Metodo di isolato Ex Vivo Lung Perfusion in un modello di ratto: Lezioni apprese da Sviluppo di un programma EVLP Rat

Sommario

Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) ha permesso il trapianto di polmone nell'uomo a diventare più facilmente disponibili, consentendo la possibilità di valutare gli organi ed espandere il pool di donatori. Qui, descriviamo lo sviluppo di un programma di topo EVLP e filtri che consentono un modello riproducibile per espansioni future.

Abstract

Il numero di polmoni donatori accettabili disponibili per il trapianto polmonare è molto limitata a causa della scarsa qualità. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) ha permesso il trapianto di polmone nell'uomo a diventare più facilmente disponibili, consentendo la possibilità di valutare gli organi ed espandere il pool di donatori. Poiché questa tecnologia si espande e migliora, la capacità di valutare potenzialmente e migliorare la qualità dei polmoni scadente prima del trapianto è una necessità critica. Per valutare più rigorosamente questi approcci, un modello animale riproducibile occorre stabilire che permetterebbe sperimentazione di tecniche migliorate e gestione dei polmoni donati nonché al destinatario polmone-trapianto. Inoltre, un modello animale EVLP di patologie associate, ad esempio, la ventilazione indotta danno polmonare (VILI), fornirebbe un nuovo metodo per valutare trattamenti per queste patologie. Qui, descriviamo lo sviluppo di un programma di polmone EVLP ratto e filtri di questo meThOD che consente un modello riproducibile per espansioni future. Descriviamo anche l'applicazione di questo sistema EVLP modellare VILI nei polmoni di ratto. L'obiettivo è quello di fornire alla comunità di ricerca con informazioni chiave e le "perle di saggezza" / tecniche emerse dalle prove ed errori e sono fondamentali per stabilire un sistema EVLP che è robusto e riproducibile.

Introduzione

Rilevanza clinica

Attualmente vi è una scarsità di polmoni idonei disponibili per il trapianto di solo il 19% dei polmoni di essere in grado di essere utilizzato a livello nazionale che porta a protratta tempo di attesa-list o pazienti che muoiono in attesa di trapianto ^1. La carenza può essere causa di donatori anziani, traumi, infezioni, insufficienza multipla d'organo e polmoni donatori talvolta feriti su raccolto ^2. Inoltre, il polmone è un organo fragile di fuori della cavità toracica e tecniche di trasporto e conservazione normali può portare a deterioramento e non vitali polmoni. Pertanto, mantenere e migliorare la redditività del polmone ex-vivo è recentemente diventato un obiettivo importante in medicina trapianto di polmone.

Ex-vivo Lung Perfusion (EVLP)

Ex-vivo perfusione polmonare (EVLP) si è evoluto a perfusione continua organi in corso di valutazione per il trapianto e consente un periodo di valutazione che tuttiOWS per il potenziale di rianimazione polmonare o ricondizionamento. EVLP può prolungare totale di organo del corpo tempo ischemico e consentire agli organi donati per viaggiare distanze maggiori ^{di 3.} In genere, i polmoni sono ventilati al 50% della capacità polmonare totale o 20 _cmH2O di pressione delle vie aeree picco con una frazione di ossigeno inspirato _(FiO2) del 30% al 50% ^4. Conservazione soluzione è perfuso in 40-60 ml / kg (circa il 40% della gittata cardiaca previsto di 100 ml / kg) negli esseri umani e animali di grandi dimensioni ^5,6, ma è perfuso intorno al 20% della gittata cardiaca per i ratti ^7. L'inclusione di soluzione STEEN ha permesso polmoni umani di viaggiare in ambienti RT senza sviluppo di edema polmonare ^9. Questo lavoro pionieristico è stata perfezionata dalla University of Toronto Lung Transplant Programma ^10-13 ed è in corso di valutazione per una migliore valutazione dei polmoni donatori marginali per il trapianto ^14,15. Tuttavia, il ventilatio ottimalen e perfusione condizioni necessarie per rigenerare i polmoni marginali e / o sub-standard, per il trapianto non è noto ed è attualmente una superficie attiva di ricerca.

Isolato sistemi di perfusione polmonare sono stati utilizzati nei piccoli animali per causare danno polmonare, ricreare malattie respiratorie, e profumato polmoni con diverse soluzioni per impedire il danno ischemico. Gli investigatori hanno creato un modello di piccoli animali di trapianto polmonare, utilizzando il sistema isolato polmone-perfusione per imitare i protocolli EVLP che potrebbero essere utilizzati nell'uomo e negli animali più grandi ^16-18. Tuttavia, questo modello sperimentale ha molte sfide per quanto riguarda le varie tecniche e parametri utilizzati per imitare fisiologia umana. In particolare, ci sono molte sottigliezze nel mantenere la vitalità del polmone durante EVLP. Queste sottigliezze possono sorgere a causa di differenze nella tecnica di raccolta, le impostazioni di ventilazione a pressione positiva, le condizioni di composizione e del flusso perfusato e incannulamento del polmone. Therrima, l'obiettivo è quello di fornire alla comunità di ricerca, con un numero di risoluzione dei problemi e di implementazione suggerimenti che abbiamo trovato portare ad un metodo affidabile per implementare EVLP in un modello di roditore.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sono state eseguite secondo le linee guida della Animal Care istituzionali e guida del Consiglio Nazionale delle Ricerche per la cura umana e uso di animali da laboratorio (IACUC) e ha subito l'approvazione da parte del Comitato Ohio State University IACUC.

1. Configurazione iniziale

1. Impostare il circuito EVLP e hanno caldo (37 ° C) perfusato circola attraverso il sistema prima di incorporare la-ex piantata polmonare (Figura 1).
2. Impostare la vasca dell'acqua calda, utilizzata per rivestimento serbatoio perfusato, scambiatore di calore, e torace artificiale, a 37 ° C e circolanti (Figura 1).
3. Eseguire una soluzione de-ossigenazione (ad esempio, 6% O _2, 8% CO _2, 84% N ₂₎ contatore entra attraverso il perfusato nel filtro del gas per assicurare perfusato ha ~ 6% di ossigeno disciolto per l'esperimento.
   NOTA: Questo perfusato de-ossigenato permette la valutazione of la funzione polmonare misurando l'ossigeno introdotto nel perfusato, post-organo.
4. Aprire il programma di acquisizione dati e collegare il trasduttore di pressione arteriosa polmonare, trasduttore di pressione differenziale tracheale, respiratorio trasduttore di pressione differenziale flusso, polmone peso trasduttore e trasduttore velocità della pompa al circuito EVLP e il convertitore di acquisizione dati / analogico-digitale ( Figura 2).
5. Impostare il tavolo operatorio e strumenti operativi sul circuito EVLP (Figura 3).
6. Impostare un piccolo contenitore di azoto liquido nei pressi del circuito EVLP se saranno ottenuti campioni.
   NOTA: Sistema dell'autore è stato modificato per raccogliere pre-e post-organo organo perfusato senza interrompere le dinamiche di pressione-flusso che potenzialmente possono ferire il polmone.

2. Preparazione di anestetici e eparina, anestesia di Rat

1. Indossare i seguenti dispositivi di protezione individuale(PPE) prima di maneggiare ratti e tessuto di ratto: maschera chirurgica, guanti chirurgici, e abito a gettare.
2. Pesare il ratto e registrare il peso.
3. Preparare 1.200 U / kg di eparina.
4. Preparare entrambe 60 mg / kg ketamina e 5 mg / kg xilazina nella stessa siringa, preparando la ketamina prima.
5. Intraperitoneale iniettare la miscela di ketamina e Xilazina nel ratto e consentire 5 minuti per il ratto di diventare inconsapevole.
6. Verificare il corretto anestesia controllando pizzico punta reflex. Se il ratto non ritira la sua punta, non si sente dolore.
7. Spostare rat a tavolo operatorio, fissare in posizione supina, e spruzzare con alcool per la sterilizzazione.

3. Estrazione e ventilazione iniziale dei polmoni Rat

1. Preparare 4-20 cm suture lungo in seta (3-0 o 4-0 dovrebbe essere sufficiente).
2. Iniziare la registrazione dei dati utilizzando il programma di acquisizione dei dati.
3. Verificare la presenza di adeguata profondità dell'anestesia, usando le forbici chirurgiche entrano peritoneale cavità da una laparotomia mediana e iniettare eparina nella vena cava inferiore.
4. Trasportare l'incisione cranialmente passato il manubrio nel collo fino a quando la trachea è esposto. Non rompere la cavità toracica (Figura 4A).
5. Sezionare posteriormente alla trachea sulla linea mediana e far scorrere una sutura di seta posteriormente alla trachea (Figura 4B).
6. Sollevare la sezione anteriore della trachea e fare una incisione trasversale tra gli anelli cartilaginei, alti sulla trachea. Non tagliare attraverso la porzione posteriore membranosa della trachea a questo punto (Figura 4C).
7. Incannulare la trachea con la cannula tracheale e sicuro con la sutura di seta (Figura 4D). Assicurarsi che la legatura sutura viene fissato nella dentellatura per mitigare la migrazione della cannula.
8. Collegare la cannula tracheale al circuito di ventilazione.
9. Accendere il ventilatore meccanico per avviare meccanico di ventilazione del lungs.
   NOTA: Le impostazioni iniziali sono stati scelti per essere un volume corrente di 4 ml / kg e la pressione positiva di fine espirazione (PEEP) di 2 cmH ₂ O. Queste impostazioni sono le impostazioni iniziali e in funzione delle condizioni sperimentali possono essere regolati una volta che l'organo è nel sistema di perfusione ex vivo.
10. Inserire la cavità toracica attraverso lo sterno / xifoidea e proseguire in direzione craniale soprasternale. Fare attenzione a non toccare i polmoni.
    NOTA: il polmone del ratto è fragile, qualsiasi manipolazione accidentale può portare a traumi ed edema polmonare (Figura 5A).
11. Utilizzando 2 divaricatori, ritrarre la cavità toracica per esporre correttamente l'anatomia (Figura 5A). Ancora una volta, fare attenzione a non toccare i polmoni.
12. Rimuovere il timo con lieve elevazione e smussa.
13. Spostare il contenuto addominale di un lato per esporre sia la vena cava inferiore (IVC) o la vena mesenterica (MV).
14. Incidere sia il IVC o l'MV per Exsanguinate ratto, fornendo eutanasia.
15. Inserire un posteriore sutura di seta l'arteria polmonare e l'aorta in preparazione per garantire l'arteria cannula polmonare (Figura 5B).
16. Eseguire un'incisione di 2-3 mm sulla superficie anteriore del tratto di efflusso del ventricolo destro e posizionare la cannula nella incisione e nella principale arteria polmonare e fissarlo con la sutura di seta (Figura 5C).
17. Transect l'apice del cuore per consentire l'accesso al ventricolo sinistro e lavare eventuali coaguli all'interno dei vasi polmonari scorrendo ~ 15 ml di una soluzione a basso K ⁺ elettrolita attraverso l'arteria polmonare e fuori attraverso l'apice del cuore nella cavità toracica ( Figura 5D).
18. Collegare la cannula arteria polmonare (PA) al circuito EVLP. Assicurarsi linea flusso proveniente dal circuito alla cannula PA è innescato con perfusato per evitare qualsiasi aria che entra nel cuore e polmoni.
19. Accendere ilprincipale pompa peristaltica e impostarla a un minimo (~ 2 ml / min) velocità per consentire perfusato a correre attraverso l'arteria polmonare e il ventricolo sinistro nella cavità toracica. ** PUNTO CRITICO ** Verificare la pressione PA non spike come questo è un segno di sia un blocco o povero incannulamento (Figura 6).
20. Spegnere la pompa peristaltica.
21. Posizionare una sutura di seta dietro il cuore, intorno ai ventricoli (Figura 7).
22. Iniziare il processo di cannulating atrio sinistro inserendo una piccola coppia di pinze chirurgiche nel vertice, attraverso la valvola mitrale, e nell'atrio sinistro.
    NOTA: Questo dilatare la valvola mitrale e facilitare la cannulazione. Dilatazione aggressivo, o troppo profondo dilatazione, possono inavvertitamente lacerare l'atrio sinistro rendere l'approvvigionamento inefficace.
23. Rimuovere la pinza dal cuore.
24. Inserire la cannula atrio sinistro nel vertice attraverso la valvola mitrale e dentro a sinistrarium.
25. Fissare la cannula atrio sinistro con la sutura di seta dietro il cuore (Figura 8).
    NOTA: Questo sutura può essere "pre-legato" per facilitare cannulazione.
26. Collegare l'arteria polmonare cannula per l'ex-vivo circuito di perfusione polmonare (Figura 9A). Non collegare l'atrio della cannula di sinistra al circuito EVLP fino a quando il blocco cuore-polmone è stato completamente rimosso dal corpo.
27. Bloccare l'esofago con un emostatico e tagliare sotto il morsetto (tra il morsetto e il diaframma) in modo che l'esofago può essere utilizzato per aumentare la strutture cardiopolmonare cefalica.
28. Bluntly sezionare il tessuto circostante e tagliare l'aorta discendente e navi ausiliarie per liberare il blocco cuore-polmone mentre viene sollevata tramite l'esofago (Figura 9B).
29. Transetto la trachea cefalica alla cannula completamente gratuito tracheale blocco cuore-polmone.
30. Rimuovere il blocco cuore-polmone e posizionare nel desiposizione gnated sul circuito EVLP (Figura 9C).
31. Collegare la cannula atrio sinistro alla linea di deflusso e avviare la principale pompa peristaltica (Figura 9d).

4. Ex Vivo perfusione dei polmoni

1. Rimuovere rapidamente la linea di ventilazione dall'alto dell'apparato EVLP e fissare l'alloggiamento dei sensori di pressione, quindi inserire la linea di ventilazione sulla sommità dell'alloggiamento sulla parte superiore dell'apparecchio EVLP.
   NOTA: Questo permetterà ai dati di ventilazione per essere registrati e monitorati pressione.
2. Assicurarsi che la trappola bolla è riempito con una adeguata quantità di perfusato in modo che bolle d'aria (cioè, emboli d'aria) vengono introdotti ai polmoni.
3. Cambiano lentamente impostazioni di ventilazione e perfusione a livelli sperimentali desiderati durante la prima 15 min. Inoltre, in questa fase di accelerazione iniziale, aumentare il flusso di perfusione alla frequenza e / o la pressione desiderata.
   NOTA: Programmzione il ventilatore per produrre respiri sigh intermittenti, che facilitano il movimento di fluido dallo spazio polmone e quindi ritardare l'insorgenza di edema, è raccomandato. Questi possono essere prodotti da ventilatori dotati della funzione sospiro.
4. Definire "Time 0" come il momento in cui i parametri di ventilazione sono a un volume corrente di 4 ml / kg, PEEP alle 2 cm H ₂ O, e parametri di perfusione sono ai loro livelli attesi e rimane costante.
5. Se necessario, prelevare campioni perfusato dal porto di esempio, flash congelare in azoto liquido, e annotare l'ora dei campioni.
6. Quando l'esperimento è completa, isolare eventuali pezzi anatomici necessari per la raccolta e sia il flash congelamento in azoto liquido o il luogo in soluzione di fissaggio per ulteriori studi.

Risultati

I dati meccanici in tempo reale raccolti mediante il programma di acquisizione dati possono essere facilmente analizzati per verificare qualsiasi numero di ipotesi. Ad esempio, la Figura 10A mostra il peso medio del polmone attraverso 60 min da 10 esperimenti di ratto in cui gli animali sono stati ventilati con un volume corrente / bassa PEEP bassa di 4 ml / kg e 2 cmH ₂ O. Anche se vi è un aumento molto minore in peso polmonare durante l'esperimento, questo aumento non è statisticamente significativa (ANOVA, p = 0,92). La Figura 10B mostra la pressione media arteriosa polmonare (PAP) tramite 60 min da 12 esperimenti ratto. Il PAP inferiore al punto di tempo 0 min è il risultato di regolazioni di portata e di ventilazione inferiori utilizzati all'inizio di tutti gli esperimenti e la PAP rimane costante dopo questo punto di tempo senza variazioni statisticamente significative dopo t = 10 min (ANOVA su ranghi, p = 0.89). Figura 10C mostra la resistenza vascolare polmonare (PVR) tramite 60 min da 12 ratesperimenti e anche se c'è un piccolo calo in PVR dopo t = 20 min, non vi era alcuna differenza statisticamente significativa in PVR durante questo esperimento (ANOVA a ranghi, p = 0,65). Rispetto ai dati PVR mostrati qui, Noda et al. ha dimostrato il PVR ad aumentare leggermente nel tempo per 4 ore. Tuttavia, gli autori segnalano i dati PVR partendo da 1 ora anziché dall'inizio dell'esperimento e senza valori di deviazione standard sono forniti ^7. Noda et al. inoltre non mostra i dati edema polmonare per i 4 esperimenti hr in modo che nessun confronto può essere fatto con i dati qui presentati nella figura 10A. Le principali differenze di Noda et al. Procedura rispetto a quanto mostrato in questo documento includono: un 1 hr conservazione a freddo in soluzione LPS prima EVLP, ratti sono stati inizialmente ventilato con una miscela di gas comprendente isoflurano renderle inconscia, la soluzione è stata integrata perfusato con 50 mg di metilprednisolone e 50 mg di cefalosporina, fl totaleow è stato definito come il 20% della gittata cardiaca calcolata, i campioni sono stati prelevati perfusato solo dopo polmone era stato ventilato sul 100% O ₂ per 5 minuti prima e l'esperimento è stato eseguito per 4 ore.

I campioni prelevati durante l'esperimento dal perfusato possono essere analizzati per vari scopi. Come esempio, nella Figura 11 si dimostra come alta marea volume / alta ventilazione PEEP può indurre una risposta pro-infiammatoria in 60 min. Per questi esperimenti, il perfusato da 4 ratti ventilato in condizioni pregiudizievoli, ovvero, ad alto volume corrente di 10 ml / kg e alto PEEP di 8 _cmH2O, sono stati analizzati per citochine pro-infiammatorie e anti IL1β, TNF e IL4 utilizzando lo standard tecniche ELISA. Come mostrato in Figura 11, rispetto ai livelli di citochine prima ventilazione (0 min), 60 min di ventilazione pregiudizievole determinato un aumento statisticamente significativo IL-1β e TNF (citochine pro-infiammatorie) un nd nessun cambiamento in IL-4 (una citochina antinfiammatoria) concentrazione. Pertanto, questo sistema EVLP è in grado di generare i profili danno polmonare comunemente osservati durante la ventilazione meccanica.

Figura 1. Schema e fotografia del piccolo circuito animali ex-vivo perfusione polmonare (EVLP). Le lettere nel diagramma corrispondono con le lettere nella fotografia. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Tutto trasduttori sono collegati saldamente alle caselle di controllo."> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Il tavolo operatorio ratto è impostato in modo sicuro fino adiacente al circuito ex vivo di perfusione polmonare (EVLP). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. (A) L'incisione viene fatta cranialmente per esporre la trachea. La cavità toracica non è esposto. (B) Un sutura di seta viene posizionato dietro la trachea. (C) La trachea è parzialmente tagliata per preparare cannulazione. (D) La cannula tracheale viene messo in positio n e fissato con una sutura di seta. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. (A) La cavità toracica viene tirato indietro per consentire l'accesso al cuore e ai polmoni. (B) Preparazione di messa sutura dietro l'arteria polmonare. (C) L'arteria polmonare è incannulato e legato con la sutura di seta precedentemente posizionato. (D) Una soluzione a basso K ⁺ elettrolita viene svuotata attraverso l'arteria polmonare e l'atrio sinistro per rimuovere eventuali coaguli di sangue. Cliccate qui per vedere una più grande versione di questa figura.

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Figura 6. L'aumento del flusso arterioso polmonare durante il lavaggio del polmone può causare la pressione arteriosa polmonare ad aumentare notevolmente. Se incannulamento è stata eseguita correttamente e non vi è alcun blocco principale, la pressione dovrebbe diminuire. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .

Figura 7. Silk sutura è posto attorno a tutto cuore, in preparazione per l'atrio incannulamento di sinistra. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 8. La cannula atrio sinistro è fissato in posizione con una sutura di seta. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 9. (A) L'arteria polmonare cannula è collegata al circuito di perfusione polmonare ex-vivo. (B) L'esofago viene bloccato e il tessuto connettivo è bruscamente sezionato per rimuovere il blocco cuore-polmone. (C) Il blocco cuore-polmone viene rimosso dalla cavità toracica e inserito nel circuito di perfusione polmonare ex-vivo. (D) L'atrio sinistro è collegato al circuito di perfusione polmonare ex-vivo. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig9large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 10. (A) Lung peso di ratti maschi Sprague Dawley attraverso 60 min di perfusione ex vivo polmonare (n = 10). (B) pressione arteriosa polmonare di ratti maschi Sprague Dawley attraverso 60 min di ex vivo perfusione polmonare (n = 12). (C) la resistenza vascolare polmonare di ratti maschi Sprague Dawley attraverso 60 min di ex vivo perfusione polmonare (n = 12), NS indica alcuna differenza statisticamente significativa. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 11. Effetto di ventilazione 1 ora a elevati volumi correnti (10 ml / kg) e alta PEEP (8 cmH ₂ O) sulle concentrazioni di citochine pro-infiammatorie e anti del perfusato. N = 4, * indica differenza statisticamente significativa rispetto a 0 campione hr (p <0.05). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 12. (A) A correttamente ventilazione e perfusione polmonare collegato al circuito EVLP. (B) ad alta pressione positiva di fine espirazione (PEEP) provoca uno strappo alla biforcazione della trachea causando bolle per formare al pregiudizio e riempire il torace artificiale. es / ftp_upload / 52.309 / 52309fig12large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 13. (A) polmonare cannula arteria. Questo cannula è minore della cannula dell'atrio sinistro. (B) Sinistra atrio cannula. Questo cannula è molto più grande della cannula dell'arteria polmonare. (C) Trachea cannula. Questo cannula ha costole per aiutare a garantire la trachea con sutura di seta. La fine che viene inserito nella trachea è anche un po 'indicato per favorire l'inserimento della cannula nella trachea. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 14. (A) L'apice cardiaco è tenuto da una pinza come ventricolo destro sta per essere incisi per cannulare l'arteria polmonare. (B), dilatazione dell'annulus valvola mitrale con un paio di piccole contundenti-ended pick-up rende più facile visualizzare il tratto nell'atrio sinistro. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

SISTEMA DI MONITORAGGIO

Quali cose simile a quando esperimento sta funzionando bene:

Una volta che le cannule sono state collocate nel circuito ei polmoni sono ventilazione, ci sono diversi modi per garantire che il sistema funzioni correttamente. Non ci dovrebbero essere perdite di perfusato tutta la linea. La resistenza vascolare polmonare (PVR) dovrebbe rimanere relativamente costante (ipotizzando un flusso costante). Lo scambio di ossigeno dovrebbe aumentare una volta che il ventilatore funzioni correttamente e ampliando i polmoni di reclutare più alveoli per lo scambio di gas. Figura 12A mostra polmoni collegati al circuito EVLP all'interno del torace artificiale adeguatamente ventilato e perfuso.

Quali cose simile a quando esperimento non funziona bene:

Ci sono alcuni problemi comuni che hanno avuto il più alto tasso di occorrenza durante le fasi iniziali di un esperimento EVLP. Il primo e più semplice to rimedio è una perdita nella linea di uscita dal polmone. Questo è evidente da un pool di raggruppamento perfusato sotto parte del circuito e il livello nel serbatoio continua diminuzione. Controllare e stringere i connettori dei tubi intorno alla area della perdita e ispezionare il tubo stesso per una perdita. Se questa perdita si verifica prima del polmone, può anche introdurre bolle nel polmone. Questo dovrebbe essere risolto il più rapidamente possibile, come bolle d'aria nel perfusato provocheranno danni ai tessuti e causare un aumento significativo del PVR. Ci può essere anche una perdita proveniente dal polmone o una delle cannule. Ciò può essere causato da uno slittamento di una cannula o un'ostruzione nella linea uscente provocando un accumulo di pressione. Controllare la posizione per entrambe le cannule per garantire né è scivolato o torta. La pressione PA dovrebbe essere monitorata durante questo processo, perché un aumento istantaneo della pressione PA è un segno evidente che di recente si è verificato un ostacolo di qualche tipo. Figura 12Bmostra un polmone rottura che rotto a causa di pressioni elevate. Una perdita dal polmone stesso può anche essere causato da uno strappo nel tessuto. Questo problema può o non può essere riparabile ma riposizionamento e serrando nuovamente il cannule è l'opzione migliore in questo scenario.

Key Learning Punti / opportunità:

Trial e lo sviluppo di errore del sistema di perfusione polmonare ex-vivo hanno permesso di individuare alcuni punti chiave che ci viene qui delineato per facilitare l'efficace attuazione del sistema EVLP. In primo luogo, per quanto riguarda l'approvvigionamento, è importante che le tecniche anestetiche standard sono seguiti per anestetizzare correttamente gli animali (abbastanza anestetici, iniezione nel peritoneo) e adesione a tutte le politiche IACUC è richiesto. Il cannule (mostrato in Figura 13 A, B, e C) dovrebbe essere ripetutamente lavato per rimuovere eventuali coaguli e / o detriti nel vasculat polmonareUre. Per quanto riguarda la selezione degli animali, si consiglia di utilizzare Sprague Dawley o Lewis ratti peso di 250-350 g. Particolare attenzione dovrebbe essere presa quando cannulating ratti di peso vicino ai 250 g, poiché le imbarcazioni saranno più piccola e quindi molto più difficile da cannulare senza ferire la vascolarizzazione. Se ratti più piccole, o un modello di topo, deve essere utilizzato, più piccola cannula può essere necessario utilizzare.

Tracheale cannulazione non è tipicamente impegnativo finché la sutura viene fissato correttamente prima passando una sutura di seta posteriormente alla trachea dopo sezionare i fascia circostanti e prima cannulazione. Seguire questo con un anteriore incisione 1-2 anelli tracheali sopra la sutura di passare la cannula. Tie nodi quadrati tra gli anelli tracheali per fissarlo in una gola per maggiore sicurezza (Figura 4C). Incannulazione dell'arteria polmonare (PA) è più impegnativo rispetto alla cannula tracheale. Le seguenti operazioni sono stati usati in questo studioper questa procedura. In primo luogo, cogliere l'apice del cuore con un paio di pinze. Passare un altro paio di pinze in seno trasverso e filo una sutura per fissare la cannula nel prossimale PA. Incidere subito il ventricolo destro prima che il diritto tratto di efflusso ventricolare (RVOT) (Figura 14A). Dopo l'incisione nella RVOT, la cannula viene guidato verso il tratto dell'arteria polmonare efflusso. Avendo la sutura nella posizione dietro la polmonare / aorta prima della ventricolotomia destra aumenta l'efficienza (Figura 5C). La cannula dovrebbe essere fissato in posizione con la sutura per evitare dislocazione. Una complicazione grave può verificarsi se la cannula PA non è l'orientamento anatomica corretta. La cannula può essere inserito troppo in là e solo defluire in un ramo o diventare mal-posizionata con torsione del campione cuore-polmone dopo l'estrazione dalla cavità toracica. Questo può essere facilmente orientato nella posizione originaria di preservare il corretto angolo di anatomiPosizione cal. Infine, atriale sinistro (LA) incannulazione è la parte più impegnativa della procedura. La cannula LA deve essere posizionato all'interno dell'atrio sinistro. Con i tessuti essere estremamente friabile, fare attenzione a non usare la forza significativa o torsione per evitare una rottura all'interno della vena polmonare e atrio sinistro che sarebbe poi rendere l'esperimento irrecuperabile. La cannula PA è nella posizione migliore prima cannula LA. Un ventricolotomia sinistro con la rimozione dell'apice ha dimostrato di perturbare il tendinee cordae e permettere un più facile accesso attraverso volantini mitrale. Inoltre, il ventricolotomia rende più facile dilatare e visualizzare la valvola mitrale e per alimentare la cannula attraverso la valvola mitrale. Dilatazione dell'annulus della valvola mitrale con una coppia di piccole blunt-ended pick-up può essere realizzata in modo da visualizzare il tratto in LA (Figura 14B). Sutura deve essere posizionato dietro il cuore prima di incannulamento. Questo può essere fatto semplicemente sollevando cuore utilizzando una coppia di gocciolil blunt-ended pick-up e mettendo la sutura sotto e attraverso il cuore. La LA è ora pronto per essere cannulata. Feed cannula LA attraverso pick-up per visualizzare correttamente il posizionamento della cannula nell'atrio sinistro. Faccia attenzione a non rimuovere la cannula di nuovo nel ventricolo sinistro. La sutura deve poi essere saldamente fissato lungo il miocardio del ventricolo sinistro. Assicurare la sutura all'atrio sinistro potrebbe occludere l'intera o parte della cannula.

Durante la procedura, è fondamentale che l'aria rimanga nella sezione afflusso di dell'apparecchiatura. L'aria significativa può produrre un'embolia aria aumentare la PVR (efficacemente un "air-lock") che si tradurrà in un flusso perfusato molto inferiore per una data pressione. Vari punti possono essere utilizzati per rimuovere l'aria all'interno del sistema. Aria all'interno della sezione di efflusso è previsto e non dovrebbe avere alcun effetto deleterio sulle polmoni. Un modello suino di ipertensione polmonare è statadimostrato di ricreare la patologia da continue piccole quantità di aria oltre un periodo di 8 settimane. L'aria aumentato diminuisce la quantità di perfusione presente mentre causando infiammazione ai tessuti circostanti ^19.

L'apertura di perfusione può verificarsi quando la cannulazione è completa, ma prima che il tubo proveniente dalla LA è collegato alla linea EVLP. Perfusato deve essere eseguito tramite per cancellare eventuali coaguli di sangue e questo può svuotare perfusato nella parete toracica senza problemi. Inserimento della pompa perfusato in modalità manuale e aumentando lentamente la portata di ~ 2 ml / min consente un attento monitoraggio della pressione PA. Pressioni oltre 20-30 _cmH2O possono indicare un ostacolo e guardare per uscire dal perfusato LA è anche un indicatore, ma questo può essere molto difficile da vedere. Se la pressione non aumenta di oltre 20-30 _cmH2O, arrestare la pompa e ricontrollare entrambi cannulazioni. Una volta che la pressione è costante intorno 10-20 _cmH2O consentire the perfusato a correre attraverso e nella cavità toracica per 2 min. In questo momento la linea dal LA può essere collegato al circuito EVLP. La velocità della pompa perfusato può essere aumentata a 5-10 ml / min. Come la testa fluida progredisce attraverso il circuito, ci sarà un aumento della pressione PA dovuto all'aumento in altezza della testa fluida e quindi la pressione statica. Se il fluido non può fluire nel punto più alto della linea, può essere necessario o applicare una forza di aspirazione sul lato opposto della linea o tentare di abbassare la parte più alta della linea. Una volta che questo problema è superato, il perfusato deve circolare senza problemi.

Alcune questioni devono essere monitorati per quanto riguarda il ventilatore. In primo luogo, torsione di bronchi / trachea e posizione di cuore-polmone può verificarsi come i polmoni diventano più edematosa e il peso aumenta. E 'importante per il cannule di rimanere in una posizione relativamente vicina anatomica, quindi alterare uno o entrambi cannulae può essere necessario. Pressione o ventilatori controllato il volume e la ventilazione positiva o negativa può essere utilizzato con questo sistema EVLP. Per il modello di ratto, abbiamo trovato con pressione positiva, controllata del volume di ventilazione funziona bene a volumi correnti tra 4-10 ml / kg e a pressioni positiva di fine espirazione (PEEP) tra 2-8 cmH ₂ O. Tuttavia, una PEEP di 8 cmH ₂ O può causare una possibile rottura alla biforcazione della trachea. Dopo ogni esperimento (o una serie di esperimenti se eseguita back-to-back), la linea di ventilazione che porta alla trachea deve essere pulito ogni lavaggio broncoalveolare (BAL) che possono aver viaggiato la trachea. Questo fluido si indurisce se lasciato intatto e in grado di bloccare completamente la linea di ventilazione.

La composizione perfusato è fondamentale per un esperimento EVLP successo. Una miscela destrano 5% consente di perfusione polmonare che è vicino alle condizioni fisiologiche, mantiene una pressione oncotica stabile per guidare fluido back nel sistema vascolare per prevenire l'edema e previene la trombosi all'interno dei vasi polmonari. È importante notare che alcune specie di ratti possono essere allergici al destrano che potrebbe causare edema polmonare ^20. Il contenuto del perfusato è stato coerente in tutti i gruppi sperimentali in questo studio, quindi il contenuto destrano non dovrebbe essere un confounder. La pressione oncotica è una variabile critica che ha il potenziale di migliorare o produrre l'edema tissutale. Le soluzioni di perfusione disponibili in commercio che sono ottimizzati per l'archiviazione statica a freddo o perfusione normotermici sono stati utilizzati in questo sistema per aumentare i tempi di vitalità del polmone. Prendiamo atto che alcune di queste soluzioni contengono albumina e una preoccupazione è la possibilità di albumina bovina innescare una risposta infiammatoria nel polmone roditore. Anche se la composizione perfusato ottimale è un soggetto in corso di indagine, il perfusato deve tener conto della pressione oncotica, la capacità di pressione e di buffering osmotica. We raccomanda che la soluzione si basa su una soluzione o di coltura cellulare Krebs-Henseleit supporti modificati. La pressione oncotica deve essere mantenuto da destrano o albumina, a seconda dell'applicazione. Il tasso di pressione e di flusso di perfusione influisce sui parametri di perfusione di organi e sovra-fisiologica può fare l'organo soggetto a traumi meccanici.

Indicatori visivi durante l'esperimento:

Ci sono molti riferimenti visivi nonché indicazioni da dati in tempo reale che può essere utilizzato per determinare se un esperimento EVLP funziona bene. Il polmone rimane la stessa dimensione e si sgonfia allo stesso volume dopo ogni respiro. Ci saranno anche senza perdite dal polmone stesso. Il PVR, il peso del polmone, e la conformità rimarrà relativamente costante. Produzione di ossigeno rimarrà costante o aumentare leggermente.

Ci sono molti indicatori visivi quando il polmone viene compromesso durante un esperimento. Il polmone diventa edematosa unnd cresce rapidamente in dimensioni e peso. Il colore dei cambiamenti polmonari (da un tan-rosa al bianco) e sacche di liquido può essere identificato nel tessuto. Se la trachea o polmonari rotture da barotrauma o oltre distensione, ci sarà spumeggiante dal punto di lesioni (Figura 12B). Produzione di ossigeno diminuisce e il PVR e la conformità aumenterà notevolmente pure.

Il potenziale di utilizzare un modello di EVLP su piccoli animali come roditori apre la porta per gli studi futuri migliorare il trattamento dei trapianti di polmone. Tuttavia, il piccolo modello animale richiede una migliore comprensione di imitare veramente un trapianto di polmone. Questo modello può essere utilizzato in futuro per migliorare trattamenti medici e definire i parametri di base per i futuri studi trapianto polmonare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
IPL-2 Basic Lung Perfusion System	Harvard Apparatus
Tweezer #5 in acciaio inossidabile, curvo 11  cm	Kent Scientific Corporation	IND500232
Pinzetta #5 Dumostar, 11  cm	Kent Scientific Corporation	INS500085-A
Pinzetta #7 Titanio, 12  cm punte curve	Kent Scientific Corporation	INS600187
McPherson-Vannas forbici 8  cm, Str 5  mm	Kent Scientific Corporation	INS14124
Forbici Vannas 8  cm Str 5  mm	Kent Scientific Corporation	INS14003
Vassoio di sterilizzazione per strumenti 5" x 7"	Kent Scientific Corporation	INS800101
Eparina 30.000 unità per 30 ml	APP Pharmaceuticals	Fornito da OSU Pharmacy
Ketamina 500  mg per 5  ml	JHP Pharmaceuticals	Fornito da OSU Farmacia
Xilazina 100  mg per 1  ml	Akorn	Fornito da OSU Pharmacy
10  siringa da insulina cc 29  G x 1/2" ago	BD	309301
Hyflex NBR	Ansell	S-17310M	Guanti a prova di morso
BL1500	Sartarius	Practum 1102-1S	Scala
Grande Fondo Piatto Contenitore	Braintree Scientific Inc	FB L 3.375 diametro x 8.5, 250-500gm rat	Tunnel per topi per iniezione
Guanti da esame senza polvere in nitrile Sterling,	Kiberly-Clark	grandi 50708
Rapidpoint 405	Analizzatore di gas ematici	Siemens
Fiberoxygenator D150	Hugo Sachs Elektronik	PY2 73-3762
LabChart v7.3.7	ADInstruments
Cannula tracheale	Apparato	733557
polmonare Cannula arteriosa	Apparecchio Harvard	730710
Cannula atrio sinistro	Apparato Harvard	730712
Pompa peristaltica	Ismatec	ISM 827B
Ventilatore per piccoli animali modello 683	Harvard Apparatus	55-000
Ecoline Star Edition 003, E100	Lauda	LCK 1879	Cassetta per tubi scaldabagno
	Cole-Parmer	IS 0649
Kit di collegamento D150	Cole-Parmer	VK 73-3763
PowerLab 8/35	ADInstruments	730045
Modulo amplificatore trasduttore TAM-A tipo 705/1	Hugo Sachs - Apparato	Harvard 73-0065
Amplificatore trasduttore TAM-D tipo 705/2	Hugo Sachs - Apparato Harvard	73-1793
SCP Servocontrollore per perfusione tipo 704	Hugo Sachs - Apparato	Harvard 732806
amplificatore a ponte di frequenza portante CFBA tipo 672	Hugo Sachs - Apparato Harvard
di controllo del ventilatore 731747 VCM tipo 681	Hugo Sachs - Harvard Apparatus	731741
Modulo di controllo del tempo TCM tipo 686	Hugo Sachs - Harvard Apparatus	731750
IL2 Set di tubi per perfusato	Harvard Apparatus	733842
Set di tubi per camera umida	Harvard Apparatus	73V83157
Tygon E-3603 Tubi 2.4  mm ID	Harvard Apparatus	721017	linea perfusata che entra nel polmone
Tygon E-3603 Tubing 3.2  mm ID	Apparato di Harvard	721019	linea perfusata che lascia il polmone
basso potassio destrano soluzione			lavaggio del polmone