottivamente per analizzare la morte neuronale e assonale ''collaterale'' nella materia grigiasuccessivamente 14,15. Eseguire tali esperimenti in vivo è di grande aiuto per imitare alcuni aspetti fisiopatologici della SM, tuttavia, questo approccio non è adatto a risolvere il meccanismo e la cinetica alla base del danno assonale e dell'apoptosi neuronale.
Per superare queste restrizioni, è stato stabilito un approccio ex vivo per studiare i meccanismi e il decorso temporale della morte delle cellule neuronali a seguito di un attacco di cellule T CD8+ diretto agli oligondendrociti. Poiché solo gli oligodendrociti e quindi la produzione di guaina mielinica dovrebbero essere presi di mira dalle cellule immunitarie, vengono utilizzate cellule T OT-I reattive all'ovoalbumina (OVA) di classe MHC16. Queste cellule vengono successivamente trasferite in fette di cervello ottenute da topi che esprimono selettivamente OAV negli oligodendrociti (topi ODC-OVA)17.
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Protocollo
Tutti gli esperimenti che utilizzano topi devono essere effettuate in conformità con le linee guida del rispettivo cura degli animali e l'uso del comitato istituzionale.
1. Osservazioni generali per esperimenti del mouse
- Tenere i topi in condizioni esenti da organismi patogeni e consentire loro l'accesso a cibo e acqua ad libitum.
NOTA: E 'importante usare i topi per età e sesso nei gruppi trattati perché i modelli immunologiche possono variare a seconda dell'età e del sesso.
2. Preparazione e attivazione di OVA-specifiche cellule T CD8 + (OT-I)
- Eseguire la stimolazione di cellule OT-I T come descritto di seguito 5 giorni prima della preparazione fettine di cervello.
NOTA: 5 x 10 5 effettrici attivato CD8 + OT-I cellule T (CD8 + T-cellule di topi transgenici che riconoscono solo l'OVA 257-264 peptide nel contesto di molecole MHC-I) sono necessari per fetta della concentrazione 5 x 10 5 è stato scelto esperimentoalleati come quella ottimale per favorire una buona interazione cellula-cellula, una volta che le cellule iniziano a migrare nella fetta e, allo stesso tempo, la quantità di cellule non è troppo elevata per indurre una reazione eccessiva permettendo conteggio singola cella 8,18. - Preparare il supporto per la coltura di cellule T OT-I. Supplemento 500 ml DMEM con siero fetale bovino al 5% (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutammina, 50 mM 2-mercaptoetanolo, 1% aminoacidi non essenziali e 25 ug / ml di gentamicina. Conservare il mezzo a 4 ° C fino al momento dell'uso.
- Rimuovere la milza di OT-I topi transgenici come da riferimento 16. Trasferirle nel mezzo preparato.
- Generare sospensione singola cella da schiacciare milza attraverso un colino e centrifugare la sospensione di 70 micron a 300 xg per 5 minuti, 4 ° C.
- Incubare sospensione cellulare con 5 ml di ammonio-cloruro di potassio (ACK) tampone (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0.1 mM EDTA, pH 7,3) per 5 minuti per lisare i globuli rossi.
- Smettere incubaticon il supporto 10 ml e centrifugare nuovamente come sopra descritto.
- Diluire sospensione cellulare in media e calcolare i numeri. Cellule piastra a una densità di 3 x 10 7 cellule / pozzetto in una piastra 12 pozzetti e prime loro da incubazione con OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 nM) e interleuchina 2 (IL-2) (500 UI / ml) per 5 giorni.
- Dopo 4 giorni, aggiungere IL-2 ad una concentrazione di 500 UI di nuovo / ml.
- Successivamente alla stimolazione, purificare OT-I linfociti T di sospensione cellulare utilizzando un negativo del mouse basata selezione kit di isolamento delle cellule T CD8 + seguendo le istruzioni del produttore. La purificazione si basa sulla deplezione di tutti CD8 + cellule non utilizzando un cocktail di anticorpi contro CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC di classe II, Ter-119, e TCRγ / δ che vengono poi scartati utilizzando colonne magnetiche per l'eluizione delle cellule T CD8 + purificate.
NOTA: passaggi critici in questo Operazire sono indicati dalla fabbrica: è importante che la reazione coinvolge solo singole cellule perché la presenza di grumi potrebbe bloccare la colonna durante la fase di eluizione; contando della cella prima di aggiungere il cocktail Byotin è importante per il grado di purezza del campione e la procedura deve essere eseguita su ghiaccio per minimizzare binding anticorpi aspecifici.
3. Preparazione di acuta Fette cervello e co-coltura con cellule T OT-I
- Prima della preparazione di cerebrale acuto seziona 19, preparare la soluzione ghiacciata placedine fisiologica salina con il saccarosio 200 mM, 20 TUBI mM, 2,5 mM KCl, 1,25 destrosio 0,5 CaCl 2 e 10 mM mM NaH 2 PO 4, 10 mM MgSO 4, e liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) utilizzando 125 mM NaCl, KCl 2,5, 1,25 NaH 2 PO 4, NaHCO mM 24 3, 2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 10 mM destrosio. Regolare il pH di ogni soluzione a 7,35 per using NaOH. Prima di regolare il pH del ACSF, soluzione deve gorgogliare con una miscela di 95% O 2 e 5% CO 2.
- Pre-raffreddare le soluzioni.
- Anestetizzare 8 - 10 settimane di età topi (ad esempio, C57BL / 6 come controllo o transgenici ODC-OVA 17 topi con inalazione usando 5,0% isoflurano, 5,0% alotano o iniettare 100 mg / kg ketamina e 10 mg / kg di peso corporeo xilazina via ip Attendere per l'anestesia e utilizzare un pizzico punta a valutare il livello di anestesia e decapitare in una volta. Euthanize topi secondo la cura degli animali istituzionale e utilizzare criteri di commissione per l'eutanasia.
- Mettere il mouse in posizione ventrale. Disinfettare e tagliare il cuoio capelluto sagittale. Aprire l'osso cranico sagitally, rimuovere il cervello rapidamente con l'aiuto di una paletta e fissarla sulla piastra di vibratome utilizzando colla.
- Riempire la piastra con la soluzione salina preparata placedine ghiacciata fisiologico.
- Tagliare 300 micron fette coronali con vibratome.
NOTA: Questa procedura è saperen cedere campioni di tessuto intatta vitali adeguati studi cellulari funzionale all'interno di un intervallo di tempo di almeno 8 ore 19-21. Infatti, dopo questo periodo di tempo, a partire già dopo 6 ore, il preparato dimostra qualità ridotta, cioè cambiamenti nelle proprietà di base e funzionali come l'azione potenziale di generazione e propagazione. - Dopo il sezionamento, trasferire immediatamente una fetta in ciascun pozzetto di una 12-pozzetti pieni di ACSF.
- Aggiungi attentamente 5 x 10 5 cellule OT-I T per fetta.
- Incubare fette fino a 8 ore in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2).
- Dopo il periodo di incubazione, fette di raccolta e incorporare mediante ottobre composto Tissue-Tek e congelarli in azoto liquido. Conservarli a -20 ° C per ulteriori studi istologici per esempio, valutare la struttura neuronale (ad esempio, utilizzando anti-MAPII o anti-sinaptofisina) o apoptosi (ad esempio, utilizzando anti-caspasi-3 anticorpi e anti-NeuN controorganismi) secondo le procedure standard.
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Risultati
Dopo incubazione di fette di cervello con CD8 + T-cellule oligodendrociti-diretta, oligodendrociti nonché neuroni apoptosi (Figure 2A e 1C, rispettivamente). Segni istologici di apoptosi (ad esempio, caspasi-3, Tunel) possono essere rilevati prima dopo 3 ore di incubazione. Il periodo di incubazione non deve essere superiore a 8 ore per garantire una buona qualità della preparazione e risultati riproducibili. Le cellule apoptotiche possono essere trovati in tutto il fetta con prepond...
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Discussione
Diversi modelli animali sono stati descritti nel corso degli ultimi decenni, per affrontare le caratteristiche patologiche di disturbi demielinizzanti infiammatorie come MS. In vivo modelli di topo e ratto sono ampiamente utilizzati per simulare le caratteristiche fisiopatologiche della malattia, vale a dire, l'analisi delle conseguenze dei processi di demielinizzazione e rimielinizzazione e di episodi Interlacciati di infiammazione e neurodegenerazione. Tuttavia, solo un approccio ex vivo consente...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 to S.G.M. ME3283/2-1 to S.G.M.) e da Innovative Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB e SGM).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra a 12 pozzetti | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoetanolo | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Metilbutano | Roth | 3927.1 | |
| 70 &; m filtro | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | cloruro di calcio |
| CD8+-kit di isolamento | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucosio | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | siero fetale per vitelli |
| Gentamicina | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | cloruro di potassio |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | carbonato acido di potassio |
| L-glutammina | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | solfato di magnesio |
| NaCl | Sigma | 31434 | cloruro di |
| sodioNaH2PO4 * H2O | Merck | 1.06346.0500 | sodio idrogeno fosfato |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | sodio carbonato acido |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | sodio idrossido |
| NH4Cl | Sigma | 213330 | cloruro di ammonio |
| Aminoacido non essenziale | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovoalbumina |
| TUBI | Sigma | P6757 | |
| Saccarosio | Merck | 1.07687.1000 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 |
Riferimenti
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