Questo protocollo descrive un sistema di trapianto cellulare che utilizza sferoidi iniettabili geneticamente modificati. Gli sferoidi cellulari vengono coltivati su piastre di coltura microstrutturate e recuperati dopo l'introduzione del gene utilizzando nanomicelle polyplex. Questo sistema facilita l'espressione prolungata del transgene dalle cellule trapiantate negli animali ospiti, mantenendo la funzione innata delle cellule.
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Articolo metodologico
Gene Transfection verso Celle sferoide su lastre micropatterned coltura per trapianto di cellule geneticamente modificati
In questo articolo
Sommario
Abstract
Per migliorare l'efficacia terapeutica del trapianto di cellule, è stato sviluppato un sistema di trapianto di geneticamente modificati, sferoidi iniettabili. Gli sferoidi cellule vengono preparati in un sistema di coltura su piastre micropatterned rivestiti con un polimero termosensibile. Un certo numero di sferoidi sono formate sulle piastre, corrispondenti alle aree di adesione cellulare di 100 micron di diametro che sono regolarmente schierati in modo bidimensionale, circondate da aree non-adesive che sono rivestiti da un polietilenglicole (PEG) di matrice. Gli sferoidi possono essere facilmente recuperati da una sospensione liquida abbassando la temperatura delle piastre, e la loro struttura è ben mantenuto facendoli passare attraverso gli aghi di iniezione con una sufficientemente grosso calibro (over 27 G). La modificazione genetica è ottenuta gene trasfezione utilizzando il vettore originale non virale gene, nanomicelle Polyplex, che è in grado di introdurre geni nelle cellule senza distruggere la struttura sferoidale. Per primsferoidi epatociti ary trasfettate con un gene luciferasi che esprimono, la luciferasi è sostenibile ottenuti in animali trapiantati, con funzione di epatociti conservata, come indicato dall'espressione albumina. Questo sistema può essere applicato ad una varietà di tipi cellulari, comprese le cellule staminali mesenchimali.
Introduzione
La terapia di trapianto cellulare ha attirato l'attenzione diffusa per il trattamento di varie malattie incurabili. L'attività e l'emivita dei fattori bioattivi che sono secreti dalle cellule trapiantate sono essenziali per migliorare l'efficacia terapeutica di un sistema di trapianto di cellule. La modificazione genetica delle cellule prima del trapianto è una tecnica utile per regolare e manipolare funzioni cellulari, compresa la secrezione dei fattori bioattivi. E 'anche importante mantenere un microambiente favorevole per le cellule per evitare la morte cellulare o perdita di attività cellulare. Tridimensionale coltura (3D) cellule sferoidale,....
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Protocollo
Tutti gli studi su animali sono stati condotti con l'approvazione della cura e l'uso Comitato Animale dell'Università di Tokyo, Tokyo, Giappone.
1. Preparazione delle cellule
- Per epatociti primari, seguire il protocollo per l'isolamento di epatociti di ratto da una a due stadi modificati processo di digestione collagenasi 13,14.
- Anestetizzare Sprague Dawley (SD) ratti (maschi, 5 settimane di vita) sotto inalazione anestesia con isoflurano. Inserire un ratto in una camera collegata a una macchina per anestesia a fornire isoflurano per la camera. Estrarre il topo dopo essersi addormentati, e me....
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Risultati
Gene trasfezione del Gaussia luciferasi che esprimono pDNA è stata eseguita in sferoidi formate dagli epatociti e cellule staminali mesenchimali con nanomicelles Polyplex o trasfezione reattivo a base di lipidi di controllo 12. I nanomicelles indotti quasi nessun cambiamento nella struttura sferoidale rispetto sferoidi non transfettate sulle piastre micropatterned, mentre il reagente di controllo interrotto significativamente la struttura un giorno dopo la trasfezione (Figura 3). Dopo trasfez.......
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Discussione
In questo protocollo, è fondamentale per mantenere la struttura 3D della sferoidi durante le fasi di introduzione del gene e recupero sferoidale. È essenziale mantenere un microambienti favorevoli per le celle per evitare la morte cellulare o perdita di attività cellulare. Ad esempio, la secrezione di albumina, una funzione rappresentativa innata di epatociti, è ben conservata in sferoidi epatociti, mentre gli epatociti in coltura monostrato convenzionali perdono rapidamente la loro capacità secretoria pochi giorni dopo.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Apprezziamo profondamente il dottor Takeshi Ikeya e personale tecnico Toyo Gosei, Tokyo, Giappone per la fornitura di piastre di coltura micropatterned termosensibili e pareri scientifici. Ringraziamo anche la signora Satomi Ogura, la signora Sae Suzuki, la signora Asuka Miyoshi e la signora Katsue Morii per l'assistenza tecnica con la sperimentazione animale. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente in parte dal JSPS KAKENHI Grant-in-Aid per la ricerca scientifica, il Centro per l'Innovazione (COI) Programma e il programma di innovazione S- dal Giappone Scienza e della Tecnologia Agency (JST), e il JSPS Core- a-Core Programma, A. Ricerca reti avanzat....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pen-Strep-Glut | GIBCO | ||
| Desametasone | Wako Pure Chemical Industries | 041-18861 | |
| Nicotinamide | Wako Pure Chemical Industries | 141-01202 | |
| Hank' sale tamponato e acido L-ascorbico 2-fosfato (Asc-2P) | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Fattore di crescita epidermico umano (hEGF) | Toyobo | PT10015 | |
| Piastre multipozzetto cell-able | Toyo Gosei | PP-12 | |
| Piastre per colture cellulari termosensibili (Upcell) | CellSeed Inc | L'architettura micromodellata è costruita sulle piastre termosensibili (costruite su misura da Toyo Gosei) | |
| Reagente di trasfezione a base di lipidi (FuGENE HD) | Promega | E2311 | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega | E2810 | |
| pGL4 Luciferase Reporter Vector | Promega | E6651 | |
| pDNA che esprime Gaussia luciferasi | New England BioLabs | N8082S | |
| Vettore di topo che esprime ertropoietina | Origene | MC208445 | |
| pCAG-GS | Gentilmente fornito dal Laboratorio per gli studi cellulari pluripotenti, Centro per la biologia dello sviluppo, RIKEN | ||
| em>Escherichia coli DH5α cellule competenti | Takara | 9057 | |
| Sistema di purificazione del DNA plasmidico privo di endotossine | Nippon Genetics | NucleoBond Xtra EF | |
| Collagenasi | Wako Pure Chemical Industries | 639-00951 | |
| Inibitore della tripsina | GIBCO | R-007-100 | |
| Luminometro | Promega | GloMax™ 96 Luminometro | |
| IVIS Sistema di imaging | Xenogen Corp. | Xenogen IVIS Sistema di imaging | |
| Spectrum Analizzatore di campioni di sangue | Sysmex | pocH-100i |
Riferimenti
- Landry, J., Bernier, D., Ouellet, C., Goyette, R., Marceau, N. Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities. J Cell Biol. 101 (3), 914-923 (1985).
- Yuasa, C., Tomita, Y., Shono, M., Ishimura, K., Ichihara, A.
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Ristampe e permessi
