È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Utilizzando impedenza Cell-substrato e imaging cellulare dal vivo per misurare i cambiamenti in tempo reale in Cellular Adesione e De-adesione indotta da Matrix Modifica

9.8K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/52423

⸱

19 febbraio 2015

 , 
1Centre for Vascular Research, University of New South Wales, 2School of Medical Sciences, University of New South Wales

In questo articolo

Sommario

Qui, vi presentiamo un protocollo per quantificare continuamente i processi di adesione cellulare e de-adesione con alta risoluzione temporale in modo non invasivo per impedenza cellule-substrato e imaging cellulare dal vivo analisi. Questi approcci rivelano le dinamiche dei processi di adesione cellulare / de-adesione innescato da modifica della matrice e la loro relazione temporale con gli eventi di segnalazione adesione-dipendente.

Abstract

Adesione cellulare matrice gioca un ruolo chiave nel controllo della morfologia cellulare e di segnalazione. Stimoli che sconvolgono l'adesione cellula-matrice (ad esempio, la mieloperossidasi e altri ossidanti matrice-modifica / enzimi rilasciati durante l'infiammazione) sono implicati nella innescare cambiamenti patologici in funzione cellulare, fenotipo e la vitalità in una serie di malattie. Qui, descriviamo come impedenza cell-substrato e approcci di imaging cellulare dal vivo possono essere facilmente impiegati per quantificare con precisione i cambiamenti in tempo reale di adesione cellulare e de-adesione indotta da modifiche alla matrice (utilizzando cellule endoteliali e la mieloperossidasi come stimolo matrice modificando fisiopatologico) con alta risoluzione temporale e in modo non invasivo. Il sistema di impedenza della cella-substrato xCELLigence quantifica continuamente la zona di adesione cellula-matrice misurando l'impedenza elettrica all'interfaccia cellula-substrato in cellule cresciute su array di microelettrodi oro. L'analisi delle immagini di time-lapse differenziale film contrasto interferenze quantifica variazione dell'area proiettata di singole cellule nel tempo, rappresentano variazioni dell'area di contatto cellula-matrice. Entrambe le tecniche quantificare con precisione rapidi cambiamenti dei processi di adesione cellulare e de-adesione. Impedenza Cell-substrato su array microelettrodo biosensori fornisce una piattaforma per le misure robusta, ad alta produttività. Imaging cellulare dal vivo analizza fornire ulteriori dettagli circa la natura e la dinamica dei cambiamenti morfologici quantificati da misure di impedenza cella-substrato. Questi approcci complementari forniscono nuove preziose intuizioni come mieloperossidasi-catalizzata ossidativo modifica dei componenti della matrice extracellulare subcellulari innesca rapidi cambiamenti di adesione cellulare, la morfologia e di segnalazione nelle cellule endoteliali. Questi approcci sono applicabili per studiare dinamiche di adesione cellulare in risposta ad altri stimoli matrice modificanti e in cellule aderenti correlate (ad esempio, cellule epiteliali) anche.

Introduzione

Contatti adesivi stabili tra le cellule e la loro matrice extracellulare che circonda sono necessari per mantenere l'omeostasi tissutale. Per esempio, l'adesione delle cellule endoteliali alla matrice sottoendoteliale nei vasi sanguigni gioca un ruolo critico nel mantenere l'integrità dello strato endoteliale e la sua funzione omeostatica come normativo, semi-permeabile barriera vascolare 1. Il citoscheletro actina è accoppiato meccanicamente ad adesivo molecole della matrice in siti di adesione cellula-matrice e contatti adesivo all'interfaccia cellula-matrice svolgere un ruolo importante nel determinare la posizione della membrana cellulare resistendo centralmente dirette forze di trazione actomiosina. Stimoli extracellulari che alterano l'adesione cellula-matrice necessariamente alterare l'equilibrio delle forze all'interfaccia cellula-matrice, un evento che è rapidamente 'percepite' di proteine ​​di segnalazione meccano-sensibili, causando la trasduzione di "outside-in di segnalazione". Questa scommessa cross-talkcellule Ween e la loro matrice extracellulare che circonda svolge un ruolo chiave nel controllo la forma delle cellule, la motilità, la funzione, la proliferazione e la sopravvivenza 2.

Processi patofisiologici Varie (sviluppo embrionale, infiammazione, riparazione delle ferite e le metastasi del cancro) sono caratterizzati da rimodellamento dinamico di substrati matrice adesivo ossidanti e / o enzimi 3,4 matrice-degradanti. Ad esempio, proteine ​​della matrice adesiva subendoteliali nei vasi sanguigni (es, fibronectina) sono implicati come obiettivi principali per la modifica o la degradazione in malattie infiammatorie umane a causa della produzione localizzata di ossidanti reattivi (per esempio, acido ipocloroso, HOCl) dall'enzima leucociti derivato mieloperossidasi (MPO), che si accumula all'interno del subendothelium durante malattia vascolare infiammatoria (Figura 1) 5-9. Variazioni di adesione cellula-matrice indotte da ossidanti MPO-derivati ​​e altri stimoli matrice-modifica sono likely a giocare un ruolo importante nel modificare l'omeostasi vascolare durante una varietà di processi patologici, ad esempio, alterando la segnalazione delle cellule endoteliali, la morfologia e la vitalità, che a sua volta perturba funzione endoteliale e integrità della barriera. Tuttavia, le risposte di segnalazione morfologiche e cellulari delle cellule aderenti a modifiche della matrice extracellulare stanno solo iniziando a essere capito.

Per capire come le modifiche di matrice auto cambiamenti nelle dinamiche di adesione cellulare e delle cellule vie di segnalazione di adesione-dipendente, le tecniche, sono necessari a quantificare con precisione i cambiamenti in adesione cellula-matrice in tempo reale, con alta risoluzione temporale. Qui, descriviamo complementare impedenza cell-substrato e tecniche di imaging cellulare dal vivo che soddisfano questi criteri e fornire una piattaforma per quantificare l'adesione delle cellule e dei processi di de-adesione in modo non invasivo.

Mostriamo come questi impedenza della cella-substrato e vivo appro imaging cellularedolori possono essere facilmente impiegati per (i) monitorare le dinamiche di attaccamento cellulare e diffusione (cioè, de novo adesione cellulare) su substrati matrice nativi e modificati e (ii) per misurare le dinamiche di distacco cellula-matrice (cioè, de-aderenza ) da parte delle cellule aderenti esposte a stimoli matrice-modifica. Il sistema xCELLigence cellula-substrato biosensore impedenza fornisce una misurazione continua della superficie di contatto cellula-matrice quantificando impedenza elettrica alla superficie 96 pozzetti array oro microelettrodi ed esprime queste misurazioni dell'impedenza elettrici come 'indice di cellule', un valore adimensionale che è sostanzialmente proporzionale all'area di cellula-substrato contatto 10 (figura 2), mentre anche essendo sensibile alle variazioni della distanza media tra la (isolante) membrana cellulare e la superficie dell'elettrodo 11. Un ulteriore aumento dei valori di indice cella è ottenuta anche sulla formazione di stretto contatto cellula-cellula that limitare i flussi di corrente paracellulare, 11 condizioni che non prevalgono nei esperimenti descritti in questo studio. Misurazione della superficie proiettata delle singole cellule nel tempo per l'analisi delle immagini di time-lapse contrasto di interferenza differenziale (DIC) film fornisce una misura complementare di variazioni dell'area di contatto cellula-substrato e fornisce ulteriori informazioni sulla natura esatta e la dinamica del cambiamenti morfologici quantificati dall'approccio impedenza cellula-substrato.

In particolare, si descrive l'applicazione di questi approcci per monitorare come ossidazione delle proteine ​​della matrice subendoteliale adesivi (ad esempio, fibronectina) (i) MPO-mediata riduce l'adesione de novo di cellule endoteliali sospese su fibronectina purificato e (ii) innesca cellula-matrice de -adhesion in cellule endoteliali, con l'adesione stabilito sulla fibronectina. Eseguendo segnalazione cellulare parallela analisi nel tempo utilizzando biochem rilevantesaggi iCal (ad esempio, blotting occidentale), le relazioni temporali e causali tra i processi di adesione / de-adesione e cambiamenti associati nella segnalazione cellulare eventi adesione-dipendente può essere determinato.

Questi approcci sono stati recentemente utilizzati per dimostrare che l'ossidazione della matrice extracellulare catalizzata da depositi subendoteliali di MPO innesca una rapida perdita di adesione cellula-matrice delle cellule endoteliali che è guidato da preesistenti forze actomiosina contrattili 9. È importante sottolineare che, consentendo la relazione temporale tra cambiamenti sia adesione delle cellule e delle cellule di adesione-dipendente di segnalazione da stabilirsi, questi approcci identificati che modifica matrice MPO-indotta e cellulare de-adesione innesca cambiamenti di importanti vie di segnalazione delle cellule adesione-dipendente tra cui Src chinasi -dipendente fosforilazione paxillina e leggera della miosina catena II fosforilazione (Figura 1) 9. Questa modalità di segnalazione redox-dipendente, involving l'attivazione di eventi di segnalazione intracellulare da reazioni ossidative extracellulari che inficiano l'adesione cellula-matrice, rappresenta una nuova modalità di segnalazione cellulare denominato "fuori-nella segnalazione redox" (Figura 1) 9.

In generale, questi complementare biosensore impedenza cell-substrato e approcci di imaging cellulare dal vivo dovrebbero essere utili nel rivelare come i diversi stimoli o agenti matrice-modificando auto cambiamenti nelle dinamiche di adesione cellulare, morfologia e segnalazione all'interno di diversi tipi di cellule aderenti soggette a una vasta gamma di impostazioni sperimentali.

Il protocollo segue descrive come quantificare l'impatto di ossidazione matrice MPO-mediata su de novo di adesione delle cellule endoteliali (Esperimento 1) e cellule endoteliali de-adesione (Esperimento 2) processi. MPO lega avidamente alla fibronectina e altre proteine ​​della matrice extracellulare subendoteliali adesivi e cies perossido di idrogeno (H 2 O 2) per convertire ioni cloruro (Cl -) al altamente reattivo clorurante ossidante acido ipocloroso (HOCl), che reagisce localmente con queste proteine ​​della matrice e disturba le loro proprietà adesive delle cellule (Figura 1) 8,9, 12.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. Generale Endothelial Cell Culture

  1. Culture bovina cellule endoteliali aortiche (passaggi 4-9) su gelatina rivestita fiasche di coltura tissutale (rivestimento superficiale coltura tissutale con 0,1% w / v di gelatina in PBS a temperatura ambiente per 15 min) in EGM-2 supporti (con l'EGM-2 proiettile kit contenente siero bovino fetale 5%, fattori di crescita e tutti gli integratori fornite dal produttore, tranne idrocortisone).
  2. Quando le cellule sono quasi confluenti (circa 3 giorni dopo la semina dopo un 1: 4 split), cellule raccolto mediante trattamento con 0,05% w / v tripsina / 0.02% w / v EDTA in PBS a 37 ° C. Dopo la maggioranza delle cellule sono distaccato, aggiungere completi EGM-2 supporti per placare la tripsina e centrifugare (100 xg, 5 min).
  3. Preparare cellule per studi sull'adesione de novo di cellule endoteliali a fibronectina (Esperimento 1: Sezione 2) e la successiva de-adesione delle cellule endoteliali con adesione stabilita su tale substrato (Esperimento 2: Sezione 3).
    1. Lavare raccoltecellule una volta con senza siero Medium 199 contenente 1% w / v di albumina sierica bovina (BSA) e ri-centrifuga (100 xg, 5 min).
    2. Risospendere le cellule in senza siero Medium 199 contenente 1% w / v BSA a 2,5 x 10 5 cellule / ml (misure di impedenza cell-substrato) o 5 x 10 5 cellule / ml (analisi di imaging cellulare dal vivo) e mantenere a 37 ° C prima dell'uso.
      NOTA: Le risposte adesione delle cellule sono molto sensibili alle differenze di temperatura (ad esempio, a causa di effetti di convezione) così tutte le apparecchiature e le soluzioni utilizzati per gestire e trattare cellule durante i seguenti protocolli devono essere mantenuti ad una temperatura costante di 37 ° C.

2. Esperimento 1: Quantificare De Novo endoteliale Adesione cellulare su Native e MPO-ossidato fibronectina (impedenza Cell-substrato)

NOTA: Esperimento 1 esamina il grado di MPO-mediata ossidazione della fibronectina compromette la capacità di supportare de novo Adesione delle cellule endoteliali in sospensione.

  1. Cappotto fibronectina su 96 pozzetti cell-substrato matrici di microelettrodi impedenza oro. Aggiungere 80 ml / pozzetto di purificata bovina fibronectina a 5 ug / ml in PBS, incubare per 2 ore a 37 ° C e rimuovere la soluzione.
  2. Incubare superfici fibronectina rivestite con MPO per consentire il legame di MPO alla fibronectina superficiale legata. Aggiungere 80 ml / pozzetto di purificato MPO neutrofili umani a 20 nM in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e incubare per 0,5 ore a 37 ° C.
  3. Lavare superfici due volte con HBSS per rimuovere non legato MPO.
  4. Aggiungere H 2 O 2 (0-10 mM concentrazione finale) per i pozzetti della piastra matrice microelettrodo contenente 80 microlitri / pozzetto HBSS di avviare MPO-catalizzata, HOCl-dipendente fibronectina ossidazione e incubare per altri 0,5 ore a 37 ° C.
  5. Per esaminare l'effetto degli inibitori rilevanti o modulatori di reazioni MPO-catalizzate (ad esempio, alternativa MPO enzimisubstrati, inibitori enzimatici o antiossidanti; vedi 9 per i dettagli), aggiungerli al HBSS immediatamente prima H 2 O 2 aggiunta.
  6. Dopo 0,5 ore, il trattamento di superfici con metionina per placare residue specie ossidanti superficie-bound, cioè, clorammine legati alle proteine ​​reattive, che possono esercitare attività cellulari confondenti. Aggiungi metionina 10 mm di 80 microlitri HBSS per pozzetto e incubare per 10 min a 37 ° C.
  7. Block superfici con BSA. Aggiungere 80 ml / pozzetto di BSA allo 0,2% w / v in PBS, incubare per 2 ore a 37 ° C e rimuovere la soluzione.
    NOTA: regioni superficiali non rivestite residui sosterrà l'adesione cellulare e bloccando questi con una proteina non adesivo (cioè, BSA) assicura che le risposte adesione cellulare strettamente dipendono dalla matrice di celle adesivo purificato impiegato, in questo caso fibronectina.
  8. Lavare superfici due volte con HBSS.
    NOTA: Nessuno dei trattamenti superficiali precedenti influisce sensibilmente cellula-substrato readings.
  9. Seed cellule endoteliali in sospensione (aggiungere 200 microlitri / bene a circa 2,5 x 10 5 cellule / ml, preparati in senza siero Medium 199 contenente BSA 1%; vedere 1.3) sulle superfici fibronectina rivestite nativi o MPO-ossidati.
  10. Immediatamente dopo la semina di cellule (cioè, prima di qualsiasi attaccamento cellulare e diffusione), montare la piastra matrice microelettrodo sulla porta incubatore (ospitato in un 37 ° C incubatore in presenza di 2 5% CO).
    1. Utilizzando il software dello strumento prendere immediatamente un 'blank' lettura per normalizzare successiva impedenza cellula-substrato ('index cell') valori ai valori iniziali di fondo ottenuti in assenza di cellula-aderenza.
    2. Avviare l'acquisizione dei dati di indice delle cellule continue (minimo di una cella dell'indice di lettura / min).
  11. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per 2 ore, un periodo di tempo durante il quale l'adesione cellulare e la massima diffusione è realizzato; questo si rifletteun plateauing dei valori di indice cella (si veda la Figura 3A).
    NOTA: L'esperimento precedente (Esperimento 1) esamina come iniziale ossidazione MPO-mediata della fibronectina limita la capacità delle cellule endoteliali a stabilire l'adesione cellulare su questo substrato. Il seguente esperimento (Esperimento 2) esamina come MPO-mediata ossidazione fibronectina promuove diminuzioni adesione cellula-matrice (cioè de-adesione) in cellule endoteliali, con l'adesione stabilito su questo substrato. I trattamenti in questi due esperimenti sono essenzialmente identici, eccetto per i tempi di ossidazione MPO-mediata fibronectina (cioè prima adesione cellulare - Esperimento 1, dopo l'adesione cellulare - Esperimento 2).

3. Esperimento 2: Quantificare cellule endoteliali De-adesione da fibronectina in risposta a MPO-mediata fibronectina ossidazione (impedenza Cell-substrato e Imaging Live Cell)

  1. Cappotto fibronectina su 96 pozzetti oro microelettrodo unrrays per misure di impedenza cell-substrato (aggiungere 80 ml / pozzetto di fibronectina a 5 mg / ml in PBS e incubare per 2 ore a 37 ° C) o 35 millimetri dal fondo di vetro piatti di coltura cellulare per le analisi di imaging cellulare dal vivo (aggiungere 2 ml / piatto di fibronectina a 5 ug / ml in PBS ed incubare per 2 ore a 37 ° C).
  2. Block superfici con BSA. Aggiungere BSA allo 0,2% w / v in PBS a volumi indicati in 3.1 e incubare per 2 ore a 37 ° C.
  3. Incubare superfici con MPO per consentire il legame di MPO alla fibronectina. Aggiungere 20 nM purificato MPO umana in HBSS ai volumi indicati in 3.1 e incubare per 0,5 ore a 37 ° C.
  4. Lavare superfici due volte con HBSS per rimuovere non legato MPO.
  5. Seed cellule endoteliali in sospensione (preparati in Medium 199 contenente 1% w / v BSA senza siero, vedi 1.3) sulle superfici rivestite fibronectina nativi o MPO-cuscinetto.
    1. Aggiungere 200 microlitri / pozzetto di 2,5 x 10 5 cellule / ml a 96 e cellula-substrato array di microelettrodi impedenza.
    2. Aggiungi 2 ml / piatto a 5 x 10 5 cellule / ml a 35 millimetri di vetro piatti di coltura cellulare fondo.
  6. Immediatamente dopo la semina di cellule (cioè, prima di qualsiasi attaccamento cellulare e diffusione):
    1. Mount 96 pozzetti di matrice microelettrodo sul porto incubatore impedenza cell-substrato (ospitato in un 37 ° C incubatore in presenza del 5% 2 CO) e le letture "in bianco" per avviare l'acquisizione continua di dati di indice delle cellule (cf. Sezione 2.10 ).
    2. Trasferimento 35 millimetri fondo di vetro piatti di coltura cellulare ad un 37 ° C incubatore in presenza di 5% CO 2.
  7. Incubare le cellule a 37 ° C per 2 ore per consentire l'attaccamento cellulare e massima diffusione (cfr Sezione 2.11).
  8. Brevemente rimuovere le (letture indice cella pausa a questo punto), 96 pozzetti matrice microelettrodi o 35 millimetri con fondo di vetro cellulare piatto cultura dalla C incubatore 37 °, rimuovere il surnatante cellulare e aggiungere riscaldata (37 ° C) HBSS (volumi come per passo 3.1).
    NOTA: HBSS viene impiegato quando si studia MPO-catalizzate reazioni ossidative invece di terreni di coltura completo come quest'ultimo contiene specie ossidabili che interferiscono con le reazioni di ossidazione.
  9. Per esaminare l'effetto degli inibitori / modulatori di reazioni MPO-catalizzate (substrati enzimatici alternativi, inibitori enzimatici o antiossidanti) o inibitori di segnalazione cellulare (ad es, 40 micron blebbistatin per inibire actomiosina contrattilità), aggiungere questi ora.
  10. Porre immediatamente la piastra matrice microelettrodi indietro nel (letture indice cella ri-commence a questo punto), 37 ° C porta incubatore o vetro 35 millimetri con fondo cella piatto cultura indietro nel C incubatore 37 °, e permettono alle cellule di equilibrare in HBSS per 0,5 ore.
    NOTA: dopo 0,5 ore equilibrio in HBSS, valori di indice cella si stabilizzano su valori leggermente inferiori; quando pre-incubando le cellule con i substrati di enzimi, enzimi e gli inibitori di segnalazione cellulare o antiossidanti, prima assicurarsi che these non incidono in modo significativo i valori ottenuti dopo il raggiungimento dell'equilibrio.
  11. Avvio MPO-catalizzata, HOCl dipendente ossidazione fibronectina e de-adesione.
    1. Per gli studi di impedenza cellulari utilizzando 96 e piastre di matrice microelettrodi:
      1. Rimuovere la piastra matrice microelettrodo dal termostato e mettere in pausa le misurazioni dell'indice cellulare.
      2. Aggiungi H 2 O 2 (concentrazione finale di 0-10 micron) per la HBSS e mescolare delicatamente pipettando ripetute.
      3. Immediatamente, ri-montare la matrice microelettrodo indietro sulla C porto incubatore 37 ° e ri-iniziare l'acquisizione di letture indice cellulare.
    2. Per gli studi di imaging cellulare dal vivo con piastra da 35 mm con fondo trasparente coltura cellulare:
      1. Rimuovere il piatto cultura dal termostato e montare su un C palco riscaldato di un microscopio confocale invertito dotato di una lente obiettivo 63X acqua con ottica DIC adatti per la registrazione di filmati cellule vive 37 °.
      2. Concentrarsi sulle cellule eottimizzare ottica DIC (illuminazione Köhler, ritardo pregiudizi e fotocamera offset / guadagno, per i dettagli, vedi 13).
      3. Avviare film DIC e registrare le letture di base di cellule non trattate per 1 min.
      4. Aggiungi H 2 O 2 (concentrazione finale di 0-10 micron) e mescolare delicatamente pipettando ripetute. Rimettere a fuoco il microscopio (se necessario) e continuare la registrazione DIC filmati delle cellule trattate per il periodo di tempo richiesto.

4. Analisi dei dati e presentazione

  1. Dati impedenza Cell-substrato
    1. Esportazione dati grezzi (indice rispetto al tempo delle cellule) in un foglio di calcolo.
    2. Per gli studi di cellule de-adesione (Esperimento 2: Sezione 3), normalizzare i dati impostando valori registrati immediatamente prima dell'inizio della MPO-mediata ossidazione fibronectina per un valore di 1 (vale a dire, immediatamente prima dell'aggiunta di H 2 O 2 a 3.11 .1.1).
      NOTA: Questo assicura che relativacambiamenti nei valori di indice delle cellule indotte da MPO-mediata ossidazione fibronectina non vengono mascherati da piccole differenze iniziali nei valori tra pozzi di indice cella assoluti.
      1. I dati attuali come trame di indice normalizzato cellulare (asse y) in funzione del tempo (asse x).
  2. Dati di imaging cellulare dal vivo (studi delle cellule de-adesione in Esperimento 2: Sezione 3)
    1. Aprire DIC vivono film di imaging cellulare registrati immediatamente prima e dopo l'apertura di MPO-mediata ossidazione fibronectina in un programma di analisi di immagine standard (ad esempio, il software ImageJ).
    2. In almeno due film separati DIC casualmente selezionare più celle e misurare la loro area proiettata in fotogrammi in sequenza (ad esempio, a intervalli di 1 min) tracciando manualmente il loro vantaggio a membrana e quantificare il numero di pixel chiusi.
    3. Esportazione dati grezzi (area di cella proiettata rispetto al tempo) di un foglio di calcolo Excel e normalizzare dati dell'area cella impostando valori registrati immediatamente primal'apertura di MPO-mediata ossidazione fibronectina ad un valore di 1 (cioè, immediatamente prima dell'aggiunta di H 2 O 2 in 3.11.2.3).
    4. Presentare i dati come un terreno di zona normalizzata cellulare (asse y) in funzione del tempo (asse x).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

In tempo reale quantificazione delle cellule endoteliali de-adesione da fibronectina in risposta ad ossidazione fibronectina MPO-mediata (Esperimento 2). La semina di sospensioni cellulari endoteliali su nativo (MPO gratuito) fibronectina o MPO-cuscinetto risultati fibronectina in allegato cellule massima e la diffusione in 2 ore, come giudicato da un plateauing di valori di indice cella nella misure di impedenza substrato cellulare (Figura 3A). Questa fase iniziale di adesione delle ce...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Adesione cellula-matrice e processi de-adesione possono essere quantificati con precisione in tempo reale ad alta risoluzione temporale con impedenza di cellule-substrato e imaging cellulare dal vivo analisi. Questi approcci in tempo reale forniscono un grande vantaggio rispetto end-point analisi di adesione cellulare, che offrono scarsa risoluzione temporale. Per quantificare con precisione le risposte de-adesione rapide con alta risoluzione temporale, queste analisi possono fornire spunti critici in modalità morfologi...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno informativa da fare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato da un National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) e, in parte, da un UNSW Faculty Faculty Research Grant (MDR).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Array di microelettrodi di impedenza cellula-substrato d'oro a 96 pozzettiACEA Biosciences / RocheE-Plate 96piastra monouso utilizzata per l'esecuzione di saggi basati su cellule sul sistema xCELLigence
blebbistatinSigmaB0560inibitore selettivo delle
cellule endoteliali aortiche bovine non muscolari miosina-II, crioconservate LonzaBW-6001
Albumina sierica bovinaSigma05470
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162Kit di terreni di crescita di cellule endoteliali
Fibronectina, polvere liofilizzataSigmaF-4759da plasma bovino
Piatto di coltura cellulare con fondo in vetro da 35 mmWorld Precision InstrumentsFD35-100Piatto di coltura cellulare con fondo in vetro di qualità ottica per l'imaging
Gelatina da pelle bovinaSubstrato di coltura cellulareSigmaG9391
salina bilanciata di HankLife Technologies14025076
Perossido di idrogenoMerck107298
Medium-199Life Technologies11150-059terreno cellulare privo di siero
MetioninaSigmaM9500estingue gli ossidanti cloruranti generati dalla mieloperossidasi
Mieloperossidasi, leucociti polimorfonucleati umaniMillipore475911
RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance systemACEA Biosciences / Rocheè costituito da analizzatore RTCA, stazione MP RTCA (piastra multipla) e unità di controllo RTCA
tripsina-EDTA (0,5%)Gibco15400-054 
Soluzione

Riferimenti

  1. Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
  2. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
  3. Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies. Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).
  4. Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).
  5. Baldus, S., et al. Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration. J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).
  6. Baldus, S., et al. Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases. Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).
  7. Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).
  8. Rees, M. D., et al. Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan. Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).
  9. Rees, M. D., et al. Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells. Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).
  10. Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).
  11. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
  12. Vissers, M. C., Thomas, C. Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix. Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).
  13. Ziv, N. E., Schiller, J. Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells. CSH Protoc. 2007, (2007).
  14. Kennett, E. C., et al. Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains. Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).
  15. Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics. Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).
  16. Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment. Nat Methods. 6, 211-213 (2009).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Cellule endotelialimieloperossidasirivestimento con fibronectinaimaging time-lapsecontrasto di interferenza differenzialemisurazioni dell'indice cellulare
Utilizzando impedenza Cell-substrato e imaging cellulare dal vivo per misurare i cambiamenti in tempo reale in Cellular Adesione e De-adesione indotta da Matrix Modifica
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.