Articolo metodologico

Valutazione dell'impatto di esposizione ripetuta di organotipica 3D bronchiali e nasali coltura tissutale modelli di Whole fumo di sigaretta

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DOI:

10.3791/52325

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12 febbraio 2015

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1Biological Systems Research, Philip Morris International R&D, Philip Morris Products S.A.

In questo articolo

Sommario

Lo scopo di questo protocollo è quello di esporre modelli organotipici di tessuto bronchiale e nasale 3D umano al fumo di sigaretta (CS) tradizionale all'interfaccia aria-liquido. L'impatto della CS sui tessuti viene quindi studiato utilizzando un saggio di attività del citocromo P450, una misurazione del battito delle ciglia e un approccio di biologia dei sistemi.

Abstract

Il fumo di sigaretta (CS) ha un impatto importante sulla biologia polmonare e può provocare lo sviluppo di malattie polmonari come la broncopneumopatia cronica ostruttiva o il cancro ai polmoni. Per comprendere i meccanismi alla base dello sviluppo della malattia, sarebbe importante esaminare l'impatto dell'esposizione alla CS direttamente sui tessuti polmonari. Tuttavia, questo approccio è difficile da implementare negli studi epidemiologici perché il campionamento del tessuto polmonare è complesso e invasivo. In alternativa, i modelli di coltura tissutale possono facilitare la valutazione degli impatti dell'esposizione sul tessuto polmonare. Le colture cellulari 2D sommerse, come le normali colture cellulari di epitelio bronchiale umano (NHBE), sono state tradizionalmente utilizzate per questo scopo. Tuttavia, non possono essere esposti direttamente al fumo in modo analogo alla situazione di esposizione in vivo. I modelli di coltura tissutale 3D sviluppati di recente riflettono meglio la situazione in vivo perché possono essere coltivati all'interfaccia aria-liquido (ALI). I loro lati basali sono immersi nel terreno di coltura; mentre i loro lati apicali sono esposti all'aria. Inoltre, le colture di tessuti organotipici che contengono diversi tipi di cellule, rappresentano meglio la fisiologia del tessuto in vivo. In questo lavoro, viene dimostrato l'utilizzo di un sistema di esposizione in vitro per esporre modelli di tessuto bronchiale e nasale organotipico umano alla CS tradizionale. La frequenza di battito ciliare e l'attività del citocromo P450 (CYP) 1A1/1B1 sono state misurate per valutare gli impatti funzionali del CS sui tessuti. Inoltre, per esaminare le alterazioni indotte da CS a livello molecolare, sono stati generati profili di espressione genica dai tessuti dopo l'esposizione. Un leggero aumento dell'attività del CYP1A1/1B1 è stato osservato nei tessuti esposti al CS rispetto ai tessuti esposti all'aria. Un approccio di biologia dei sistemi basato su reti e trascrittomica era sufficientemente robusto per dimostrare alterazioni del metabolismo xenobiotico indotte da CS che erano simili a quelle osservate nelle cellule epiteliali bronchiali e nasali ottenute dai fumatori.

Introduzione

I polmoni sono direttamente e costantemente esposti all'aria inalata che può contenere diverse sostanze tossiche come inquinanti e costituenti del fumo di sigaretta (CS). Lo studio dell'impatto dell'esposizione a tali sostanze tossiche sui tessuti respiratori è più informativo se fatto in un modo che assomiglia all'esposizione in vivo. Rispetto alle classiche colture cellulari immerse in 2D (ad esempio, cellule epiteliali bronchiali umane normali (NHBE)), i modelli di tessuto organotipico 3D ricapitolano meglio gli aspetti morfologici, fisiologici e molecolari dell'epitelio delle vie aeree umane in vivo1,2: i modelli di tessuto 3D contengono la diversità dei tipi di cellule osservati in vivo, comprese le cellule epiteliali differenziate, le cellule ciliate e non ciliate, le cellule caliciformi e le cellule basali. Hanno giunzioni strette funzionali e mostrano un fenotipo mucociliare 1-3. Inoltre, le colture possono essere coltivate su una membrana porosa permeabile, in un'interfaccia aria-liquido, che consente un'esposizione diretta all'aerosol sul lato apicale (mentre il lato basolaterale è immerso nel terreno di coltura) 3-5. Dvorak e colleghi hanno riferito che i profili di espressione genica dei modelli di tessuto bronchiale erano simili a quelli ottenuti dagli spazzolamenti bronchiali umani 3. Inoltre, Mathis e colleghi hanno dimostrato che le risposte di questi modelli tissutali alla CS erano simili alle differenze osservate tra le cellule epiteliali bronchiali ottenute dai fumatori e le cellule ottenute dai non fumatori 6. Infine, poiché i modelli di tessuto bronchiale potrebbero essere coltivati per un massimo di diversi mesi 4,5, potrebbero potenzialmente essere utilizzati per esaminare gli effetti dell'esposizione a lungo termine degli elementi in esame.

Le valutazioni di citotossicità sono parametri comuni misurati a seguito di insulti chimici o per valutare la tossicità di specifici composti o miscele. Ad esempio, l'integrità della membrana può essere misurata mediante un saggio luminescente e consente di misurare un effetto citotossico dose-dipendente sulla coltura cellulare 7. Tuttavia, per valutare gli effetti fisiopatologici dei composti a concentrazioni subtossiche, dovrebbero essere misurati altri parametri. Ad esempio, l'integrità tissutale determinata utilizzando il test di resistenza elettrica transepiteliale (TEER) garantisce la funzionalità delle giunzioni strette e monitora la rottura dello strato epiteliale 8,9. La frequenza del battito ciliare consente anche la misurazione degli effetti correlati alla CS sui tessuti respiratori. Una frequenza di battito normale per il rivestimento delle ciglia che confina con le vie respiratorie superiori e inferiori è importante per proteggersi dalle infezioni delle vie aeree 10. Ciascuna delle cellule epiteliali colonnari ciliate dell'epitelio respiratorio ha 200-300 ciglia che battono ad una particolare frequenza per eliminare gli agenti infettivi o il particolato inalato intrappolato nel muco rilasciato dalle cellule caliciformi intervallate 11. Il CS contiene sostanze chimiche che possono inibire il battito ciliare 12, portando a una ridotta protezione delle vie respiratorie. Questo lavoro mostra che il battito ciliare può essere misurato in modelli di tessuto organotipico. Questo approccio consente di valutare se le cellule epiteliali mostrano la loro normale funzione nella coltura tissutale organotipica. La CS attiva anche le risposte del metabolismo degli xenobiotici nel tratto respiratorio per metabolizzare i costituenti del fumo di tabacco 13. È possibile misurare l'attività degli enzimi di fase I per il metabolismo degli xenobiotici, CYP1A1 e CYP1B1, dei modelli tissutali. Inoltre, come precedentemente riportato, l'espressione genica globale può essere misurata nei modelli organotipici di tessuto bronchiale 6,14,15. Per valutare l'impatto della CS sul metabolismo degli xenobiotici 15, viene sfruttato un approccio di biologia dei sistemi basati su reti e dati trascrittomici.

Le metodologie utilizzate per esporre modelli organotipici di tessuto bronchiale e nasale 3D al CS tradizionale utilizzando un sistema di esposizione in vitro e per misurare le risposte tissutali a questa esposizione rispetto all'esposizione all'aria fresca (controllo) sono descritte qui.

Protocollo

1. Cultura della organotipica tessuto bronchiale Cultura Modello

Nota: i modelli di tessuto ricostituite sono stati acquistati come inserti che sono pronti per l'uso. In alternativa, la coltura può essere sviluppata da cellule primarie come descritto ad esempio da Karp e colleghi 16. Dopo aver ricevuto i tessuti in confezione sterile, sempre gestire i tessuti organotipica umani in condizioni sterili.

  1. Aggiungere 0,7 ml di pre-riscaldato (37 ° C) terreno di coltura a ciascun pozzetto di una nuova sterile 24-pozzetti sotto il cofano.
  2. Rimuovere l'imballaggio dei tessuti sotto il cofano, e trasferire gli inserti di coltura tissutale alla nuova piastra 24 pozzetti preparata (descritto nel passaggio 1.1. Sopra).
  3. Mantenere e coltura dei tessuti in un incubatore a 37 ° C (5% CO 2, 90% di umidità).
  4. Sostituire il mezzo ogni 2 giorni.
  5. Durante un cambio medio, esaminare i tessuti sotto un microscopio ottico per assicurare che essi siano contamination-free e che non vi siano perdite di media.

2. fumo di sigaretta (CS) di esposizione utilizzando un sistema in vitro di esposizione

  1. Tre giorni prima di esperimenti di esposizione, lavare la parte apicale della cultura del tessuto con 200 ml di terreno di coltura.
  2. Il giorno di esposizione, se la misura del battito ciliare è previsto prima di esporsi, di gestire i tessuti per la misurazione battito ciliare come descritto nel paragrafo 3.
  3. Pre-riscaldare la camera climatica del sistema di esposizione in vitro e il modulo base di coltivazione a 37 ° C. Riempire il modulo base di coltivazione con 17,5 ml di terreno per riga.
  4. Rimuovere i tessuti dal termostato e metterli sotto il cofano di trasferire gli inserti coltura di tessuti dalla piastra di coltura per il modulo base coltivazione della vitro sistema di esposizione a. Inoltre, coprire il modulo base coltivazione con un coperchio di vetro.
  5. Trasferire i tessuti nella camera climatica del vitro dell'esposizione syste inm per l'esposizione di integrare CS.
  6. Se il sistema di esposizione in vitro è dotato di una microbilancia, set-up il cristallo microbilancia al quarzo prima di eseguire l'esposizione per misurare la deposizione di particelle in tempo reale del fumo su un cristallo di quarzo utilizzando il software microbilancia.
    1. Sostituire i cristalli nei moduli microbilancia collegati a ciascuna riga del sistema di diluizione / distribuzione.
    2. Collegare il modulo microbilancia al software microbilancia. Impostare la scala della misura a zero nel software.
  7. Esporre i tessuti secondo la procedura sperimentale (ad esempio come in figura 1.,)
    Nota: l'esposizione Prior, sigarette di riferimento (3R4F) sono condizionati tra 7 e 21 giorni in condizioni controllate a 22 ± 1 ° C e umidità relativa del 60 ± 3% secondo la norma ISO 3402 17.
    1. Genera fumo di sigaretta (ad es., Da 3R4F sigarette) con un 30-port carosello fumare machine secondo il regime Intense Health Canada: fumo le sigarette ad una lunghezza di testa di serie, vale a dire, circa 35 mm a 55 ml soffio oltre 2 secondi, due volte al minuto e 8 secondi il tempo di scarico della pompa.
      Nota: Se necessario, diluire la corrente principale CS in modo che la dose non è troppo tossici. In risultati qui riportati, fumo è stato diluito al 16% (vol / vol).
    2. Usa il 60% di aria umidificata per i campioni di controllo (aria-esposti).
    3. Esporre i tessuti per 6-7 min (es., 1 sigaretta o ad aria a vista) nel sistema di esposizione in vitro
    4. Mettere i tessuti in incubatrice a 37 ° C (5% CO 2, 90% di umidità) per 1 ora.
    5. Ripetere i punti 2.7.3 e 2.7.4 di tre volte di più.
  8. Alla fine dell'esperimento dell'esposizione, fermare il software microbilancia. Il software genera un file contenente tutte le misurazioni con una rappresentazione grafica della deposizione di particelle.
  9. Rientro i tessuti dalla coltivazione bModulo ase alla piastra di coltura. Posizionare i tessuti in incubatrice a 37 ° C (5% CO 2, 90% di umidità) finché le misurazioni per i diversi endpoint alle specifiche post-esposizione punti temporali.

3. Misurazione del battito ciliare

Nota: Come da piano sperimentale (Figura 1), record di ciliare battendo prima l'esposizione e subito dopo l'esposizione.

  1. Rimuovere le piastre di coltura di tessuto dal termostato e lasciarli sotto il cofano a temperatura ambiente per 30 minuti per stabilizzare il battito di ciglia.
  2. Mettere i tessuti al microscopio ottico collegato al Software CiliaMetrix.
  3. Registrare il filmato e la frequenza (in Hertz) del pestaggio ciliare. Misurare la frequenza ogni 3 secondi per 1 minuto.
  4. Riportare i tessuti al termostato a 37 ° C (5% di CO 2, il 90% di umidità).

4. Transepithelial Resistenza elettrica (TEER) Misura

Nota: La misurazione della TEER viene effettuata 3 giorni prima e 48 ore dopo l'esposizione sotto il cofano in condizioni sterili utilizzando bacchette Elettrodo (STX-2) collegato ad un voltohmmeter.

  1. Aggiungere 200 ml di coltura alla superficie apicale dei tessuti bronchiali umani.
  2. Accendere la macchina EVOMX; lavare l'elettrodo con una soluzione di etanolo al 70%.
  3. Lavare l'elettrodo con il terreno di coltura.
  4. Misurare la resistenza (Ω) inserendo l'elettrodo nel supporto sul lato apicale della coltura tissutale senza toccare il tessuto.
  5. Ripetere il passaggio 4.4 cinque volte per ottenere misurazioni quintuplicato.
  6. Dopo le misurazioni, rimuovere delicatamente il mezzo dal lato apicale delle colture di tessuto utilizzando un aspiratore.
  7. Riportare le colture di tessuti per l'incubatore a a 37 ° C (5% di CO 2, il 90% di umidità), per la coltura.

5. citocromo P450 (CYP) 1A1 / 1B1 Activity

  1. Prima dell'inizio dello studio, preparare il reagente di rilevamento luciferina trasferendo l'intero contenuto del flacone del buffer ricostituzione appropriata alla bottiglia ambrata contenente il reagente di rilevamento luciferina (secondo le istruzioni del produttore). Conservare aliquote di 2 ml a -20 ° C per un massimo di 1 mese.
  2. Per la 48 ore di tempo post-esposizione, incubare i tessuti per 48 ore a seguito di esposizione CS a 37 ° C.
  3. Riscaldare il reagente di rilevamento Luciferin a RT.
  4. Incubare inserti tessuto per 3 ore o O / N con il substrato Luciferin-CEE (diluito alle 1:50) nel terreno di coltura.
  5. Trasferire 50 ml del terreno di coltura di ogni tessuto inserire una piastra luminometro bianca 96 pozzetti opachi a RT.
  6. Aggiungere 50 ml di reagente di rilevamento luciferina ad ogni pozzetto per iniziare una reazione luminescente.
  7. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 20 min.
  8. Leggi la luminescenza con un luminometro.
    Nota: Per laluminometro, utilizzare un tempo di integrazione di 0,25-1 sec per pozzetto come linea guida.

6. RNA Estrazione.

  1. Prima di raccogliere inserti tessuto organotipiche 3D, preparare 1) una scatola con ghiaccio secco, 2) quantità sufficiente di lame (uno per inserto 3D), 3) PBS freddo senza cloruro di calcio e magnesio cloruro, 4) uno 25 ml di vetro pipetta, e 5 ) aghi di vetro sterili per aspirazione.
    1. Etichettare le provette piene di sfere di ceramica per omogeneizzare campioni di cellule solidi e aggiungere 700 ml di Qiazol.
    2. Accendere la macchina aspirazione.
    3. Raccogliere la piastra degli inserti di tessuto organotipiche 3D l'incubatrice.
    4. Lavare ogni inserto sulla piastra 3 volte con PBS freddo. Tra i lavaggi, aspirare PBS con l'ago di vetro. Dopo il terzo lavaggio, aspirare con PBS e piastra di copertura per impedire l'essiccazione dell'inserto.
    5. Per ogni inserto dalla piastra, tagliare la membrana inserto (su cui risiede inserto tessuto 3D) fino alla membrane adagiata giù sulla lama.
    6. Trasferire il tessuto (insieme con la membrana inserto) dalla lama al tubo omogeneizzazione anticoagulante e avvitare il coperchio sul tubo, si agita e si vortex.
    7. Congelare il campione in ghiaccio secco e conservare a -80 ° C o continuare a l'estratto l'RNA.
      Nota: Prima della estrazione di RNA, etichettare tutti i tubi e le colonne secondo il disegno randomizzazione (se applicabile). Preparare tutti i reagenti in base alle raccomandazioni del produttore ed estrarre campioni da -80 ° C freezer e scongelare il ghiaccio fino a quando non sono completamente scongelati.
  2. Omogeneizzazione
    1. Campioni Grind con omogeneizzazione strumento 6000 Hz per 45 sec. Ripetere se i campioni non sono correttamente omogeneizzato e lasciano campioni per 5 min a RT.
    2. Aggiungere 140 microlitri di cloroformio al campione e vortex per 10-15 sec.
    3. Trasferire il surnatante dal tubo di omogeneizzazione ad un tubo di bloccaggio di fase e agitare su unatermostatico per 2 min a 1400 rpm e RT.
    4. Ulteriori incubare campioni per 2 minuti a temperatura ambiente e centrifugare i campioni a 12.000 xg per 15 minuti a 4 ° C.
  3. RNA precipitazione, lavata, la sospensione e la purificazione in QIAcube.
    1. Trasferire la fase acquosa superiore in una nuova provetta 2 ml.
    2. Caricare tutti i reagenti necessari al robot di estrazione secondo il foglio di protocollo del produttore, selezionare il protocollo appropriato, impostare il volume di eluizione (30 ml) ed eseguire il robot di estrazione.
    3. Quando la corsa, rimuovere gli adattatori del rotore e mantenere immediatamente provette di eluizione a 4 ° C per ulteriori analisi oa -80 ° C per una conservazione a lungo termine.
  4. Controllo di qualità del RNA isolato
    1. Determinare la quantità di RNA isolato utilizzando un lettore UV secondo le istruzioni del produttore.
    2. Controllare la qualità del RNA e l'integrità dell'RNA utilizzando microfluidica-gel a base lab-on-a-chip e un lettore di UV, according alle istruzioni del produttore.

7. Microarray Workflow

Nota: Il processo descritto qui di seguito si concentra sul metodo di Kit Affymetrix GeneChip alta velocità 3'IVT espresso, che viene utilizzato per la sintesi di destinazione per l'ibridazione sulle cartucce di espressione genica Affymetrix 3 'a partire dalla preparazione del RNA all'utilizzo del complesso Sistema di gestione dei liquidi (ad es., pipettaggio, diluendo, erogazione, o l'integrazione).

  1. Preparazione
    1. Randomize campioni per evitare effetti batch. Il numero di campioni trattati da lotti è 1-96, tra cui uno positivo (Commercial umano RNA universale di riferimento) e uno negativo (RNase acqua gratuita) di controllo per partita.
    2. Avviare la sintesi di destinazione utilizzando 100 ng di RNA totale in 3 ml di acqua RNAse-free. Per 100 ng di RNA totale, utilizzare un tempo di incubazione 16 h.
  2. RNA Amplification
    1. Preparare la POly-A RNA picco-in soluzione di controllo da una diluizione seriale del Poly-A RNA Archivio con Poly-A Buffer Controllo diluizione:
      1. Per la diluizione 1, preparare 2 ml di controllo polyA magazzino in 36 microlitri tampone di diluizione.
      2. Per la diluizione 2, preparare 2 ml di diluizione 1 in 98 ml di tampone di diluizione.
      3. Per la diluizione 3, preparare 4 ml di diluizione 2 in 196 ml di tampone di diluizione.
      4. Per diluizione 4, preparare 20 ml di diluizione 3 in 180 ml di tampone di diluizione.
    2. Diluire il RNA in RNAse acqua libera per ottenere una concentrazione di 33,3 ng / ml.
    3. Aggiungere 2 ml di soluzione di controllo polyA ai 3 microlitri di campione di RNA totale direttamente in una piastra da 96 pozzetti. Questa operazione viene eseguita dal sistema di gestione dei liquidi.
    4. Preparare il sistema di gestione dei liquidi e la sintesi di destinazione. Posizionare le piastre sul robot. Mettere tutti i reagenti necessari e da laboratorio sul ponte. Il robot si avvia la procedura per preparare la appropriate mastermixes e incubare i campioni nel blocco PCR telecomandato automatizzato.
    5. Prima Controllo Qualità Controllo: il controllo del processo di amplificazione
      1. Se la qualità di aRNA è accettabile, eseguire il punto frammentazione aggiungendo ad ogni campione 8 ml di tampone di frammentazione 5X (Questa operazione viene eseguita dal sistema di gestione dei liquidi). Altrimenti, eseguire il passaggio precedente sempre a partire dall'RNA. Utilizzare frammentato ARNA immediatamente o conservare diluito e frammentato ARNA a -20 ° C (-70 ° C o per una conservazione a lungo termine).
      2. Eseguire una seconda analisi Controllo Qualità sollevando casuale 12 campioni nella piastra e trasferimento 1 microlitri sul sistema a base di gel microfluidica per verificare l'efficienza della frammentazione.
  3. Procedura Ibridazione
    1. Scansione i codici a barre di chip e registrare ogni campione nel software del produttore secondo le istruzioni.
    2. Preparare il mix di ibridazione comesegue per una singola reazione e aggiungerlo a 33 ml di frammentazione ed etichettati ARNA: 4.2 ml di controllo oligonucleotide B2 (3 Nm), 12,5 microlitri di 20x controlli di ibridazione eucariotiche, 25 microlitri di 100% DMSO, 125 ml di tampone 2x ibridazione e 50 ml di H 2 O per un volume finale di 216,7 microlitri
      Nota: Ibridare, lavare e la scansione controlli positivi e negativi prima di elaborare i campioni.
    3. Pre-bagnare l'array con 200 ml di mix pre-ibridazione contenuti nel kit di ibridazione Lavare e Stain.
    4. Posizionare il chip nel forno di ibridazione impostata a 45 ° C e 60 rpm per 10 min.
    5. Nel frattempo, denaturare la piastra (contenente il cocktail mix ibridazione finale) in un blocco PCR a 99 ° C per 5 min e 45 ° C per 5 min.
    6. Rimuovere la miscela pre-ibridazione dalla matrice e sostituirlo con 200 microlitri della destinazione ibridazione cocktail (un campione per chip).
    7. Posizionare la matrice nella hybridization forno impostato a 45 ° C per 16 ore (O / N) con una velocità di rotazione di 60 rpm.
  4. Lavaggio e colorazione
    1. Eseguire "Fluidics" dalla barra dei menu del software. Nella finestra di dialogo Fluidics, selezionare il modulo di interesse (1 - 4), quindi selezionare il programma Prime_450 a tutti i moduli. Posizionare il tubo di tampone di lavaggio A in un flacone (400 ml) e per il tampone di lavaggio B in una bottiglia (200 ml), nonché per acqua MilliQ in un flacone (500 ml).
    2. Successivamente, seguire le istruzioni visualizzate sul display. Sollevare gli aghi e mettere 600 ml macchia cocktail 1 (SAPE Solution Mix) e 600 ml macchia cocktail 2 (Soluzione Anticorpi Mix) contenente microprovette in posizioni # 1 e # 2, e 900 Array microlitri Tenendo soluzione tampone alla posizione # 3.
    3. Dopo l'O / N incubazione nel forno, aspirare il cocktail dal chip e riempire il microarray con 250 microlitri tampone di lavaggio A. Assegnare il chip diritto di ogni modulo, selezionare il protocollo FS450-001 ed eseguire ogni moDule, seguendo le istruzioni sullo schermo. Questo processo dura 90 min.
    4. Una volta che lo schermo LCD indica il messaggio "Cartuccia Eject", rimuovere il chip e verificare se ci sono delle bolle. Se le bolle sono presenti, riempire la matrice interamente con il buffer Array possesso. Applicare adesivi sul setti per evitare eventuali perdite nello scanner e pulire la finestra microarray prima di caricare nello scanner.
  5. Scanning.
    1. Scaldare lo scanner. Caricare il chip nel caricatore automatico dello scanner e avviare la scansione.
      Nota: Dopo ~ 12 min per chip, viene generato un file .CEL per chip.
    2. Controllare l'immagine e allineare la griglia (se necessario) al posto di identificare le cellule sonda.
      Nota: Il set di dati è stata presentata al ArrayExpress (codice adesione = E-MTAB-1721).

8. sistemi network-based di Biologia di analisi per una valutazione d'impatto

  1. Elaborazione dei dati microarray.
    Nota: informatica unmetodi di punteggio d sono stati implementati utilizzando la versione dell'ambiente statistico R 2.14.
    1. Aprire una sessione R 18 e caricare i Affy 19, gcrma, e pacchetti affyPLM installati eseguendo i comandi: biblioteca (Affy)> library (gcrma)> biblioteca (affyPLM)
    2. Leggi i file di dati grezzi in esecuzione il comando: data.affybatch <-ReadAffy ("percorso della cartella in cui sono memorizzati i file CEL")
    3. Sottrarre la correzione del fondo e normale quantile per generare valori di espressione impostati sonda con il pacchetto gcrma, eseguendo il comando: eset.norm <-gcrma (data.affybatch)
  2. Il controllo di qualità.
    1. Generare trame degradazione dell'RNA con il comando: deg <-AffyRNAdeg (data.affybatch)
    2. Estrarre il coefficiente della pendenza degradazione dell'RNA eseguendo il comando: slope = deg $ slope
    3. Tracciare il coefficiente di pendenza e di individuare possibili valori anomali.
    4. Generare nUsa e RLE trame eseguendo i seguenti comandi: Pset <-fitPLM (data.affybatch)> RLE (Pset)> nUsa (Pset).
    5. Identificare se alcuni dei grafici a scatole generati sono valori anomali: un array è considerato anomalo se almeno 2 dei 3 metriche QC definite sotto deviare dalle altre matrici:
      - Deg $ pendenza è diversa dalla deg $ pendenza media
      - NUsa trama: un array è considerato outlier se quartile superiore scende sotto 0.95 o quartile inferiore sopra 1,05, vale a dire, se il boxplot è del tutto al di sopra 1,05 o del tutto sotto 0.95..
      - RLE trama: un array è considerato outlier se la mediana della distribuzione RLE è superiore a 0,1 o minore di -0.1.
    6. Se un array è identificato come un valore erratico, poi scarta, e ricominciare dal punto 8.1.2.
    7. Montare un modello lineare globale ai dati per i contrasti di interesse specifici (es., I confronti di "trattati" e le condizioni di "controllo") che genera valori di P prime per ciascuna sonda impostato sul microarray, che può essere furtla sua adeguata in base alla procedura di Benjamini-Hochberg del pacchetto limma. Selezionare un probeset per gene per mantenere in qualità di rappresentante del gene per ulteriori analisi, come descritto in 20.
      Nota: un fattore di bloccaggio (piastra esposizione) dal disegno esperimento è stato rappresentato nel modello per l'elaborazione dei dati.
  3. Analisi basata su rete.
    Nota: Il metodo implementato come qui è descritto in dettaglio in Martin et al. (In revisione in bioinformatica BMC).
    1. Per ogni confronto a coppie di interesse, avviare dal computerizzata (log2-) piega modifiche (trattamento vs. controllo) per ogni gene nell'ambito della rete (dal punto 8.2).
    2. Calcolare il sottoscritto L matrice Laplacian della rete definito da L (i, j) = - segno (i ~ j) w (i, j) se vi è un bordo di peso w (i, j) tra il nodo i e j, L (i, j) = deg (i) è il grado pesata di i e L (i, j) = 0 altrimenti. Il peso w (i, j) è pari a 1 se i e j sono nel backbone e w (i, j) = 1 / n se i è un nodo backbone j ed è uno dei suoi n neighbors nello strato trascrizione.
    3. Calcola punteggi per la spina dorsale da f = L3-1L2Tx dove L3 è il sub-matrice L per i nodi di backbone e L2 è il sub-matrice L cui righe corrispondono ai nodi di livello trascrizionale e colonna ai nodi di backbone
    4. Calcolare il sottoscritto Laplaciano, Q, della rete definita dalla rete backbone in cui sono invertiti tutti i segni di bordo.
    5. Calcolare il punteggio NPA da NPA = fTQf.
    6. Calcola l'intervallo di confidenza, la permutazione bordo p-value spina dorsale e lo strato di permutazione p-value trascrizione.
      Nota: (es., La variazione biologica tra i campioni in un gruppo sperimentale) Oltre agli intervalli di confidenza dei punteggi NPA, che rappresentano l'errore sperimentale, statistiche compagno sono stati ottenuti per descrivere la specificità del punteggio NPA alla biologia descritta nella rete. Perché NPA è una forma quadratica dei cambiamenti piega, la sua varianza può essere calcolata basata sul pieghevole variazione stimata variances. Un intervallo di confidenza viene successivamente ottenuto utilizzando il teorema del limite centrale. Due test di permutazione sono stati attuati 21 in base al quale in primo luogo, valuta se i risultati erano specifici per la relativa documentazione (es., Gene piega-cambiamenti) nel modello, che porta a un P-valore permutazione (indicato con * O nelle figure quando P -value <0.05). In secondo luogo, per valutare se il livello "causa-effetto" della rete significativamente contribuito alla ampiezza della perturbazione rete (indicato con K * nelle figure quando P-value <0.05).
    7. Considerare la rete come risentito del trattamento se l'intervallo di confidenza non contiene zero e il due di permutazione valori p <0,05.
    8. Calcolare i nodi principali che sono definiti come i nodi fondamentali del backbone contribuire fino al 80% del punteggio NPA.

Risultati

Nei risultati di seguito descritti, i tessuti organotipica erano cellule primarie umane epiteliali isolati da sani, non fumatori, i donatori caucasici e sono state ricostituite usando fibroblasti 15.

Bronchiale 3D e modelli di tessuto nasale
In bronchiale vitro e modelli organotipica nasali assomigliare a livello cellulare epitelio respiratorio umano (Figura 2).

L'esposizione CS
Bronchiale Organotipica e modelli tessuti nasali possono essere ripetutamente esposti ad integrare CS all'interfaccia aria-liquido. La procedura sperimentale esposizione al fumo utilizzato per i risultati qui illustrati sono illustrati nella figura 1.

Registrazione del battito ciliare
Cilia pestaggio è stato registrato nei tessuti esposti ad aria come illustrato nel video. L'esposizione CS è stata associata con una riduzione della frequenza ciliare pestaggio: il picco più forte osservata intorno4 Hz nel sham esposti e prima esposizione non si osserva più dopo l'esposizione CS (Figura 3). Questa frequenza ridotta renderebbe le ciglia battendo meno efficiente per rimuovere muco e agenti infettivi 22.

Misura di TEER e CYP1A1 / attività 1B1
TEER è stata misurata 48 ore dopo l'ultima esposizione per assicurare il tessuto è ancora funzionante. CYP1A1 / 1B1 attività è stata anche misurata 48 ore dopo la fine dell'esposizione come illustrato in figura 1. I valori TEER nei tessuti CS-esposti non erano significativamente differenti rispetto ai tessuti-aria esposto conferma che non vi è alcun grave effetto citotossico di fumo a questa concentrazione. Al 48 h post-esposizione, CYP1A1 / 1B1 attività dei tessuti era leggermente aumentato, indicando un modesto aumento di tessuto meccanismo di difesa dopo l'esposizione (Figura 4).

Profili di espressione genica e sistemi basati sulla rete biapproccio ology per studiare l'impatto dell'esposizione CS sulla alterazione del metabolismo xenobiotici
I tessuti sono stati raccolti in 48 h post-esposizione punti di tempo. Successivamente, l'analisi microarray è stata condotta per generare profili di espressione genica del CS e tessuti-aria esposti. Impatto dell'esposizione CS sul metabolismo xenobiotico è stato studiato con un approccio di biologia dei sistemi network-based sfruttato dai profili di espressione genica e, come riferito in precedenza 15. Usando un approccio di biologia dei sistemi basati sulla rete mostra che CS impatti esposizione a livello dei nodi di backbone nel modello di rete Metabolism Xenobiotic erano ben correlati fra in vitro e in vivo set di dati (Figura 5). Al contrario, a livello di ogni singolo cambiamenti di espressione genica, correlazioni poveri sono stati osservati tra in vitro (CS-esposto vs. aria esposto) e in vivo (fumatori vs fumatori).

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Figura 1. Procedura schematica della esposizione ripetuta di CS ai modelli di tessuto bronchiale organotipica Abbreviazioni:. CYP, del citocromo P450; CS, fumo di sigaretta; TEER, transepiteliale resistenza elettrica.

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Figura 2. Organotipica bronchiali e nasali modelli di coltura di tessuti epiteliali. Fumetto illustra bronchiali (A) e nasale (B) dell'inserto coltura tissutale all'interfaccia aria-liquido. I modelli in vitro contenevano cellule ciliate mostrati nello strato apicale delle cellule colorate ematossilina e eosina (C per bronchiale, D per nasale) come riportato in precedenza 15. I modelli sono stati co-coltura con fibroblasti che sono importanti per la crescita e la differenziazione delle cellule epiteliali (indicato dalle frecce). La colorazione dei marcatori lignaggio delle vie aeree: p63 (E per bronchiale, F per nasale) e MUC5AC (G per bronchiale, H per nasale) sono indicati come riportato in precedenza 15. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. Cilia Vincere Frequency. Cilia frequenza battito (CBF) è stata misurata in aria a vista e nella cultura, prima e dopo l'esposizione. Diminuzione CBF è stato visto dopo l'esposizione CS (risultati rappresentativi di due inserti sono mostrati come replicare 1 (R1) e replicano 2 (R2)).

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Figura 4. Misura del CYP1A1 / attività CYP1B1 e TEER. Pannelli sinistra indicano l'attività di CYP1A1 / CYP1B1 nel bronchiale (A) e nasale (B) modelli di tessuto. Pannelli destra indicano la misura TEER nella bronchiale (C) e nasale (D) modelli di tessuto. Sono mostrati mezzi ± SD. Abbreviazioni: CS, fumo di sigaretta; CYP, citocromo P450; TEER, transepiteliale resistenza elettrica; RLU, unità luminescense relativa.

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Figura 5. sistemi basati Network approccio biologico per la valutazione di impatto dell'esposizione CS nel contesto del metabolismo xenobiotico. I cambiamenti dei livelli di espressione genica sono stati usati per calcolare l'attivazione del nodo di backbone del modello di rete Xenobiotic metabolismo (A) strong> come riportato in una pubblicazione precedente 15. La figura a destra illustra il concetto di quantificazione dei nodi di backbone, noto anche come "valore backbone di rete differenziale," utilizzando l'approccio NPA. I ovali blu rappresentano l'attività dei nodi di backbone (ie., Lo strato funzionale) e le sfere verdi rappresentano l'espressione di geni (ie., Lo strato trascrizionale). Impatti di esposizione CS nei tessuti bronchiali organotipiche (in vitro, CS-esposto contro-air esposto) alla 48 ore di post-esposizione sono stati confrontati con quelli di fumo sulla epiteliali bronchiali umane raccolte da broncoscopia e nasale epiteliale dal burshing turbinati inferiori (GSE16008 ) (in vivo, i fumatori vs fumatori) (B). Inserti, correlazione della espressione genica cambia tra la in vitro e in vivo dataset. Abbreviazioni: CS, fumo di sigaretta; NPA, perturbazione di ampiezza di rete.ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Qui, abbiamo dimostrato l'applicabilità bronchiale organotipica umana e modelli tessuti nasali per valutare l'impatto di esposizione ripetuta CS. In alternativa alla sperimentazione animale, un certo numero di sistemi di esposizione sono stati sviluppati per le valutazioni tossicologiche dell'esposizione aerosol in vitro (ad es., Vitrocell, Cultex, ALICE, etc.). Questi moduli di esposizione possono anche essere utilizzati per una valutazione tossicologica di inquinanti nell'aria, particelle sospese nell'aria, nanoparticelle, ecc In questo studio, abbiamo utilizzato il sistema Vitrocell che può ospitare fino a 48 campioni diversi contemporaneamente, consentendo sperimentazioni su scala più ampia e bassa variabilità tra i trattamenti. Per ogni esposizione aerosol in vitro, il rischio di contaminazione coltura tissutale rimane un rischio maggiore il cui mitigazione richiede un accurato trattamento delle colture di tessuto durante gli esperimenti.

Misurazione deposito di particelle in tempo reale sul microbilancia durante la eesperimento Xposure permette di monitorare che le dosi CS generati dal sistema di esposizione sono conformi alle aspettative. Per garantire la precisione della deposizione di particelle misurata, messa a punto la misura in linea correttamente prima dell'esposizione è critial, ad esempio, la creazione di scala a 0. Inoltre, a causa della differenza tra le aree del microbilancia (cm 2) e la inserto coltura tissutale (0,33 cm 2), abbiamo regolato il calcolo finale alla zona dell'inserto coltura: solo il 33% della deposizione sul microbilancia riflette la deposizione effettiva nell'inserto cultura.

Misurazione di TEER accertare funzionalità barriera a tenuta giunzione e per valutare interruzione dello strato epiteliale è una procedura relativamente facile da implementare, che abbiamo riportato qui. Tuttavia, poiché i modelli di tessuto bronchiali e nasali contengono cellule calice intervallati producono muco, lavaggio apicale deve essere eseguita prima delle meas Teermi-. Il lavaggio apicale è critica perché la presenza dello strato di muco e la variabilità del suo spessore può influenzare la misura della TEER, interferire con l'impatto dell'esposizione CS. Questa nozione è in accordo con quanto riportato da Hilgendorf e colleghi, in cui la permeabilità delle cellule Caco-2 è stata influenzata dalla co-coltura con la linea cellulare calice-muco produzione HT29 23. Il muco ha bisogno di essere lavato via prima della misurazione TEER, perché il lavaggio apicale destra prima dell'esposizione può interferire con le risposte del tessuto a CS. Pertanto, la misura viene eseguita tre giorni prima dell'esposizione, e non appena prima dell'esposizione.

Abbiamo dimostrato che l'attività CYP1A1 / CYP1B1 potrebbe essere misurata dai modelli culturali organotipica a seguito di esposizione CS, anche se l'attività è stata solo modesta aumentato del CS. Questo segnale debole può essere amplificato da una incubazione più lungo del substrato CYP1A1 / 1B1 (es., Luciferina-CEE), ad esempio per24 hr (dati non mostrati). Uno dei limiti della misurazione dell'attività CYP nel presente lavoro è l'assenza di normalizzazione al livello proteico CYP o per il conteggio delle cellule, che potrebbe essere preso in considerazione per studi futuri per garantire che l'alterazione sull'attività enzimatica non è influenzata dall'alterazione sia del livello di proteina o la conta delle cellule.

Abbiamo segnalato che l'esposizione CS inibito l'ciliare battendo sia nel nasale e modelli di tessuto bronchiale. Osservazioni analoghe sono state fatte in diversi modelli di mammiferi e non mammiferi 12. Per ciliare battendo misurazione, assicurando che i tessuti sono trattati e trattati in modo analogo è critica, per esempio se è implementata medio cambiamento, dovrebbe essere applicata per tutti i campioni. Sutto e colleghi hanno riferito che il pH colpito il ciliare mammiferi battendo frequenza 24. Così, quando si confrontano battendo frequenze tra cellule trattate con diverse compunds / miscele, pHregolazione dovrebbe essere considerata per minimizzare la variabilità della misurazione battito ciliare. Inoltre, la temperatura alla quale la misura viene condotta è anche critica come la frequenza del battito ciliare scende al diminuire della temperatura. Per ridurre al minimo la variabilità a causa di questi cambiamenti, un incubatore fase-top, attrezzate con la temperatura, CO 2, e il controllo dell'umidità è stato utilizzato in questo studio. Nonostante questo, abbiamo osservato che il ciliare battendo frequenze nei tessuti bronchiali dopo l'esposizione CS erano molto variabile (es., Di aumentare in un inserto e diminuire nell'altro inserto), suggerendo che il battito ciliare è giusto altamente disturbato dopo l'esposizione. Al contrario, abbiamo osservato l'assenza di frequenze misurabili battito ciliare nel tessuto nasale dopo esposizione CS, suggerendo che la risposta del tessuto nasale è più sensibile e coerente. Ciò è in accordo con una precedente pubblicazione dimostrano che il tessuto nasale ha una capacità inferiore a disintossicarsi comerispetto bronco 25.

Infine, abbiamo dimostrato che l'espressione del gene profiling dal bronchiale organotipica e modelli tessuti nasali esposto al CS potrebbe dimostrare un impatto di CS sul metabolismo xenobiotico. È interessante notare che l'alterazione osservata nel metabolismo xenobiotico nel bronchiale organotipica nasale modelli in vitro esposto a CS assomigliano che la situazione in vivo nei fumatori come discusso in maggior dettaglio in una pubblicazione precedente 15. Per le analisi di espressione genica, utilizzando lo strumento robotico rende possibile l'analisi ad alta produttività. Inoltre, la manipolazione robotizzata automatica aumenta ulteriormente la coerenza e la precisione dei risultati di espressione genica. Tuttavia, veloce raccolta dei campioni di tessuto è stato fondamentale per evitare la degradazione dell'RNA durante l'estrazione di RNA. Il trattamento RNA e approcci trascrittomiche qui descritte possono anche essere applicati a campioni di tessuto in vivo.

Dichiarazioni

Questo studio è stato finanziato da Philip Morris International.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare Maurice Smith e Marja Talikka per la loro revisione del manoscritto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
MucilAir-fibroblasti umani-bronchiaEpithelix Sá rl, Ginevra, Svizzerahttp://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/
MucilAir Culture MediumEpithelix Sá rl, Ginevra, Svizzerahttp://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/
VITROCELLVITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germaniahttp://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R=
3R4F riferimento sigarettaUniversità del Kentuckyhttp://www2.ca.uky.edu/refcig/
30-port carosello macchina per fumare SM2000Philip Morris, Int.
Fotocamera CiliaMetrix e softwareLa Haute & Eacute; cole de Gestion (HESGE), Ginevra, Svizzera
Microscopio Leica DMIL Leica, Heerbrugg, Svizzera
Sorgente luminosa a LEDTitan Tool Supplies, Buffalo, NY
Elettrodo a bacchetta STX-2World Precision Instrumentshttp://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/
EVOMXTM Voltohmmetro epitelialeWorld Precision Instrumentshttp://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/
Reagente per la rilevazione della luciferina 
Strumento Lyser MagNACloroformio Rochehttp://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66
Sigma-Aldrichhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=
QIAcube Qiagen9001882
Nano Scientific Thermo Scientifichttp://www.nanodrop.com/
Bioanalizzatore Agilent 2100 Agilenthttp://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106
Affymetrix GeneChip Elevata produttività 3' Kit IVT ExpressAffymetrixhttp://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit
Scanner 3000 7G Affymetrixhttp://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G

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