Il livello di stato stazionario di specifici mRNA è determinata dalla velocità di sintesi e decadimento del mRNA. Velocità di degradazione mRNA genome-wide o dei tassi di decadimento di specifici mRNA può essere misurata determinando emivita mRNA. Questo protocollo si concentra sulla misurazione del mRNA tassi di decadimento in Saccharomyces cerevisiae.
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Articolo metodologico
Misura di mRNA Decay Prezzi in
In questo articolo
Sommario
Abstract
mRNA livelli allo steady variano a seconda delle condizioni ambientali. Regolamento delle costanti livelli di accumulo stato di un mRNA che assicura la corretta quantità di proteine è sintetizzata per le condizioni di crescita specifici della cellula. Un approccio per misurare i tassi di decadimento mRNA è inibire la trascrizione e successivamente monitorare la scomparsa del già presente mRNA. La velocità di degradazione dell'mRNA può essere quantificato, e un accurato emivita può essere determinata utilizzando diverse tecniche. In S. cerevisiae, protocolli che misurano mRNA sono stati sviluppati emivita includono inibendo la trascrizione di mRNA utilizzando ceppi che ospitano un allele sensibile alla temperatura di RNA polimerasi II, rpb1-1. Altre tecniche per mRNA emivite includono l'inibizione della trascrizione con inibitori trascrizionali come thiolutin o 1,10-fenantrolina, oppure misurando, utilizzando mRNA che sono sotto il controllo di un promotore regulatablecome il galattosio promotore inducibile e il sistema TET-off. Qui, descriviamo la misurazione di S. cerevisiae mRNA tassi di decadimento con l'allele sensibile alla temperatura di RNA polimerasi II. Questa tecnica può essere usata per misurare mRNA tassi di decadimento di singoli mRNA o di tutto il genoma.
Introduzione
La trascrizione e il decadimento di mRNA specifici sono determinanti cruciali della espressione genica. La velocità di sintesi e decadimento di specifici mRNA determina il livello di stato stazionario di quel particolare mRNA. I livelli di stato stazionario di mRNA governano l'abbondanza di mRNA e di determinare quanto di ogni mRNA è disponibile per la sintesi proteica. Misure di emivita di mRNA sono ampiamente utilizzati per determinare il tasso di decadimento di mRNA. MRNA specifico decadimento a tassi diversi che sono legati alle caratteristiche del mRNA, la funzione della proteina codificata dal mRNA e delle condizioni ambientali. A seconda della tecnica util....
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Protocollo
1. La crescita di cellule di lievito
- Selezionare le opportune ceppi di lievito da utilizzare per le misure di mRNA tasso di decadimento. Per inibire la trascrizione con l'allele sensibile alla temperatura di RNA polimerasi II, utilizzare ceppi di lievito che ospitano la mutazione rpb1-1 1. Ottenere questo ceppo di lievito da un laboratorio che ha già uno, o generare in laboratorio utilizzando tecniche standard se un background genetico specifico è richiesto 9.
- Usando una tecnica sterile, preparare mezzi lievito utilizzando le procedure standard 10. Se è necessaria alcuna selezione, preparazione rich m....
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Risultati
La capacità di questo protocollo per misurare con precisione i tassi di decadimento mRNA dipende l'inibizione della trascrizione, la raccolta di cellule di lievito nei momenti opportuni, e l'utilizzo di tecniche di RNasi libero, mentre l'estrazione dell'RNA e Northern blotting. Probing per due mRNA controllo notoriamente instabile e stabile, rispettivamente, prevede la fiducia che l'esperimento ha funzionato. Ad esempio, questo può essere realizzato attraverso una prova con una sonda che rileva.......
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Discussione
L'inibizione della sintesi di mRNA e monitoraggio fatturato mRNA in assenza di nuova sintesi è un metodo che viene spesso utilizzato per misurare i tassi di decadimento mRNA. In S. cerevisiae, la misurazione dei tassi mRNA decadimento inibendo la trascrizione usando l'allele termosensibile di RNA polimerasi II è uno dei metodi più usati. Questo metodo inibisce specificamente l'RNA polimerasi II. Le fasi più critiche per la determinazione dei tassi di decadimento mRNA con questa tecnica sono: 1) Prim.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.
Ringraziamenti
La ricerca nel laboratorio dell'autore è supportata dal Programma di Ricerca Avanzata Norman Hackerman del Texas Higher Education Coordinating Board e dai fondi di avviamento della Baylor University.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Centrifuga ad alta velocità | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini centrifuga | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Membrana Genescreen Plus | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Forno di ibridazione | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Spettrofotometro Nanodrop | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Schermo al fosforo | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| Cross-linker UV | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | In alternativa la membrana può essere cotta in un forno impostato a 80 gradi per 1 ora |
| Tampone di preibridazione/ibridazione NorthernMax | Life Technologies | AM8677 | |
| Ceppi di lievito che ospitano la mutazione | I ceppi di lievito possono essere ottenuti in laboratorio o creati con un background |
Riferimenti
- Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
- Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRN....
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Ristampe e permessi
