Experimental Glaucoma indotta da iniezione oculare di microsfere magnetiche

Sommario

Presentiamo un metodo per indurre un'elevata pressione intraoculare (IOP), iniettando microsfere magnetiche nell'occhio del ratto, per modellare il glaucoma. Ciò porta a forti aumenti di pressione e a un'estesa morte neuronale. Questo protocollo è facile da eseguire, non richiede iniezioni ripetute e produce aumenti IOP stabili e duraturi.

Abstract

Il progresso nella comprensione della fisiopatologia e nella fornitura di nuovi trattamenti per il glaucoma dipende da buoni modelli animali della malattia. Presentiamo qui un protocollo per l'aumento della pressione intraoculare (IOP) nel ratto, iniettando microsfere magnetiche nella camera anteriore dell'occhio. L'uso di particelle magnetiche consente all'utente di manipolare le perle nell'angolo iridocorneale, fornendo così un blocco molto efficace del deflusso del fluido dalla rete trabecolare. Ciò porta a un aumento duraturo della IOP e, infine, alla morte neuronale nello strato di cellule gangliari (GCL), nonché alla patologia del nervo ottico, come osservato nei pazienti con la malattia. Questo metodo è semplice da eseguire, in quanto non richiede macchinari, competenze chirurgiche specialistiche o molte ore di pratica per essere perfezionato. Inoltre, gli aumenti di pressione sono molto robusti e di solito non è richiesta la reiniezione delle microsfere magnetiche, a differenza di altri modelli che utilizzano perline di plastica. Inoltre, riteniamo che questo metodo sia adatto per l'adattamento all'occhio del topo.

Introduzione

Glaucoma primario è una malattia degli occhi devastante che colpisce circa 60,5 milioni di persone in tutto il mondo ^1, che può portare alla perdita della vista vita che alterano e cecità ^2. La ricerca sui meccanismi della malattia, e lo sviluppo di nuove terapie per il glaucoma, dipendono buoni modelli della malattia che ricapitolano alcune delle caratteristiche della patologia.

Presentiamo qui un modello di ratto glaucoma basato sul metodo di Samsel et al. ³ L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di aumentare la pressione intraoculare (IOP) nell'occhio iniettando microsfere magnetiche nella camera anteriore, e utilizzando un anello magnetico, diretta li in angolo iridocorneale. Questo impedisce deflusso acquosa, che aumenta IOP, con conseguente danno neuronale e perdita di cellule. Il protocollo è stato sviluppato per tentare di fornire un semplice modello inducibile del glaucoma.

Questo protocollo può avere alcuni vantaggirispetto alle tecniche esistenti. Modelli genetici come topi DBA / 2J sono disponibili, che non richiedono procedure di avvio; tuttavia questi possono avere un esordio imprevedibile di progressione della malattia ^4. Al contrario, i modelli inducibili, molti dei quali si basano su chirurgicamente elevando IOP nei roditori, hanno il vantaggio che l'iniziazione può essere controllata dall'utilizzatore. Alcuni di questi metodi possono avere inconvenienti della loro tuttavia, compreso tecnicamente impegnativo ^5, e possono richiedere più procedure per mantenere elevata IOP ^6.

Al contrario, il metodo inducibile descritto in questo manoscritto è una tecnica semplice, efficace e riproducibile che produce stabili, robusti aumenti di pressione, con minima necessità di reiniezione. Inoltre, esso non comporta attrezzature costose, e richiede solo abilità chirurgiche di base per eseguire. Questo protocollo può essere appropriato per i lettori che stanno cercando di creare una inducibile tecnicamente meno impegnativaModello glaucoma nel loro laboratorio.

Protocollo

Etica dichiarazione: Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con la cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC), e sono stati approvati in accordo con le linee guida Regno Unito home office ( http://goo.gl/FLkirW , ultimo accesso il 10 ^giugno , 2014) e la Dichiarazione ARVO per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research ( http://goo.gl/4LFOjD , ultimo accesso il 10 ^giugno 2014).

1. ipertensione oculare Induzione

1. Indurre glaucoma sperimentale elevando la pressione intraoculare (IOP) tramite iniezione unilaterale di microsfere paramagnetici nella camera anteriore di Brown Norvegia ratti, basata sul metodo di Samsel et al. ³ Altri ratti pigmentati possono essere adatti, anche se questi dovrebbero essere convalidata primo dall'utente.
2. Casa 250-300 g femminileex-allevatore Brown Norvegia ratti in un ambiente di scarsa illuminazione costante (40-60 lux) per ridurre al minimo le fluttuazioni diurne in IOP ^7, con l'accesso a cibo e acqua ad libitum.
3. Prendere le misure IOP di base in animali svegli ⁸ prima anestesia e iniezione tallone, utilizzando un tonometro rimbalzo tarato per l'uso negli occhi di ratto ^9. IOP è preso come media di cinque letture.
4. Anaesthetize ratti con 37,5 mg / kg di ketamina, e 0,25 mg / kg medetomidina cloridrato consegnato per via intraperitoneale. Confermare profondità dell'anestesia testando i riflessi del piede posteriore dell'animale, prima dell'applicazione di iodio povidone (vedi punto 1.5), e l'iniezione tallone (vedi punto 1.8). Amministrare 0.5% proparacaina cloridrato per l'analgesia.
   NOTA: Non dilatare la pupilla, in ogni fase. Questo aiuterà le perline per stabilirsi meglio nel dell'angolo iridocorneale, e prevenire vincolante alla lente. Applicare pomata oculare contro l'essiccamento della cornea su un-operato occhio controlaterale.
5. Wcenere l'occhio operativa con 5% povidone iodio in acqua ¹⁰ 5 min prima dell'iniezione.
6. Dopo 5 minuti, stoppino lo iodio povidone off con garza sterile, e lavare l'occhio con soluzione salina sterile allo 0,9%. Mantenere l'occhio umido durante l'anestesia con l'applicazione regolare di soluzione salina sterile.
7. Posizionare un magnete toroidale intorno all'occhio.
8. Iniettare 25 ml di una soluzione contenente 30 mg / ml di gamma-irradiazione sterilizzato 8 micron microsfere magnetiche in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) nella camera anteriore, utilizzando un ago smussato 33 G.
   1. Per preparare perline, lavare da ri-sospensione, poi centrifugazione 3 volte a 10.000 xg per 5 minuti con 1 ml HBSS, prima di fare la 30 mg / ml soluzione definitiva. Mantenere condizioni di sterilità in tutto.
   2. Per l'iniezione, fare attenzione ad evitare di inserire l'ago l'iride, per ridurre al minimo il rischio di traumi iris. Ciò può essere evitato orientando l'ago tangente alla superficie corneale, come paralleladell'iride possibile. Questo aiuterà anche a ridurre al minimo la perdita di tallone dal sito di iniezione.
      NOTA: Iniettare perle a un ritmo rapido per garantire una distribuzione uniforme intorno all'angolo iridocorneale, che è fondamentale per aumentare IOP. Inoltre, negozio perline, aghi e anelli magnetici separatamente in modo che le perle non formano i cluster, che li rende difficili da caricare nella siringa e iniettare, e l'ago non diventa magnetizzato.
9. Lasciare l'ago in posizione per 1 minuto dopo l'iniezione al fine di garantire che le microsfere sistemazione in angolo iridocorneale impedire il drenaggio acquosa dal trabecolato. Leggermente angolo l'ago dopo le perline hanno inizialmente risolto per consentire alcune perdite di acquosa, per ridurre al minimo aumenti transitori IOP. Al termine dell'intervento lavare l'ago attraverso con il primo tampone fosfato salino (PBS), poi 70% di etanolo, seguita da acqua distillata, per garantire l'uso continuato dell'ago in procedure separate. In alternativa, si potrebbe utilizzareaghi monouso se la combinazione calibro e la siringa corretta è disponibile. Optional: aghi possono essere affilano con una beveller per prolungare il loro utilizzo.
10. A questo punto, se necessario, rimuovere il magnete, e usarlo per disegnare perle in aree di copertura incompleta.
11. Lasciare il magnete in posizione intorno all'occhio per altri 10 min dopo l'iniezione per assicurare perline stabilirsi bene nel dell'angolo iridocorneale.
12. Anestesia Reverse con 0,25 mg / kg atipemezole cloridrato.
13. Amministrare cloramfenicolo, o altro pomata antibiotica, per esempio gentamicina o terramycin topica per prevenire l'infezione, e lo 0,5% proparacaina cloridrato per l'analgesia. Lasciare gli animali a recuperare su una stuoia di calore fino a ritrovare il movimento, poi il trasferimento ad una scatola caldo e fornitura con alimentazione supplementare, come un integratore alimentare o dieta regolare inumidito fino al recupero è completo. Analgesia sistemica o locale deve essere somministrato agli animali che presentano segni di dolore 24 ore dopo l'intervento chirurgico. Se These sintomi persistono nonostante il trattamento, gli animali devono essere abbattuti in modo umano.
14. Utilizzare l'occhio controlaterale come controllo non operato.
15. Prendere le misure IOP ogni 2-3 giorni dopo la somministrazione tallone, e ogni 2-3 giorni successivi con un tonometro rimbalzo tarato per l'uso negli occhi di ratto ^9.
16. I criteri per l'inclusione occhi a studi possono essere: se 1) la IOP è elevata al di sopra della pressione di controllo controlaterale di 5 mmHg, e 2) non superiore a 60 mmHg.
17. Occhi dove la pressione torna a basale (di solito da 1 settimana dopo l'iniezione) non devono essere inclusi negli studi, tuttavia è possibile re-iniettare perline in occhi che non riescono a sviluppare l'alta pressione intraoculare, se desiderato.
18. Euthanize animali di CO ₂ asfissia alla fine dell'esperimento.
19. Sezionare occhi e nervi ottici, e fissare nel 4% paraformaldeide (PFA) durante la notte per ulteriori analisi istologica.

2. Valutare danni alla retina Neuron Uso TUNEL STaining

1. Per quantificare cellule apoptotiche in tutto il monte retinasuse test deossinucleotidil terminale transferasi-mediata dUTP nick-etichettatura (TUNEL), secondo le istruzioni del produttore.
2. Sezionare la retina dalla oculare, lavare per 3 x 5 min in 0,3% Triton X-100 in tampone fosfato (PBS-T).
3. Permeabilize il tessuto in 3% T-PBS per 2 ore.
4. Pre-equilibrare retine in Equilibration tampone per 10 minuti, prima di incubazione in soluzione di reazione TUNEL per 1 ora a 37 ° C.
5. Lavare il tessuto da 3 x 5 min a 0,3% T-PBS, sciacquare in 0.3% T-PBS contenente 5 micron DAPI, e TV a montare in supporti di montaggio.
6. Per quantificare TUNEL nuclei positivi utilizzano un microscopio confocale a prendere 10 micron z-stack attraverso lo strato di cellule gangliari a 20X di ingrandimento. Prendere 3 immagini su ciascuno dei 4 petali, in siti vicino al nervo ottico, in media periferia, e alla periferia lontano della retina, dando un totale di 12 immagini per tutta mount, il campionamento di circa 7.000 cellule. Criteri morfologici discriminati cellule non neuronali (endoteliale e gliali) dalle cellule neuronali.
7. Selezionare le aree per l'imaging utilizzando solo il canale DAPI, e gli investigatori maschera di gruppi di trattamento.

3. Valutare danno del nervo ottico Utilizzando Toluidine Blu colorazione

1. Fissare nervi ottici durante la notte in soluzione di Karnovsky a 4 ° C.
2. Trattare campioni per 2 ore a 1% (w / v) di osmio tetrossido e poi disidratato in 100% di etanolo.
3. Incubare nervi ottici in ossido di propilene per 30 min, e posizionare in una miscela 50:50 di ossido di propilene: overnight araldite.
4. Cambiare questa soluzione a 100% araldite, seguita da incubazione per una notte a 60 ° C.
5. Cut semisottile sezioni (0,75 millimetri di spessore) e macchia con l'1% di toluidina blu / di borace (TB) in etanolo al 50% prima di esame al microscopio ottico.

4. Analisi statistica

1. Eseguire ana statistichelisa utilizzando un apposito software di statistiche. Un ANOVA a due vie con test post-hoc di Newman-Keul può essere utilizzata per calcolare la significatività statistica per IOP cambia nel tempo.
2. Un valore p inferiore a 0,05 può essere considerato significativo.

Risultati

Iniezione di perline magnetiche nel angolo iridocorneale costantemente indotto un aumento prolungato e robusto in pressione (figura 1), che era facilmente osservabile al primo punto temporale, 3 giorni dopo l'iniezione. Inoltre, l'aumento della pressione è stata mantenuta per tutta la durata dell'esperimento, e sebbene il nostro corso tempo finito a 18 giorni dopo l'iniezione, altri hanno riportato che la pressione persiste a lungo termine ^3. La media IOP media sulla lunghezza della esperimento di controllo, occhi non-bead-iniettati era 19,7 ± 0,3 mmHg, rispetto a 40,5 ± 2,8 mmHg per occhi branello-iniettato (P <0.001). Inoltre, picco IOP è aumentato da 22.8 ± 0.3 mmHg a 49,9 ± 2,3 mmHg.

Per determinare se l'elevazione della PIO porta alla morte delle cellule gangliari retiniche, abbiamo effettuato TUNEL sulla retina, e istologia su sezioni trasversali del nervo ottico (Figura 2). In retina abbiamo osservato un aumento della colorazione TUNEL (Figura 2A) in occhi tallone-iniettata con elevata pressione intraoculare. Il numero di nuclei apoptotici aumentato di circa 15 volte, da 1,6 ± 0,5 cellule nei controlli controlaterali, a 24,5 ± 0,5 cellule retine ipertesi (Figura 2B; P <0.05). Inoltre, negli occhi in cui biglie magnetiche sono state iniettate ma pressione non è aumentato (probabilmente a causa del blocco incompleta dell'angolo iridocorneale), il numero di cellule TUNEL-positivi non erano significativamente differenti da quelli dei controlli uninjected (P> 0,05). Questo suggerisce che la morte cellulare era legato a pressione aumenta, non causa tossicità diretta delle microsfere magnetiche. Infine, abbiamo studiato la patologia del nervo ottico nel modello glaucoma, e visto accumulo di blu di toluidina in molti degli assoni, indicando la degenerazione di questi processi cellulari (Figura 2C).

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Figura 1. aumento della pressione intraoculare con microsfere magnetiche. Iniezione di microsfere magnetiche nella camera anteriore indotto un robusto, significativo aumento della pressione intraoculare (IOP) in confronto al controllo controlaterale, occhi non iniettati. Unità asse Y = millimetri di mercurio (mmHg). Dati = media ± SEM. * = P <0.001; N = 12. Questo dato è stato modificato da Foxton et al, Am.. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.

Figura 2. Elevazione della IOP tramite iniezione di microsfere magnetiche in angolo iridocorneale, indotta morte neuronale nello strato di cellule gangliari (GCL). (A) Immagini rappresentative della retine di controllo (a sinistra) e glaucoma (a destra) gli occhi macchiati di nuclei apoptotici da TUNEL (verde;frecce bianche) e DAPI (blu), che indica il numero di nuclei apoptotici aumentato rosa IOP. (B) Quantificazione delle cellule positive TUNEL in GCL, mostrando che gli occhi con elevata IOP (al centro), avevano cellule significativamente più apoptotici rispetto a (a sinistra). Al contrario, negli occhi perline-iniettata in cui la pressione non ha aumento (a destra), è stato osservato alcun aumento significativo TUNEL colorazione. Dati = media ± SEM. * = P <0.05; N = 7 - 8 (C) Immagini rappresentative della colorazione ottico nervo, dimostrando un aumento toluidina blu accumulo (frecce nere) in assoni danneggiati da glaucoma (a destra), ma non il controllo occhi (a sinistra).. Bar scale = 50 micron. Questa cifra è stata modificata da Foxton et al., Am. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.

Discussione

Qui mostriamo un metodo per indurre elevata IOP nel ratto, iniettando microsfere magnetiche nella camera anteriore dell'occhio. Questo metodo è semplice da portare a termine, e richiede poca perizia chirurgica, o ore di pratica e raffinatezza. Inoltre, il procedimento è efficace; raramente richiede più di una singola iniezione di perline di indurre una forte, robusto aumento della pressione (circa il 10% tasso di reiniezione). Questo può fornire un vantaggio rispetto ai metodi inducibili esistenti, come la vena episceral tecnicamente impegnativo sclerosi ¹¹ modelli, o laser protocollo fotocoagulazione ^6, che può richiedere più procedure da mantenere sollevate IOP.

Affinché il metodo per avere successo tuttavia, ci sono alcuni piccoli passi critici che devono essere prese. In primo luogo, è utile utilizzare un magnete a forma toroidale per disegnare perline in angolazione iridocorneale. Questo passo è una modifica del protocollo originale, where le perline sono state iniettate nella camera anteriore, e poi spostati a mano libera intorno all'occhio ^3. Utilizzando un magnete toroidale significa che microsfere dovrebbero risolvere in modo uniforme in tutto l'angolo, richiedendo il minimo redistribuzione manuale. In secondo luogo, il tasso di iniezione deve essere veloce - troppo lento e le perline si accumula prevalentemente su un lato dell'angolo, con conseguente copertura incompleta e potenzialmente nessun aumento di pressione. In generale però, il metodo è abbastanza semplice che l'utente potrebbe facilmente apportare modifiche al protocollo, ad esempio variando la dimensione o volume delle particelle di microsfere, forse per tentare di alterare il grado di elevazione IOP.

Tuttavia, uno svantaggio potenziale del metodo è che si ha poco controllo sulla misura della ipertensione, che in circa 5-10% dei casi osservati salito sopra 60 mmHg. Aumenti eccessivi di IOP può essere molto distruttivo per tessuto retinico, e può rendere lo studio dei meccanismi e biologia di morte cellulare sfidare. Tuttavia, il metodo produce una patologia neuronale consistente, sia nella retina e nervo ottico, che può essere manipolato farmacologicamente ^12. Questo può rendere il modello interessante per lo sviluppo di nuove terapie per il trattamento del glaucoma. Inoltre, poiché le perle sono diretti in angolo iridocorneale, questo lascia l'asse visivo gratuito per l'imaging dal vivo del disco retina o ottico. Prevediamo che questo modello sarà adattato e utilizzato per applicazioni future in altre specie, tra cui mouse.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
250 - 300 g femmina Brown Norway ex-breeder ratti	Harlan UK	203
Tonolab Rebound Tonometer	Tiolat	TV02
Ketaset (ketamina)	Fort Dodge Salute degli animali	BN1000118	37,5 mg/kg
Domitor (medetomidina cloridrato)	Orion Pharma	140-999	0,25 mg/kg
Iodio povidone	Ecolab	BN4369LE10	5% in H2O
Soluzione salina minima	Bausch e Lomb	PL00033/5017
Magnete toroidale	Supermagnete	R-10-07-03-N
Microsfere magnetiche	Bangs Laboratories	UMC4N/9692
HBSS	Invitrogen	14025
33 G ago smussato	Hamilton	7747-01
Siringa con punta Luer	Hamilton	80601
Antisedan (atipemezolo cloridrato)	Orion Pharma	141-003	0,25 mg / kg
Unguento al cloramfenicolo	Medicom	18956-0005
Kit di colorazione TUNEL	Promega	G3250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Vectashield supporti di montaggio	Vector Labs	H-1000