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Articolo metodologico

Gene Transfection verso Celle sferoide su lastre micropatterned coltura per trapianto di cellule geneticamente modificati

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DOI:

10.3791/52384

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31 luglio 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Medicine, Laboratory of Clinical Biotechnology, The University of Tokyo, 2Graduate School of Engineering, Department of Materials Engineering, The University of Tokyo, 3Graduate School of Engineering, Department of Bioengineering, The University of Tokyo

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un sistema di trapianto cellulare che utilizza sferoidi iniettabili geneticamente modificati. Gli sferoidi cellulari vengono coltivati su piastre di coltura microstrutturate e recuperati dopo l'introduzione del gene utilizzando nanomicelle polyplex. Questo sistema facilita l'espressione prolungata del transgene dalle cellule trapiantate negli animali ospiti, mantenendo la funzione innata delle cellule.

Abstract

Per migliorare l'efficacia terapeutica del trapianto di cellule, è stato sviluppato un sistema di trapianto di geneticamente modificati, sferoidi iniettabili. Gli sferoidi cellule vengono preparati in un sistema di coltura su piastre micropatterned rivestiti con un polimero termosensibile. Un certo numero di sferoidi sono formate sulle piastre, corrispondenti alle aree di adesione cellulare di 100 micron di diametro che sono regolarmente schierati in modo bidimensionale, circondate da aree non-adesive che sono rivestiti da un polietilenglicole (PEG) di matrice. Gli sferoidi possono essere facilmente recuperati da una sospensione liquida abbassando la temperatura delle piastre, e la loro struttura è ben mantenuto facendoli passare attraverso gli aghi di iniezione con una sufficientemente grosso calibro (over 27 G). La modificazione genetica è ottenuta gene trasfezione utilizzando il vettore originale non virale gene, nanomicelle Polyplex, che è in grado di introdurre geni nelle cellule senza distruggere la struttura sferoidale. Per primsferoidi epatociti ary trasfettate con un gene luciferasi che esprimono, la luciferasi è sostenibile ottenuti in animali trapiantati, con funzione di epatociti conservata, come indicato dall'espressione albumina. Questo sistema può essere applicato ad una varietà di tipi cellulari, comprese le cellule staminali mesenchimali.

Introduzione

La terapia di trapianto cellulare ha attirato l'attenzione diffusa per il trattamento di varie malattie incurabili. L'attività e l'emivita dei fattori bioattivi che sono secreti dalle cellule trapiantate sono essenziali per migliorare l'efficacia terapeutica di un sistema di trapianto di cellule. La modificazione genetica delle cellule prima del trapianto è una tecnica utile per regolare e manipolare funzioni cellulari, compresa la secrezione dei fattori bioattivi. E 'anche importante mantenere un microambiente favorevole per le cellule per evitare la morte cellulare o perdita di attività cellulare. Tridimensionale coltura (3D) cellule sferoidale, in quale cella-cellula interazioni sono ben conservate, è promettente per questo scopo, ad esempio, per migliorare la secrezione di albumina da epatociti primari e promuovendo multi-lineage differenziazione da cellule staminali mesenchimali (MSC ) 1-7.

In questo studio, un sistema di nuova combinazione di spheroid cultura e trasfezione genica viene utilizzata per servire da piattaforma per il trapianto di cellule geneticamente modificate. Per creare cellule sferoidali, viene utilizzato un sistema di coltura sferoide su piastre di coltura micropatterned. Su queste piastre, aree di adesione cellulare di 100 micron di diametro sono regolarmente disposte in maniera bidimensionali e sono circondati da zone non adesivi rivestiti da una matrice PEG 3. Seminando un adeguato numero di cellule, array di sferoidi 3D di 100 micron di diametro sono formati corrispondenti al letto coltura micropatterned.

Gli sferoidi siano recuperati senza distruggerne la struttura 3D utilizzando piastre di coltura cellulare termosensibili, che sono stati rivestiti con un polimero termosensibile, poli (iso-propylacrylamide) (PIPAAm) 8-10. L'architettura micropatterned è costruito sulle piastre termosensibili (su misura costruito). Semplicemente abbassando la temperatura delle piastre, gli sferoidi sono staccati dal letto coltura e disperdonod in tampone fosfato (PBS). Pertanto, un gran numero di sferoidi con dimensioni uniformi di 100 micron può essere ottenuto sotto forma di una sospensione iniettabile.

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Figura 1. Rappresentazione schematica del sistema di coltura sferoide su un piatto micropatterned. La modificazione genetica è ottenuta mediante trasfezione genica utilizzando il vettore non virale gene originale, nanomicelle Polyplex. E 'composto da DNA plasmidico (pDNA) e polietilene glicole (PEG) blocchi -polycation copolimeri 11. Questi hanno una struttura core-shell caratteristica costituito da un guscio di PEG e un nucleo interno di pDNA condensata, permettendo sicuro ed efficace introduzione del gene nelle cellule a scopo terapeutico 11. Cliccate qui per vedere una versione più grande di This figura.

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Figura 2. Struttura del nanomicelle Polyplex formata dal complesso di acidi nucleici e copolimeri a blocchi PEG-block-policatione. In questo studio, il vantaggio principale di questa tecnica è che la struttura sferoidale non interrompere durante gene trasfezione dai nanomicelles. Dopo trasfezioni nanomicelle-mediata di ratto sferoidi epatociti primari, l'espressione del transgene prolungata è ottenuto per più di un mese con la secrezione di albumina continuo dagli epatociti ad un livello paragonabile a quello di sferoidi untransfected 12. L'espressione del transgene e la secrezione di albumina da sferoidi sono mantenuti dopo il recupero dalle piastre termosensibili. E 'evidente che nanomicelles possono facilitare tranquillamente introduzione gene senza compromettere le funzioni innate della HEPatocytes. Pertanto, la combinazione di cellule sferoidali coltivate su piastre micropatterned termosensibili con introduzione del gene utilizzando nanomicelles è una piattaforma promettente per il trapianto di cellule geneticamente modificate. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Protocollo

Tutti gli studi su animali sono stati condotti con l'approvazione della cura e l'uso Comitato Animale dell'Università di Tokyo, Tokyo, Giappone.

1. Preparazione delle cellule

  1. Per epatociti primari, seguire il protocollo per l'isolamento di epatociti di ratto da una a due stadi modificati processo di digestione collagenasi 13,14.
    1. Anestetizzare Sprague Dawley (SD) ratti (maschi, 5 settimane di vita) sotto inalazione anestesia con isoflurano. Inserire un ratto in una camera collegata a una macchina per anestesia a fornire isoflurano per la camera. Estrarre il topo dopo essersi addormentati, e metterlo sul tavolo operatorio con ventilazione utilizzando una maschera. Flow Control isoflurano approssimativamente 0,4-0,7 L / min controllando le condizioni di ratto. Profumato i fegati di Sprague Dawley (SD) ratti (maschi, 5 settimane) dalla vena porta con una soluzione speciale composta da 8 g / l di cloruro di sodio (NaCl), 400 mg / l di cloruro di potassio (KCl), 78 mg / Lsodio diidrogeno fosfato diidrato (NaH 2 PO 4 · 2H 2 O), 151 mg / L sodio fosfato dibasico dodecaidrato (Na 2 HPO 4 · 12H 2 O), 2,38 g / L 2- [4- (2-idrossietil) -1 -piperazinile] acido etansolfonico (HEPES), 190 mg / L glicole etilenico tetraacetico (EGTA), 350 mg / L di carbonato acido di sodio (NaHCO3), e 900 mg / L di glucosio.
    2. Far circolare soluzione di collagenasi attraverso il fegato.
      NOTA: La soluzione è composta da 500 mg / L collagenasi, 9,8 g / salina tampone di L Hank, 2,38 g / ml HEPES, 556 mg / ml idrato di cloruro di calcio (CaCl 2 · H 2 O), 350 mg / L NaHCO 3, e inibitore della tripsina / L 50 mg, con il pH regolato a 7,2.
    3. Rimuovere il fegato con attenzione, e tritare delicatamente su un piatto con un bisturi, aggiungere Dulbecco Modified mezzo di Eagle (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) e filtrare la sospensione cellulare attraverso un 100 micronrete di nylon. Per rimuovere i detriti aggiuntivo, centrifugare la sospensione cellulare a 20 g per 1 min. A questo punto, gli epatociti sono nel supernatante.
    4. Ripetere la fase di centrifugazione due volte (per un totale di tre centrifugazioni). Infine, centrifugare epatociti a 50 g per 3 minuti per recuperarli in forma di pellet.
    5. Risospendere epatociti ad una concentrazione di 4 × 10 5 cellule / ml in un mezzo di coltura speciale composto DMEM supplementato con 10% FBS, 1% Pen-Strep-Glut (PSQ), 1% dimetilsolfossido (DMSO), 0.1 mmol / L desametasone, 0,5 mg / ml di insulina, 10 mmol / L nicotinamide, 0,2 mmol / L ascorbato fosforilata (Asc-2P), e 10 ng / ml il fattore di crescita epidermico umano (hEGF) 15. Questo mezzo speciale è obbligatoria per preservare la funzione epatica in condizioni in vitro.
  2. Per ottenere MSC di ratto, eutanasia Sprague Dawley (SD) ratti (maschi, 5 settimane di vita) da eccessiva somministrazione di isoflurane. Resecare femore e tibia, e raccogliere le midollo osseo inserendo un ago G 22 nel pozzo dell'osso per lavarlo con 10 ml di DMEM supplementato con 10% FBS. Raccogliere le cellule mediante filtrazione attraverso una rete di nylon 100 micron.
  3. Seme le cellule su 10 piatti cm di coltura con DMEM contenente 10% FBS e 1% di penicillina / streptomicina. Per gli esperimenti sferoidali, utilizzare MSC a 5 passaggi.

2. Preparazione di Spheroids Cell 3D

  1. Commercialmente ottenere piastre di coltura micropatterned, in cui le aree adesive cellulari sono regolarmente schierati a 100 micron di diametro in modo bidimensionale, circondata da aree non adesivi rivestiti dalla matrice PEG.
    NOTA: per il trapianto di cellule, un ulteriore rivestimento con la PIPAAm polimero termosensibile è necessario per consentire il distacco cellulare raffreddando le piastre (vedi passo 5.1). Fluttuazioni di temperatura possono indurre cambiamenti nella chimica di questo polimero8-10. A 37 ° C, PIPAAm è leggermente idrofoba, permettendo alle cellule di essere coltivate in condizioni normali. Una diminuzione della temperatura sotto 32 ° C risultati in rapida idratazione del polimero, che porta al distacco spontaneo delle cellule.
  2. Seme epatociti o MSC in piastre da 12 pozzetti micropatterned ad una densità di 4 x 10 5 cellule / pozzetto loro andincubate a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO 2. Le cellule si accumulano sulle aree di adesione micropatterned e gradualmente formare sferoidi rotonde in 2 giorni.
    NOTA: Per la preparazione di cellule di controllo in una coltura monostrato, utilizzare piastre da 12 pozzetti normali e sementi le cellule ad una densità identico, seguendo una procedura simile a quella descritta sopra.

3. Preparazione del Polyplex Nanomicelles

  1. Sintetizzare un copolimero a blocchi, PEG-PASP (DET) (poli [N '- [N - (2-amminoetil) -2-amminoetil] aspartamide]) (PEG Mw = 12,000, grado di polimerizzazione (DP) di PASP (DET) segmento = 59), e un omopolimero che è composto solo segmento cationico [PASP (DET)] (DP = 55), seguendo le procedure precedentemente descritte dagli autori 11, 16, 17.
  2. Preparare una soluzione mista di PEG-PASP (DET) copolimero a blocchi e il PASP (DET) omopolimero con un rapporto molare uguale di gruppi amminici residui in tampone HEPES 10 mM (pH 7,3), regolando la concentrazione di polimero a 33,3 ug / ml e 19.1 mg / ml, rispettivamente.
    NOTA: Le concentrazioni di polimero sopra descritte sono valori rappresentativi per preparare nanomicelles con un rapporto molare residua del totale dei gruppi amminici in due polimeri ai gruppi fosfato nella (N / rapporto P) pDNA 10. Il rapporto N / P può variare a seconda del tipo di cellula e lo scopo (per dettagli vedi Discussione). L'utilizzo combinato dei due polimeri può ottenere sia efficace schermatura PEG e il funzionamento del PASP (DET) per migliorare endosomalfuggire (per dettagli vedi Discussione) 18.
  3. Preparare la codifica pDNA luciferasi Gaussia, GL4 luciferasi, o eritropoietina clonando il segmento che esprime i rispettivi geni nel plasmide pCAG-GS (http://www.cdb.riken.jp/pcs/protocol/vector/map/m36.html ) per ottenere espressione sotto il CAG promotore / enhancer utilizzando un kit commerciale secondo il protocollo del produttore. Amplificare il pDNA in un ceppo di Escherichia coli competente e purificarlo utilizzando un plasmide sistema di purificazione del DNA privo di endotossine. Determinare la concentrazione pDNA in assorbanza a 260 nm per ottenere una soluzione / ml 150 mg in 10 mM tampone HEPES (pH 7,3).
  4. Per preparare i nanomicelles Polyplex, mescolare la soluzione pDNA (150 ug / ml in tampone HEPES 10 mM) e la soluzione premiscelata dei due polimeri ad un rapporto di 2: 1 (in volume).

4. Gene Trasfezione in Spheroids

  1. Incubare le cellule (epatocitio MSC) per 72 ore dopo la semina sulle piastre micropatterned per consentire la formazione di sferoidi maturi. Per gene trasfezione, aggiungere 100 ml di soluzione di Polyplex nanomicelle (contenenti 10 mg di pDNA) per ogni bene dopo la sostituzione del mezzo di coltura con 1 ml di terreno fresco. Continuare l'incubazione con la soluzione nanomicelle per 24 ore.
  2. Per un controllo utilizzando un trasfezione reattivo a base lipidica, mescolare soluzioni pDNA con il reagente con un rapporto peso / reagente pDNA del 3. Regolare la dose finale di pDNA essere uguale sia per il reattivo a base di lipidi e metodi nanomicelle.

5. Recupero e trapianto di cellule Spheroids

  1. Sostituire il terreno di coltura con 200 ml di PBS freddo e posizionare le piastre sul ghiaccio.
    NOTA: In generale, i sferoidi possono staccarsi in circa 15 minuti e può essere recuperata sotto forma di una sospensione per il trapianto.
  2. Aspirare delicatamente le cellule in 200 microlitrisospensione con una siringa con un 23 G 27 o G ago per iniezioni in vivo.

6. Valutazione di Transgene Expression

  1. Per la valutazione in vitro di espressione di luciferasi Gaussia secreto nel mezzo di coltura, raccogliere 50 - 100 ml del mezzo proprio 24 ore dopo aver sostituito con terreno fresco. Stimare l'espressione luciferasi mediante un sistema di dosaggio renilla luciferasi commerciale e un luminometro secondo il protocollo del produttore.
    NOTA: La luciferasi Gaussia rimane stabile nel terreno di coltura per più di una settimana. Così, per valutare l'efficienza in tempo reale della espressione del transgene, sostituire il supporto con quello fresco prima di raccogliere il fluido da misurare. I tempi del cambiamento mezzo può essere flessibile.
  2. Per la valutazione in vivo dell'espressione del transgene in animali ospiti dopo il trapianto di cellule, anestetizzare BALB / c topi nudi (femminile; 7 settimanevecchio) sotto inalazione anestesia con isoflurano.
    1. Inserire un topo in una camera collegata a una macchina per anestesia a fornire isoflurano per la camera. Estrarre il mouse dopo essersi addormentati, e metterlo sul tavolo operatorio con ventilazione utilizzando una maschera. Flow Control isoflurano approssimativamente 0,2-0,5 L / min controllando le condizioni del mouse.
    2. Iniettare 200 microlitri della sospensione cellulare contenente sferoidi trasfettate con i pDNA luciferasi che esprimono GL4 (come descritto in 4.1) nel tessuto sottocutaneo della regione addominale.
    3. Subito dopo l'iniezione di D-luciferina (150 mg / kg; via endovenosa), misurare l'espressione della luciferasi utilizzando sistema di imaging IVIS secondo il protocollo del produttore.
  3. Per valutare gli effetti terapeutici del trapianto di cellule, iniettare 200 ml di sospensione cellulare contenente sferoidi trasfettate con i pDNA-eritropoietina codificazione neltessuto sottocutaneo della regione addominale.
    1. Raccogliere i campioni di sangue da emorragia submandibolare di ottenere circa 200 ml di sangue 19. Misurare l'emoglobina ed ematocrito utilizzando un analizzatore di campione di sangue.
      NOTA: Il numero di cellule per il trapianto è regolato dal numero seminate sui piatti. Purtroppo, è difficile determinare il numero di cellule esatto perché il numero all'interno sferoidi non può essere misurata.
  4. Dopo gli esperimenti, inserire i topi su una piastra elettrica collegato con un regolatore di temperatura fino a quando il risveglio dall'anestesia.

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Risultati

Gene trasfezione del Gaussia luciferasi che esprimono pDNA è stata eseguita in sferoidi formate dagli epatociti e cellule staminali mesenchimali con nanomicelles Polyplex o trasfezione reattivo a base di lipidi di controllo 12. I nanomicelles indotti quasi nessun cambiamento nella struttura sferoidale rispetto sferoidi non transfettate sulle piastre micropatterned, mentre il reagente di controllo interrotto significativamente la struttura un giorno dopo la trasfezione (Figura 3). Dopo trasfez...

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Discussione

In questo protocollo, è fondamentale per mantenere la struttura 3D della sferoidi durante le fasi di introduzione del gene e recupero sferoidale. È essenziale mantenere un microambienti favorevoli per le celle per evitare la morte cellulare o perdita di attività cellulare. Ad esempio, la secrezione di albumina, una funzione rappresentativa innata di epatociti, è ben conservata in sferoidi epatociti, mentre gli epatociti in coltura monostrato convenzionali perdono rapidamente la loro capacità secretoria pochi giorni dopo...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Apprezziamo profondamente il dottor Takeshi Ikeya e personale tecnico Toyo Gosei, Tokyo, Giappone per la fornitura di piastre di coltura micropatterned termosensibili e pareri scientifici. Ringraziamo anche la signora Satomi Ogura, la signora Sae Suzuki, la signora Asuka Miyoshi e la signora Katsue Morii per l'assistenza tecnica con la sperimentazione animale. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente in parte dal JSPS KAKENHI Grant-in-Aid per la ricerca scientifica, il Centro per l'Innovazione (COI) Programma e il programma di innovazione S- dal Giappone Scienza e della Tecnologia Agency (JST), e il JSPS Core- a-Core Programma, A. Ricerca reti avanzate.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pen-Strep-GlutGIBCO
DesametasoneWako Pure Chemical Industries041-18861
NicotinamideWako Pure Chemical Industries141-01202
Hank' sale tamponato e acido L-ascorbico 2-fosfato (Asc-2P)Sigma-AldrichA8960
Fattore di crescita epidermico umano (hEGF)ToyoboPT10015
Piastre multipozzetto cell-ableToyo GoseiPP-12
Piastre per colture cellulari termosensibili (Upcell)CellSeed IncL'architettura micromodellata è costruita sulle piastre termosensibili (costruite su misura da Toyo Gosei)
Reagente di trasfezione a base di lipidi (FuGENE HD)PromegaE2311
Renilla Luciferase Assay SystemPromegaE2810
pGL4 Luciferase Reporter VectorPromegaE6651
pDNA che esprime Gaussia luciferasiNew England BioLabsN8082S
Vettore di topo che esprime ertropoietinaOrigeneMC208445
pCAG-GSGentilmente fornito dal Laboratorio per gli studi cellulari pluripotenti, Centro per la biologia dello sviluppo, RIKEN
em>Escherichia coli DH5α cellule competentiTakara9057
Sistema di purificazione del DNA plasmidico privo di endotossineNippon GeneticsNucleoBond Xtra EF
CollagenasiWako Pure Chemical Industries639-00951
Inibitore della tripsinaGIBCOR-007-100
LuminometroPromegaGloMax™ 96 Luminometro
IVIS Sistema di imagingXenogen Corp.Xenogen IVIS Sistema di imaging
Spectrum Analizzatore di campioni di sangueSysmexpocH-100i
<per micropiastrein vivo Analizzatore ematologico automatizzato

Riferimenti

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