Descriviamo due metodi per la visualizzazione e la quantificazione dell'arborizzazione dendritica nell'ippocampo di modelli murini: imaging in tempo reale e con profondità di campo estesa. Mentre il primo metodo consente un sofisticato tracciamento topografico e la quantificazione dell'estensione della ramificazione, il secondo consente una rapida visualizzazione dell'albero dendritico.
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Articolo metodologico
Valutazione della dendritiche arborizzazione nel giro dentato della Regione ippocampale nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'arborizzazione dendritica ha dimostrato di essere un marcatore affidabile per l'esame dell'integrità strutturale e funzionale dei neuroni. Infatti, la complessità e l'estensione dell'arborizzazione dendritica si correla bene con la plasticità sinaptica in queste cellule. Un metodo affidabile per la valutazione dell'arborizzazione dendritica è necessario per caratterizzare gli effetti deleteri dei disturbi neurologici su queste strutture e per determinare gli effetti degli interventi terapeutici. Tuttavia, la quantificazione di queste strutture si è rivelata un compito arduo data la loro natura complessa e dinamica. Fortunatamente, sofisticate tecniche di imaging possono essere abbinate a metodi di colorazione convenzionali per valutare lo stato dell'arborizzazione dendritica, fornendo un mezzo di valutazione più affidabile e rapido. Di seguito è riportato un esempio di come queste tecniche di imaging sono state abbinate a metodi di colorazione per caratterizzare l'arborizzazione dendritica nei topi wild type. Questi metodi di imaging complementari possono essere utilizzati per valutare qualitativamente e quantitativamente l'arborizzazione dendritica che si estende su un'area piuttosto ampia all'interno della regione ippocampale.
Introduzione
Alterazioni dinamiche nel numero e la struttura delle sinapsi sono le caratteristiche distintive di sviluppo, l'invecchiamento, e numerose malattie neurodegenerative 1-3. La capacità dei neuroni di ricevere e integrare le informazioni sinaptica dipende morfologia dendritica e alterazioni dinamiche connessioni sinaptiche. Infatti, esiste una correlazione positiva tra spine dendritiche e il numero di sinapsi, che sia un impatto funzione cognitiva 4. Quindi, non è sorprendente che decrementi in numero spine dendritiche sono stati associati a disfunzioni cognitive in una serie di disturbi neurologici 5-7, spingendo grande interesse sp....
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Protocollo
NOTA: Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con gli standard etici approvati dalla commissione per la ricerca degli animali presso il sistema sanitario Veterans Affairs Palo Alto.
1. Golgi-Cox colorazione
- Estrazione del cervello e colorazione
- Il 1 ° giorno, anestetizzare profondamente topi con 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg xylazina prima eutanasia via dissanguamento.
- Rimuovere con cautela la calotta cranica e sezionare il cervello.
- Prima rimuovere la pelle sulla parte superiore del cranio, ponendo una forbice curva sulla parte superiore del cervelletto e delicatamente tagliare il c....
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Risultati
L'entità del arborization derivanti da granuli dentati esistenti e appena nati è stato analizzato in topi wild type utilizzando Golgi-Cox o DCX colorazione (Figura 1). Segmenti di cellule dendritiche DCX-positivi sono stati trovati per essere lunga 13-36 micron. La distribuzione normale di lunghezza dendritiche è stata testata utilizzando il test Kolmogorov-Smirnov (D = 0,1217, p <0,01, Liliefors p <0,001; figure 4 e 5).
Nell'a.......
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Discussione
Qui, due metodi sono stati descritti per quantificare l'entità del dendritica in neuroni maturi e appena nati con metodi di colorazione convenzionali in collaborazione con RTI e EDFI. L'acquisizione di immagini ad alta risoluzione di neuroni fornisce un metodo estremamente utile per testare gli effetti deleteri di malattie neurodegenerative e, a sua volta, fornisce un mezzo per valutare strategie terapeutiche che colpiscono i neuroni ippocampali.
Mentre il metodo RTI stato utilizzato.......
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Dichiarazioni
Spese di pubblicazione di questo articolo sono sponsorizzati da MBF Bioscience.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata supportata da sovvenzioni della LuMind Foundation, della Research Down Syndrome e dell'Alzheimer's Association (AS). CP è stato parzialmente supportato da una sovvenzione per lo sviluppo della facoltà del College of Nursing and Health Professions dell'Arkansas State University.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione colorante di Golgi-cox modificata | Weill Cornell Medical College | NA | negozio a 4 gradi C till use |
| 1x Soluzione di sviluppo (Stock 10x) | Weill Cornell Medical College | NA | negozio a 4° C fino a utilizzare |
| il 30% di saccarosio, | Sigma | CAS # 57-50-1 | fare fresco in ddH2O |
| 0,3% Gelatina | Sigma | CAS # 9000-70-8 | NA |
| Soluzioni di etanolo classificate (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) | Sigma | CAS 603-003-00-5 | NA |
| Xilene | Sigma | CAS # 1330-20-7 | NA |
| DPX Medio | EMS | #13510 | NA |
| Superfrost (+) bianco | Microscopia elettronica Sciences | 71869-10 | NA |
| Vetrino coprioggetti 22x50mm (VWR #48393-059) | VWR | #4811-703 | NA |
| DCX Anticorpo | Santa Cruz Biotechnology | sc-8066 4 | C |
| DAB | Sigma CAS | Numero 91-95-2 | -20 |
| OCT | Tissue-tek | 4583 | NA |
| Tris | Sigma | Numero CAS 77-86-1 | Na |
| ABC Lite | Vector | PK4000 | NA |
| Microscopio | Nikon | Eclipse 80i | |
| Fotocamera digitale | Nikon | DS-Ri1 | |
| 12 bit Fotocamera | QImaging | 01 MBF2000RF-CLR-12 | |
| Sistema Neurolucida | MBF Bioscience | V.10 | |
| Image Composite Editor | Microsoft | 1.4.4.0 | |
| NIS Elements | Nikon | F 3.0 | |
| Image Pro Plus | Mediacy Versin 7.00 |
Riferimenti
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 383-388 (2012).
- Isaac, J. T. The synapse: center stage for many brain diseases. The Journal of Physiology. 587 (4), 727-729 (2009).
- Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. ....
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Ristampe e permessi
