Cosa fare e cosa non fare di Cryo-microscopia elettronica: A Primer su preparazione del campione e raccolta dati di alta qualità per la ricostruzione macromolecolare 3D

Sommario

Questo articolo descrive la metodologia di microscopia crioelettronica, che viene utilizzata per ottenere immagini microscopiche di alta qualità di macromolecole nel loro stato quasi nativo. Il metodo produce immagini adatte per un'ulteriore elaborazione computerizzata utilizzando l'approccio della singola particella, ideato per generare la ricostruzione 3D di una macromolecola.

Abstract

La microscopia crioelettronica (cryoEM) comporta il congelamento rapido di un sottile strato di campione su un supporto, e quindi la visualizzazione del campione nel suo stato idratato congelato mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Ciò può essere ottenuto con quantità molto basse di proteine e nel tampone di scelta, senza l'uso di alcuna colorazione, che è molto utile per determinare le correlazioni struttura-funzione delle macromolecole. Se combinata con l'elaborazione di immagini a singola particella, la tecnica ha trovato un'ampia utilità per la determinazione strutturale 3D di macromolecole purificate.

Il protocollo qui presentato spiega come eseguire la cryoEM ed esamina le cause dei problemi più comunemente riscontrati per una risoluzione razionale dei problemi; seguire tutti questi passaggi dovrebbe portare all'acquisizione di immagini cryoEM di alta qualità. La tecnica richiede l'accesso allo strumento del microscopio elettronico e a un dispositivo di vetrificazione. La conoscenza dei concetti di ricostruzione 3D e del software è necessaria anche per l'elaborazione computerizzata delle immagini. È importante sottolineare che i risultati di alta qualità dipendono dalla ricerca delle giuste condizioni di purificazione che portino a una popolazione uniforme di macromolecole strutturalmente intatte.

La capacità della cryoEM di visualizzare macromolecole combinata con la versatilità dell'elaborazione di immagini di singole particelle si è dimostrata molto efficace per la determinazione strutturale di grandi proteine e macchine macromolecolari nel loro stato quasi nativo, l'identificazione dei loro molteplici componenti mediante mappatura delle differenze 3D e la creazione di strutture pseudo-atomiche mediante docking di strutture a raggi X. L'incessante sviluppo della strumentazione crioEM e delle tecniche di elaborazione delle immagini negli ultimi 30 anni ha portato alla possibilità di generare ricostruzioni 3D de novo a livello di risoluzione atomica.

Introduzione

L'obiettivo di cryoEM è ottenere elettroni immagini microscopiche di macromolecole nel loro stato idratato nativo. In virtù di incorporare macromolecola in acqua vetrificata, un campione congelato-idratato può essere introdotto direttamente e visualizzato nello strumento TEM. Vitrificazione, realizzato da Flash congelamento (10.000 ^o C / sec), si blocca il campione senza cristallizzazione dell'acqua e assicura che riarrangiamenti molecolari durante il congelamento sono insignificanti. L'eccesso di elettroni dispersione del campione rispetto al buffer circostante fornisce una piccola ma sufficiente contrasto per vedere la macromolecola in assenza di qualsiasi macchia ^1. Elaborazione delle immagini computerizzato può quindi essere utilizzato per ricreare struttura 3D della macromolecola. Grandi macromolecole nella gamma ~ 500 kDa- più MDa sono campioni ideali per cryoEM (che rappresentano oltre l'80% della microscopia elettronica Data Bank (EMDB) voci); questi includono proteine, complessi di proteine, acidi nucleici proteine-complexes e proteine ​​di membrana incorporati in un doppio strato. Queste macromolecole sono meno probabilità di essere cristallizzato (con meno di 2 voci% nel database PDB) eppure è spesso il caso che i pezzi più piccoli risolti da cristallografia a raggi X o NMR possono essere ancorate nella busta 3D creato da cryoEM. D'altro canto, alcune delle più grandi strutture risolti da cryoEM sono identificabili all'interno della cellula intera sezioni sottili TEM ^2. Così, cryoEM colma il gap dimensioni e la risoluzione tra strutture subcellulari e atomiche.

CryoEM meglio riflette struttura nativa della macromolecola rispetto al metodo più classico di colorazione negativa (NS), dove la macromolecola è disidratata e circondato da uno strato di metallo pesante macchia cui regione di esclusione macchia crea un forte contrasto immagine "negativo" ^3. In entrambi i casi il fascio elettronico produce immagini 2D proiezione delle macromolecole, dette particelle, dove le shape dipende dall'orientamento della macromolecola rispetto al fascio di elettroni. Molti particelle, almeno ~ 1.000 e senza limite superiore, possono essere analizzati sul computer con 'analisi singola particella' (SPA) software per aumentare il rapporto segnale rumore (SNR) se media, e per trovare i parametri di orientazione spaziale del particolato necessari per ricreare la macromolecola struttura 3D da retroproiezione ^4-7. NS, con una maggiore SNR, viene utilizzato per la caratterizzazione preliminare del campione e per generare un novo ricostruzione de 3D; risoluzione difficilmente supera 20 Å, imposto dalla disidratazione e dimensioni del grano metallo pesante. In generale, per la determinazione strutturale cryoEM 3D, una ricostruzione in 3D a bassa risoluzione viene prima ottenuto da NS e quindi cryoEM viene utilizzato per definire questa bassa risoluzione mappa iniziale di studiare ulteriormente la macromolecola nel suo stato nativo idratato, per vedere la sua struttura interna, e per aumentare la sua risoluzione. Note che se il modello NS è stato distorto (l'esempio più comune è appiattimento derivante dalla disidratazione ⁸⁾ e le particelle cryoEM avuto basso SNR, quindi la distorsione potrebbe portare nel modello cryoEM (l'artefatto modello pregiudizi, che è comune a basso SNR dataset ^9). Distorsione strutturale comporterebbe disallineamento tra le NS e particelle prime cryoEM e tra le particelle cryoEM prime e corrispondenti risalti del modello 3D ortogonale alla direzione appiattimento. Polarizzazione modello può risolvere da solo come il modello 3D subisce cicli di affinamento successivi. Se ciò si verifica, che verrebbe rilevato come la mancanza di corrispondenza tra particelle cryoEM prime e corrispondenti risalti dal modello 3D, poi un modello de novo dovrebbe essere costruita dai dati cryoEM. Un buon approccio potrebbe essere quello di utilizzare l'algoritmo ricostituzione angolare ^10, che può produrre diversi volumi 3D possibili, e quindi utilizzare il modello NS 3D per scegliere il miglior modello possibile cryoEMche sarà ulteriormente raffinato ^11. Una strategia ancora migliore è quello di aumentare il SNR del dataset cryoEM (vedi sezione dedicata nella discussione).

La qualità biochimica della macromolecola purificato ha una massima influenza il risultato finale. La macromolecola, purificata da tessuti o espressi in sistemi eterologhi, deve avere un elevato grado di purezza e di essere strutturalmente intatto. Essa non deve formare aggregati né dovrebbe disaggregare. Per definire una particolare conformazione, le condizioni di preparazione dovrebbero promuovere uno stato conformazionale uniforme. Per studiare complessi, è che la loro ottimale k _D è nell'intervallo nM, altrimenti fissativi sono stati utilizzati con successo per stabilizzare interazioni affinità inferiori ^12,13.

Immagini cryoEM trasformati producono preziose informazioni sulle dimensioni, schema generale, stato di aggregazione / multimerizzazione, l'omogeneità e la struttura interna del macromolecule. Tuttavia il potenziale della tecnica è notevolmente migliorata con l'elaborazione delle immagini. Una struttura 3D mostra l'architettura generale della macromolecola, 3D posizione di ligandi e subunità, cambiamenti conformazionali, e consente di aggancio delle strutture atomiche determinati dalla cristallografia a raggi X o NMR. La quantità di informazioni di una ricostruzione in 3D aumenta gradualmente la risoluzione è aumentata: in genere 15-20 risoluzione Å consente attracco inequivocabile di strutture atomiche, a 9-10 eliche Å alfa sono visibili come canne, a 5 Å è possibile discernere fogli beta, e con una risoluzione di 3.5 Å e migliore è possibile costruire un modello atomico ^14.

La possibilità di ottenere immagini informative e una ricostruzione 3D utilizzando SPA da relativamente piccole quantità di campione fare cryoEM una tecnica attraente, come 3-5 microlitri di almeno 0,05 mg / ml sono sufficienti per preparare una griglia TEM. I requisiti minimi strumentaliper cryoEM sono una crio-stantuffo fatta in casa o commerciale, un microscopio elettronico con alto vuoto ultra, supporti di registrazione di immagini e kit a basso dosaggio, un crio-porta con la sua stazione di pompaggio, un apparato scarica luminescente e un evaporatore. Caratteristiche non essenziali, ma ulteriormente desiderabili sul TEM sono camera CCD (presente in tutti i moderni TEM) o un rilevatore elettronico diretto, pistola emissione di campo (FEG), filtro di energia, e software di raccolta dati ad alta velocità. Questo software in linea di principio consente la raccolta di decine di migliaia di particelle in una singola sessione cryoEM ^15, tuttavia i maggiori esigenze di archiviazione dei dati e la successiva supervisione necessità tempo di post-elaborazione per essere presi in considerazione. FEG combinata con la funzione di trasferimento di contrasto (CTF) di correzione alla base la maggior parte delle ricostruzioni in 3D che ha raggiunto una risoluzione sufficiente per visualizzare alfa eliche. A quel punto, il livello di risoluzione è anche dipende dal campione: raggiungendo il 10 risoluzione Å è meno comune per le proteine ​​di membrana che, sealto ordine di simmetria è presente, risoluzione atomica è più realizzabile. Il recente sviluppo di rivelatori di elettroni diretti ha permesso la risoluzione atomica anche per macromolecole con bassa (4x) o no la simmetria, dove la qualità delle mappe di densità elettronica cryoEM soddisfa questi derivano da dati di raggi X diffrazione ^16,17.

Esempi pratici che illustrano le funzionalità della tecnica sono forniti qui per quattro importanti tipi di macromolecole dove cryoEM ha un ruolo principale Continuando nella loro determinazione strutturale. (I) Con la loro simmetria icosaedrica che aumenta il set di dati da parte di 60 volte e le loro grandi dimensioni che permette fedele e allineamento riproducibili, le strutture di diversi virus icosaedrici sono state risolte a risoluzione quasi atomica per cryoEM seguita da SPA ^18. Mostriamo un esempio di una classe di virus icosaedrici, i virus adeno-associati (AAV), per i quali le strutture quasi-atomiche per cryoEM e per cryoEM / x-ray hyMetodi brid esistono ^19,20. (Ii) macromolecole con struttura elicoidale includono microtubuli, filamenti e virus. I loro unità ripetitive lungo l'asse elicoidale possono essere analizzati da una versione più complessa di SPA adattato alla geometria elicoidale ^21. Nell'esempio mostriamo virus del mosaico del tabacco (TMV), un virus a RNA che è stato risolto alla risoluzione atomica da cryoEM ^22. (Iii) le proteine ​​solubili grandi sono stati ampiamente studiati. Tra questi, macromolecole formano cilindri multimerici simmetrici costituiscono un'architettura ricorrente spesso risolti con risoluzione subnanometer ^23,24. Qui vi mostriamo le immagini di KLH, un vettore di ossigeno invertebrato, dove un modello molecolare ibrido è stato creato da cryoEM / x-ray metodi cristallografia ibridi ^25. (Iv) le proteine ​​di membrana sono un'importante classe di proteine; costituiscono circa 1/3 delle proteine ​​codificate dal genoma umano, ma sono difficili da caratterizzare strutturalmente causa di complessità associate con transmembrane stabilizzazione dominio ^26, che costituiscono meno del 1,5% delle strutture risolti mediante qualsiasi tecnica strutturale combinato. Il ruolo di cryoEM e 3D ricostruzione nel loro determinazione strutturale è esemplificata con il recettore rianodina (RyR), una grande eucariotico intracellulare Ca ²⁺ canale importante nella contrazione muscolare e segnalazione cervello. Le strutture più alte risoluzione cryoEM fino ad oggi, con risoluzione 10 Å, rivelano struttura secondaria ^27.

Protocollo

1. Cryo-titolare di preparazione e manutenzione

NOTA: La stazione di pompaggio a secco, composto da una stazione di pompaggio turbo e uno o più controllori stadio freddi, viene utilizzato principalmente per tre scopi: a) è un luogo sicuro per memorizzare i titolari cryo quando non vengono utilizzati. Il modo corretto per memorizzare i titolari è di lasciarli nella stazione sotto vuoto. b) far evaporare l'accumulo gelo e l'umidità che si verifica quando l'azoto liquido viene rimosso dal dewar e la punta del supporto cryo esposta; ciò si ottiene con il ciclo di riscaldamento. c) Per rigenerare l'essiccante zeolite, e di ottenere un elevato vuoto nei dewar cryoholder. Ciò è necessario per tenere una temperatura costante quando facendo microscopia cryo elettronico.

1. Ciclo di riscaldamento.
   1. Inserire il supporto cryo in una delle porte di pompaggio della stazione di pompaggio. Collegare uno dei tubi di evacuazione verso l'uscita di metallo sotto la valvola del vuoto del titolare. FareAssicurarsi che tutte le valvole sulla stazione (V1, V2, e V3) e sul supporto crio sono chiusi.
   2. Accendere il controller palco freddo e collegarlo al titolare attraverso il cavo di controllo. Accendere l'interruttore di alimentazione della stazione di pompaggio turbo.
   3. Avviare l'opzione ciclo Warm-up nel controllore fase fredda. Quando il vuoto nella stazione di pompaggio turbo legge 10 ^-3 Torr o meglio, aprire la valvola a farfalla V2, attendere che il vuoto si stabilizza, e quindi aprire la V1 valvola a farfalla.
   4. Eseguire il ciclo di riscaldamento per circa 30 minuti fino a quando la temperatura nel supporto è stabile sopra i 20 ° C. Chiudere V1, e quindi fermare il ciclo.
2. Ciclo Zeolite. Eseguire il Ciclo Zeolite Tra 4 ore e O / N prima di una sessione CryoEM, e una volta a settimana se non in uso.
   1. Avviare l'opzione ciclo di zeolite e selezionare il tempo necessario per raggiungere un buon vuoto, nel range di 1-2 x 10 ^-4 Torr, e tempo di attesa così lunga. Quando il vuoto raggiunge 10 ^-3Torr, aprire la valvola dewar evacuazione, V3. La stazione di pompaggio poi evacuare la linea al titolare; attendere il vuoto stabilizza.
   2. Aprire la valvola sul supporto cryo. Quando il ciclo è completo, chiudere le valvole nell'ordine opposto in cui sono stati aperti: la valvola sul supporto, poi V3, V2, e infine V1. Spegnere la stazione di pompaggio turbo e il controller fase fredda, e staccare il supporto crio dal controller fase fredda e la stazione di pompaggio turbo.

2. Griglia di preparazione

1. Pulizia.
   NOTA: Quando si utilizzano griglie bucate commerciali, si raccomanda di pulirli prima dell'uso, in modo da rimuovere eventuali residui di polimero che è stato utilizzato nel processo di fabbricazione. Fate questo in una capsula di Petri in vetro con 5 strati di carta filtro previste nella parte inferiore.
   1. Posizionare le griglie sulla carta da filtro con il lato rivolto verso l'alto carbonio bucata.
   2. Utilizzando un vetro pipetta Pasteur, bagnare la carta con alcune gocce of cloroformio intorno alle griglie fino a che non appena iniziano a galleggiare.
   3. Coprire la capsula di Petri con il coperchio leggermente aperto in una cappa aspirante O / N.
2. NOTA: il supporto di carbonio sottile (punti 2.2-2.3) può essere omesso come strato di ghiaccio può essere formato direttamente attraverso i piccoli fori nella griglia di carbonio bucata.
   1. Utilizzando un paio di pinzette, fendere un pezzo di mica per esporre due nuove superfici. Posizionare le nuove superfici esposte di mica faccia-up su un pezzo di carta bianca in una capsula di Petri.
   2. Porre la capsula Petri nella campana di un evaporatore di carbonio. Avviare la sequenza della pompa verso il basso fino a vuoto è inferiore a 2 x 10 ^-6 Torr. Per evaporare eventuali impurità sulla superficie dell'asta di carbonio, eseguire un pre-evaporazione con il piatto Petri coperta. Poi in onda la campana e rimuovere il coperchio dalla piastra di Petri.
   3. Eseguire la sequenza pompa finché il vuoto è inferiore a 10 ^-6 Torr e rivestire la mica con uno strato sottile (~ 5 nm) di carbonio. Usare la protezione degli occhi durante carbonioevaporazione. Monitorare lo spessore del film di carbonio dal buio risultante sulla carta che era stato posto sotto i fogli di mica.
3. Trasferire il Carbon Thin al TEM griglia.
   1. Tagliare un 0,5 x 1 cm pezzo di mica rivestite e galleggiare il carbonio sulla superficie piatta filtrata, acqua deionizzata. Usare carta per lenti ottiche per ottenere una superficie di acqua piatta. Usando le pinzette, mettere il lato bucata carbonio della griglia a contatto con la superficie superiore dello strato di carbonio variabile e raccoglierlo.
   2. Ripetere i punti 2.3.1 e 2.3.2 fino sono preparati un numero sufficiente di griglie.
4. Glow Discharge.
   NOTA: La scarica luminescente converte il livello di carbonio rivestimento naturale idrofobico delle griglie in idrofila. Questo passaggio è facoltativo.
   1. Posizionare le griglie con il lato rivolto verso l'alto di carbonio su un vetrino 7,5 x 2,5 cm coperto con parafilm. Inserirlo nella camera delle attrezzature bagliore-scarico e chiudere la camera.
   2. Pompala campana e glow-scarico per 20 sec a 25 mA e 7 x 10 ^-2 mbar.
      NOTA: Durante questo periodo un bagliore viola luce diventa visibile. Rimuovere il vetrino con le griglie e utilizzarle entro 1 ora, altrimenti, dovranno essere scaricate nuovamente bagliore.

3. Il campione Plunge congelamento

NOTA: Usare occhiali di sicurezza e scarpe adeguate quando si utilizza questo strumento per proteggere azoto ed etano spruzzi di liquido.

1. Accendere l'apparecchio-tuffo congelamento. Riempire il serbatoio umidificatore con acqua distillata. Impostare la temperatura desiderata, l'umidità relativa e condizioni tuffanti per tempo blot, forza Blot e tempo di adsorbimento (22 ° C, 95%, 2 sec, 2 e 40 sec nell'esempio presentato qui). Porre nuova carta da filtro assorbente.
2. Raffreddare il contenitore etano dal riempimento del serbatoio esterno con azoto liquido fino stabilità è ottenuta (circa 10 min). Una volta che l'azoto liquido si arresta boiling, posizionare la punta del tubo proveniente dal serbatoio etano nella camera interna e aprire la valvola molto lentamente. Liquefare il etano nella camera interna e riempirlo a 1 mm dalla sommità. Evitare il congelamento del etano. ATTENZIONE: l'etano è estremamente infiammabile ed esplosiva.
3. Assicurarsi che le pinzette sono allineati all'interno dell'apparato tuffo di congelamento.
4. Accendere l'umidità. Caricare una griglia sui pinzette, e caricare 3-5 ml di campione sulla superficie di carbonio (lato opaco) della griglia bucata. Attendere il campione adsorbire alla rete ed eseguire il blotting per raggiungere un sottile strato liquido.
5. Flash-congelare la griglia immergendola in etano liquido. Rimuovere il gruppo pinzette-grid dal etano liquido tenendo le pinzette costantemente, e trasferirlo alla camera esterna con azoto liquido. Trasferire la griglia per una piccola scatola griglia immersi in azoto liquido. Assicurarsi di mantenere il campione vetrificata in azoto liquido per tutto il tempo durante il trasferimento sia al serbatoio di stoccaggioo al titolare di crio.
   NOTA: scatole di griglia possono essere memorizzati in una grande capacità (35-50 L) dewar di azoto liquido per almeno 1 anno. Per immagazzinaggio conveniente possono essere poste in un tubo da 50 ml Falcon con due fori nella parte superiore e una lenza attaccato al suo tappo che può essere tirato dalla bocca del dewar.

4. Trasferire la Cryo-griglia per la TEM

1. Inserire il supporto crio nella workstation crio-trasferimento. Fare attenzione a non danneggiare la punta del supporto durante l'inserimento. Controllare la presenza di piccole fibre e polvere sull'asta e l'O-ring del titolare cryo utilizzando una lente, se c'è qualche rimuovere con carta per lenti ottiche.
2. Riempire il dewar del titolare cryo ed il vaso workstation con azoto liquido. Evitare di versare l'azoto liquido utilizzando l'imbuto intrappolato che viene fornito con la workstation.
3. Collegare il titolare cryo al controllore fase fredda per monitorare la temperatura, e continuare ad aggiungere azoto liquido e #160, fino a quando la temperatura si stabilizza a circa -194 ° C. Assicurarsi che il livello di azoto liquido è sotto il livello della tenuta di vuoto sia nel vaso dewar workstation e il supporto cryo. Pre-raffreddare le pinzette griglia, l'anello di clip e la punta smussata dello strumento anello clip sulla workstation. Anche pre-raffreddare un insieme di grandi pinzette e un cacciavite in un altro dewar riempito con azoto liquido.
4. Trasferire rapidamente la casella della griglia crio contenente le griglie idratati congelati all'azoto liquido nella workstation utilizzando i grandi pinzette. Aprire la scatola della griglia crio con il cacciavite, prendere la griglia idratata congelato e inserirlo nella fessura porta-campioni.
5. Posizionare l'anello clip sulla parte superiore della griglia e premere delicatamente con la punta smussata dello strumento anello fermaglio fino a quando non si blocca in posizione. Chiudere la crio-otturatore. Rimuovere la scatola strumenti e crio griglia dalla workstation.
6. Spostare l'intera stazione di lavoro con il supporto e la griglia per la console microscopio per miniMize il tempo di trasferimento della griglia in aria ambiente.
7. Top fuori il TEM anti-contaminante con azoto liquido, precedentemente riempito e raffreddato per almeno 20 min. Pre-tilt palco microscopio a -60 °.
   NOTA: Questo minimizzare la perdita di azoto liquido come il supporto viene inserito nella camera di compensazione.
8. Iniziare il ciclo camera di compensazione pre-pompa sul microscopio. Assicurarsi che la valvola a cannone elettronico è chiuso (soprattutto se si tratta di un FEG TEM). Attendere che la sequenza di camera di decompressione pre-pompa per finire (circa 2 minuti) prima di inserire il supporto crio.
   NOTA: Questo è indicato dalla luce rossa sul palco in fase di estinzione.
9. Inserire il supporto nel compartimento stagno e ruotarlo di 90 ° in senso orario; collegare il cavo di controllo fase fredda al titolare cryo per controllare la temperatura. Attendere finché la luce rossa si spegne e ruotare sia il palco e il supporto nella posizione 0 ° per inserire il supporto nel hi del TEMcolonna sotto vuoto gh.
10. Assicurarsi che la temperatura non scende mai al di sopra -160 ° C per evitare la formazione di ghiaccio cristallino.
11. Riempire il dewar del titolare crio. Attendere 15 - 45 min fino a quando il titolare ha equilibrato termico e il vuoto TEM ha recuperato prima di registrare le immagini.
12. Se viene rilevato bubbling del azoto liquido, modificare l'altezza di riempimento azoto liquido, o toccare delicatamente l'origine spumeggiante con un batuffolo di cotone.

5. Low-dose di Data Collection

NOTA: La tecnica di raccolta dei dati a basso dosaggio è utilizzato per ridurre il danno da radiazione di elettroni al campione limitando l'esposizione a 20 elettroni / Å ^2. Questo risultato è ottenuto alternando tra tre configurazioni: "cercare", con basso ingrandimento (~ 5,000X) e ampio campo visivo, "messa a fuoco", con alto ingrandimento (~ 150,000X) e un piccolo campo di vista, e di "esposizione", con la magni finale desideratozione e contenente l'area di interesse da registrare. Blank la trave in una modalità all'altra.

1. Impostare il TEM e il programma a basso dosaggio
   1. Ritrarre la crio-otturatore e aprire le valvole di colonna.
   2. Centrare il palco e impostare l'altezza eucentrica (Z) con il wobbler alpha al rock alla fase ± 15 °. Regolare la posizione Z fino a quando non c'è movimento apprezzabile mentre lo stadio è a dondolo. Attivare il programma a basso dosaggio e selezionare il rivelatore per ciascuna modalità.
   3. Nel modo di esposizione trovare una zona della griglia che non ha di carbonio, regolare l'illuminazione selezionando l'apertura del condensatore e posto dimensione ottimale in modo che l'area da registrare è completamente illuminata. Assicurati di diffondere il fascio in direzione overcondensation.
   4. In modalità di ricerca, trovare un piccolo caratteristica che sarà facilmente identificabile a maggiore ingrandimento. Nel modo di esposizione, centrare questa funzione con il joystick (il controller XY). Inizia a basso ingrandimento, se l'impresaure non è nel campo di vista.
   5. In modalità di ricerca, portare questa caratteristica al centro del campo con la dose xy controlli bassi spostamento immagine. Vai a modo di esposizione e spostare la caratteristica lungo l'inclinazione dell'asse mediante il joystick finché è fuori della zona da registrare (0,5-3 micron). Vai modalità per mettere a fuoco e centrare la funzione utilizzando i comandi di spostamento immagine xy. Inizia ingrandimento minore se la caratteristica non è nel campo di vista.
   6. Mantenere il raggio centrata in ogni momento.
2. Raccolta dati
   1. Ritrarre la crio-otturatore e aprire le valvole di colonna. Attivare il programma a basso dosaggio.
   2. In modalità di ricerca, individuare una piazza griglia contenente sottile, ghiaccio omogenea.
   3. Selezionare un apposito foro e posizionarlo nel centro del campo. Passare alla modalità di messa a fuoco e mettere a fuoco l'immagine. Poi underfocus l'immagine tra 0,5-4,5 micron.
   4. Passa alla modalità di esposizione e registrare l'immagine.
   5. Passa alla modalità di ricerca e ripetere i passaggi 5.2.3-5.2.4.Spostare di fronte alla piazza della griglia evitando pre-esposizione buoni fori da registrare.
   6. Finire la piazza della griglia e passare a un altro buono.
   7. Regolare l'altezza (Z) e proseguire la raccolta dei dati.

Risultati

Esecuzione accurata di tutte le fasi di protocollo indicati in figura 1 consente la visualizzazione di congelati idratati, macromolecole non macchiato. Risultati sono mostrati per quattro campioni rappresentativi con diverse caratteristiche strutturali. Le loro immagini microscopiche ottenuti con i metodi di NS e cryoEM vengono confrontati (Figura 2). Immagini (i) NS di AAV5 rivelano particelle virus-simili di circa 130 Å di diametro. La coesistenza di strutture pieni e vuoti corrisponde a rotture (che consentono l'ingresso macchia) e capsidi strutturalmente intatti, rispettivamente. CryoEM mostra strutture uniformemente vuoti; anzi queste particelle virali non contengono materiale genetico ^28. NS mostra particelle rotonde predominanti mentre cryoEM mostra particelle quasi esagonali, che riflette la loro forma icosaedrica. (Ii) Le immagini dei elicoidali TMV mostrano barre di diametro 180 Å e di lunghezza variabile, spesso più di 0,1 micron, con una ripetizione elicoidale di 23 Å visibile siain NS e in cryoEM. Il canale centrale 40 Å è pieno di macchie nelle immagini NS e vuote nelle immagini cryoEM. (Iii) Native KLH, una didecamer di 8 MDA assembla in botti caratteristici di 350 Å di diametro e 400 di lunghezza Å. NS e cryoEM rivelano KLH di viste laterali rettangolari e circolari end-on vista. Entrambe le tecniche rivelano sei striature perpendicolari all'asse di simmetria e le unità morfologiche equispaziate all'interno di ciascuna fila. CryoEM rivela una struttura interna vuota. (Iv) il recettore rianodina, un grande canale intracellulare tetramerica di 2,26 MDA è visto come un quadrato di 275 x 275 Å ^2. Caratteristiche di superficie Intricato, come una croce centrale e una depressione centrale manifesta come l'accumulo di macchie da NS, e le regioni a bassa densità di cryoEM. Mentre NS mostra contrasto simile in tutti i quattro campioni testati, confronto dei pannelli cryoEM espone il SNR inferiore (contrasto) di RyR1 per la presenza di detersivo per solubilizzare la proteina di membrana.

Tipici esempi di manufatti cryoEM sono indicati per RyR1: ghiaccio cristallino, la contaminazione di ghiaccio, astigmatismo, e le strutture web-like (Figura 3). Le loro cause e prevenzione sono ulteriormente descritti nella sezione di discussione.

SPA e 3D ricostruzione di frozen-idrato RyR1 rivela la sua struttura simmetrica quadruplice, che riflette l'organizzazione homotetrameric della proteina (Figura 4A). Il dominio citoplasmatico costituisce un prisma quadrato di 275 x 275 x 120 Å ³ e contiene diversi domini globulari riproducibili che formano una struttura di ponteggio-like. Il dominio transmembrana forma un piccolo prisma di piazza affusolata con dimensioni massime 115 x 115 x 60 A ^3. Alle 10 la risoluzione Å è possibile visualizzare eliche alfa (Figura 4B). Mappatura differenza 3D può rivelare la posizione di ligandi importanti, in questo caso la differenza mappa 3D di FKBP12, un conside 12 kD proteinarosso una subunità di RyR1, si sovrappone RyR1 (Figura 4C) ^29. Infine, cambiamenti conformazionali forniscono una visione dinamica della macromolecola. In questo caso RyR1 precedentemente stabilizzato in condizioni chiuso o aperto rivela una traslocazione massa dalla chiuso allo stato aperto (Figura 4D) ^27.

Figura 1. Schema di flusso della tecnica della microscopia elettronica a cryo. Il diagramma evidenzia le principali fasi del protocollo.

Figura 2. Confronto tra NS e cryoEM per una varietà di campioni. (A) AAV5, un virus icosaedrica. (B) TMV, un virus elicoidale. Inserti mostrano la ripetizione elicoidale di 23 Å. (C) Native KLH. (D) RyR1; vista rappresentativi sono evidenziati (f, vista quattro volte e s, vista laterale). Tutti i campioni vengono esposte a condizioni dosi basse e allo stesso ingrandimento di 50,000X un sotto una tensione di accelerazione di 200 kV. Bar Scala, 10 nm. Tutti i campioni sono NS sul sostegno di carbonio, campioni cryoEM A, C, D sono in carbonio sottile sopra quantifoil, e il campione cryoEM B è direttamente sopra i fori quantifoil. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Galleria di immagini che mostrano manufatti cryoEM comuni su un campione RyR1 cryoEM. (A) Crystalline contaminazione (frecce). Ghiaccio. (B) Ice (C) astigmatismo. RyR1s nell'immagine astigmatico sono appena visibili. L'inserto a destra mostra la SPECT potererum dell'immagine con anelli Thon asimmetrici. L'inserto a sinistra mostra lo spettro di potenza di un'immagine non astigmatica per riferimento. (D) le strutture Web-like. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. CryoEM e 3D ricostruzione del recettore rianodina. . (A) rappresentazione isosurface (B) Docking di una struttura cristallina di RyR1 di N-terminale ³⁰ che mostra un buon accordo tra le coordinate atomiche e la busta cryoEM; frecce indicano due eliche alfa che sporgono dalla struttura. Arrowhead indica una delle quattro eliche che circondano il poro del canale ionico. Le linee tratteggiate indicano i confini della membrana. (C) RyR1 e 3D lozione del legante FKBP12 (colore arancione). (D) cambiamenti conformazionali di RyR1 nel corso della chiusa (arancione) all'aperto (nero mesh) conformazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

TEM seguita da SPA ha contribuito molte strutture 3D macromolecolari, avvicinandosi 2.000 voci nella EMDB metà 2014. In generale, per un dato macromolecola, una struttura 3D bassa risoluzione viene determinata dai dati NS, che può essere seguita da una a più alto Struttura risoluzione cryoEM 3D. L'elevato contrasto dei confini molecolari fornite da NS, che facilita la prima ricostruzione 3D, viene successivamente raffinato da cryoEM con la sua capacità di mappare la struttura interna della macromolecola nel suo stato completamente idratato, e la possibilità di raggiungere risoluzione molto più elevata. Un altro vantaggio del cryoEM è l'eliminazione dello stress disidratazione che potrebbe provocare il collasso della macromolecola. Inoltre, vi è la possibilità di omettere il supporto di carbonio, che elimina gli effetti di assorbimento possibile superficiali e mostra la conformazione che la macromolecola adotta in soluzione. Colorazione Cryo-negativi, una combinazione di cryoEM e NS, offre alto contrasto in un completamente hydvalutazione campione e può anche portare alla ricostruzione 3D utilizzando SPA, tuttavia è stato utilizzato meno frequentemente, con meno di 10 voci EMDB, in parte perché la macchia si può interferire con l'integrità della macromolecola ^31. Altri due tecniche TEM favorevoli alla ricostruzione 3D sono elettroni 2D cristallografia e tomografia elettronica. 2D elettroni cristallografia richiede un cristallo planare o tubolare; diffrazione elettronica del cristallo è utilizzato per la ricostruzione in 3D che potrebbe condurre alla risoluzione atomica ^32. In tomografia elettronica di campioni fissati vetrificati o tradizionalmente, un componente macromolecola o sub-cellulare è ruotato all'interno del TEM per successiva ricostruzione tomografica ^33, con il vantaggio che oggetti singolari possono essere ricostruiti; Tuttavia attualmente questa tecnica ha un limite di risoluzione che varia da 40 a 20 Å ^34,35. Tra tutte queste tecniche TEM molecolari, SPA di NS e cryoEM dati è stato il più diffusoutilizzato. Il protocollo qui illustrato è dedicato ad ottenere immagini cryoEM adatte per l'analisi SPA; tuttavia la maggior parte del protocollo è applicabile ai cryoEM di 2D cristalli e campioni tomografiche anche.

Una sessione cryoEM successo dipende dal successo combinato di molti passaggi critici; aspetti importanti da tenere a mente, spiegazione dei manufatti cryoEM comuni e come evitarli sono descritte nei paragrafi seguenti. Questa sezione descrive anche le linee guida per la raccolta dati per ottenere ricostruzioni 3D di alta qualità utilizzando il metodo SPA.

Evitare transizione cristallina del ghiaccio. Un aspetto centrale è che il campione ha bisogno di rimanere in stato vetroso dal momento del-crio precipitare tutta l'osservazione TEM. Così dopo immergendo il campione in etano liquido tutte le fasi successive vengono eseguite azoto liquido (-196 ° C) o elio liquido (-269 ° C) le temperature. Il riscaldamento sopra -135 ° C trasforma l'acqua in vitreoall'acqua cristallina; poi riarrangiamenti macromolecolari possono aver luogo e cristalli d'acqua dominano l'immagine (figura 3A); il campione deve essere eliminata. Accidental campione warm-up potrebbe accadere se crio-precipitare, il trasferimento della rete congelata tra i contenitori (anche se protetto da un gridbox), e / o inserimento titolare crio nel TEM sono troppo lenti, o se le pinzette di movimentazione non erano sufficientemente pre- raffreddato. Deterioramento vuoto significativo nella TEM su crio-trasferimento (l'aria in entrata le trappole fredde campione più caldo) può anche riscaldare il campione. Infine, over-irraggiamento del campione potrebbe anche provocare transizione cristallina ghiaccio.

Ridurre al minimo la contaminazione di ghiaccio. Dato il piccolo volume di campione (3-5 ml) applicato alla griglia TEM, evaporazione potrebbe concentrare i componenti tampone (sale, detergenti) e quindi incidere integrità macromolecolare inclusa la perdita dello stato multimerico. Un alto tasso di umidità relativa (RH) microambiente o camera circumvents questo problema. In alternativa, crio-precipitare può essere fatto in una stanza fredda ambientale sufficientemente ventilata. Dopo cryo precipitare RH dovrebbe essere la più bassa possibile per evitare contaminazioni ghiaccio o condensa dell'umidità ambientale sulla crio-griglia, come crio-griglia stessa agisce come una trappola fredda. La contaminazione Ice è composto da particelle con elevato contrasto e nessuna struttura con dimensioni che vanno tra ~ 5 nm e diversi micron che interferiscono con o addirittura totalmente bloccano l'immagine. Evitare correnti d'aria, parlando / respirando verso la crio-grid durante il trasferimento aereo, e ridurre ambiente RH. Aprire i contenitori di azoto liquido con acqua condensata (visibili come particelle sospese bianchi) dovrebbero essere scartati.

Massimizzare macromolecolari orientamenti / vista. Per il supporto del campione, una scelta da fare è tra i veri griglie bucata e carbonio sottile su griglie bucata. Questo dipende (i) come campione estende su pellicola di carbonio rispetto ai fori di carbonio, (ii) disponibili campione concentration, come fori nudi possono richiedere una concentrazione superiore al 100X supporto carbonio per una densità simile particelle sull'immagine (da ~ 0,02-2 mM), e (iii) come casuale è la distribuzione di orientamenti macromolecola. Si noti che scarica a bagliore, che rende il idrofila carbonio, avrà un effetto importante in tutti e tre gli aspetti e che questo sarà dipende dal campione. Per quanto riguarda l'orientamento della macromolecola, mentre una vista ricorrente è desiderabile per la determinazione strutturale iniziale ricostruzione conica casuale casualità di vista macromolecolari è desiderabile quando raffinazione ricostruzione 3D per risoluzioni più elevate. Nel nostro esempio, RyR1 interagisce con il carbonio con un favorito vista 'quattro volte' (Figura 2D) e richiede griglie bucata per casualità di orientamenti e di una risoluzione più alta ^36.

Massimizzare SNR. La strategia migliore per aumentare SNR è quello di ridurre le fonti di rumore di fondo. Ghiaccio eccessivospessore e (se presente) lo spessore del film di carbonio al di là di ciò che è necessario per sostenere e incorporare la proteina aggiungerà rumore extra. Così spessore del ghiaccio deve essere ridotta al minimo necessario controllando blotting tempo, pressione, umidità, e la qualità della carta filtro. Per il supporto di carbonio, un sottile (~ 5 nm) pellicola di carbonio è stratificata sulla spessa pellicola di carbonio bucata: la spessa carbonio bucata fornisce resistenza meccanica mentre il campione viene ripreso sul foro sottile di carbonio-coperto. D'altra parte, si noti che estremamente sottile ghiaccio e / o carbonio può provocare un supporto facilmente rotto che può trasformarsi in un nastro (Figura 3D). Per massimizzare SNR, i componenti tampone non necessari dovrebbero essere evitati. Per proteine ​​di membrana, il detergente prende un tributo significativo contrasto (vedere Figura 2D, pannello di destra). Inoltre, riducendo la tensione superficiale del detergente cambia il modo in cui il campione si estende sul supporto. Alcune proteine ​​di membrana richiedono la presenza di lipidi oltre che al detergent, che riduce ulteriormente il contrasto. Per superare questo campione può essere diluito in un tampone con concentrazione di detersivo inferiore e senza lipidi appena prima crio-precipitare ^37. Nuovi detergenti alternativi ¹⁶ e l'uso di nanodisks ³⁸ per stabilizzare la componente di dominio transmembrana appaiono approcci di successo per l'imaging di proteine ​​di membrana cryoEM.

Sforzatevi per immagini di alta qualità e si preparano per la correzione CTF. Provini vetrificati richiedono alti valori di sfocatura per generare un'immagine sufficienti (fase) di contrasto cui il CTF, la funzione che riguarda l'intensità di frequenza, ha diverse transizioni a zero, a quel punto non c'è informazioni. Mentre la correzione CTF non è necessario per bassa risoluzione ricostruzione 3D, quando si punta per la risoluzione più alta, per recuperare una rappresentazione accurata dell'oggetto 3D, le immagini con differenti defoci devono essere raccolti in modo che computazionale correzione CTF può essere fatto.Determinazione CTF e correzione è inclusa nei principali pacchetti software SPA ^4-7; dettagli possono essere trovati altrove ^39. Per la correzione ottimale CTF, utilizzare una serie di defoci. Una buona strategia è quella di alternare tra 3-4 valori di sfocatura. I valori dipendono dalle dimensioni della macromolecola (dimensioni maggiori richiedono meno sfocatura), lo spessore del ghiaccio / carbonio (campione diluente richiede meno sfocatura), e la tensione (tensione inferiore richiede meno sfocatura). Per 200 kV, una buona gamma di partenza di valori è 2,5, 3, 3,5 e 4 micron sfocatura. La CTF manifesta come alternando anelli di alta e bassa intensità (Thon anelli ⁴⁰⁾ nella rappresentazione spazio reciproco, lo spettro di potenza. Visualizzazione dello spettro di potenza rivelerà il potenziale di risoluzione; la frequenza della più ampia anello visibile Thon è il più vicino priori una stima della risoluzione ottenibile. Lo spettro di potenza deve essere controllato periodicamente, e astigmatici (non circolare) anelli Thon (Figura 3C) deve essere corretta con l'stigmator obiettivo. Anelli Thon devono essere visibili, almeno fino alla risoluzione desiderata.

Un set di dati cryoEM ottenuti usando questo protocollo può essere elaborato direttamente dalla SPA al fine di generare una ricostruzione in 3D. Anche con un campione ideale, la qualità della ricostruzione 3D dipenderà dalla prestazioni e specifiche degli apparecchi TEM, e sulla elaborazione delle immagini. Con i continui miglioramenti in entrambi i fronti, e con menzione speciale per i rivelatori di elettroni diretti recentemente sviluppati, la possibilità di ottenere ricostruzioni 3D a risoluzione atomica più coerente è più vicino di quanto non lo sia mai stato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Etano	Airgas	371745	una purezza del 99,99% molto importante, le impurità possono portare a contaminanti ad alto contrasto sulla rete. ATTENZIONE: infiammabile
Azoto liquido	Airgas	27135	99% purezza. ATTENZIONE: la manipolazione dell'azoto liquido in una cella frigorifera rappresenta un grave rischio di asfissia poiché l'azoto sostituisce l'ossigeno senza alcun segnale di avvertimento.
Dumont n. 5 Pinzette antimagnetiche	Ted Pella	5326
Fogli di mica, 1 x 4 cm	Ted Pella	54
Aste di grafite, preaffilate misura 1/8" diametro x 2 ¼ ” punta lunga 0,039" tipo di collo dia	Microscopia elettronica	Scienze 70220-45
350 ml crio-dewar	Pope	8600
Cu 400 griglie forate a rete  Quantifoil	Quantifoil	Q10525
Cu 400 griglie forate mesh C-Flat	Protochips	CF-1.2/1.3-4C
Dispositivo di scarica a bagliore	Microscopia elettronica	Scienze Modello E7620
Stazione di pompaggio	Turbo Gatan	Modello 655
Evaporatore in carbonio	Denton Vaccum	Modello 502B
Stantuffo di congelamento	FEI	Vitrobot Mark IV
Microscopio elettronico a trasmissione 200 kV	FEI	Tecnai F20
CCD Camera 4k x 4k	Gatan	UltraScan 4000 UHS Software di
elaborazione delle immagini CTFFIND3/CTFTILT			http://grigoriefflab.janelia.org/ctf
Software di elaborazione delle immagini EMAN			http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Software di elaborazione delle immagini Spider			http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
Software di elaborazione delle immagini Freealign			http://grigoriefflab.janelia.org/frealign
software di visualizzazione 3D Chimera			http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Native Keyhole Limpet Hemocyanin	Biosyn