Articolo metodologico

Utilizzando impedenza Cell-substrato e imaging cellulare dal vivo per misurare i cambiamenti in tempo reale in Cellular Adesione e De-adesione indotta da Matrix Modifica

DOI:

10.3791/52423

⸱

19 febbraio 2015

 , 
1Centre for Vascular Research, University of New South Wales, 2School of Medical Sciences, University of New South Wales

In questo articolo

Sommario

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Qui, vi presentiamo un protocollo per quantificare continuamente i processi di adesione cellulare e de-adesione con alta risoluzione temporale in modo non invasivo per impedenza cellule-substrato e imaging cellulare dal vivo analisi. Questi approcci rivelano le dinamiche dei processi di adesione cellulare / de-adesione innescato da modifica della matrice e la loro relazione temporale con gli eventi di segnalazione adesione-dipendente.

Abstract

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Adesione cellulare matrice gioca un ruolo chiave nel controllo della morfologia cellulare e di segnalazione. Stimoli che sconvolgono l'adesione cellula-matrice (ad esempio, la mieloperossidasi e altri ossidanti matrice-modifica / enzimi rilasciati durante l'infiammazione) sono implicati nella innescare cambiamenti patologici in funzione cellulare, fenotipo e la vitalità in una serie di malattie. Qui, descriviamo come impedenza cell-substrato e approcci di imaging cellulare dal vivo possono essere facilmente impiegati per quantificare con precisione i cambiamenti in tempo reale di adesione cellulare e de-adesione indotta da modifiche alla matrice (utilizzando cellule endoteliali e la mieloperossidasi come stimolo matrice modificando fisiopatologico) con alta risoluzione temporale e in modo non invasivo. Il sistema di impedenza della cella-substrato xCELLigence quantifica continuamente la zona di adesione cellula-matrice misurando l'impedenza elettrica all'interfaccia cellula-substrato in cellule cresciute su array di microelettrodi oro. L'analisi delle immagini di time-lapse differenziale film contrasto interferenze quantifica variazione dell'area proiettata di singole cellule nel tempo, rappresentano variazioni dell'area di contatto cellula-matrice. Entrambe le tecniche quantificare con precisione rapidi cambiamenti dei processi di adesione cellulare e de-adesione. Impedenza Cell-substrato su array microelettrodo biosensori fornisce una piattaforma per le misure robusta, ad alta produttività. Imaging cellulare dal vivo analizza fornire ulteriori dettagli circa la natura e la dinamica dei cambiamenti morfologici quantificati da misure di impedenza cella-substrato. Questi approcci complementari forniscono nuove preziose intuizioni come mieloperossidasi-catalizzata ossidativo modifica dei componenti della matrice extracellulare subcellulari innesca rapidi cambiamenti di adesione cellulare, la morfologia e di segnalazione nelle cellule endoteliali. Questi approcci sono applicabili per studiare dinamiche di adesione cellulare in risposta ad altri stimoli matrice modificanti e in cellule aderenti correlate (ad esempio, cellule epiteliali) anche.

Introduzione

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Contatti adesivi stabili tra le cellule e la loro matrice extracellulare che circonda sono necessari per mantenere l'omeostasi tissutale. Per esempio, l'adesione delle cellule endoteliali alla matrice sottoendoteliale nei vasi sanguigni gioca un ruolo critico nel mantenere l'integrità dello strato endoteliale e la sua funzione omeostatica come normativo, semi-permeabile barriera vascolare 1. Il citoscheletro actina è accoppiato meccanicamente ad adesivo molecole della matrice in siti di adesione cellula-matrice e contatti adesivo all'interfaccia cellula-matrice svolgere un ruolo importante nel determinare la posizione della membrana cellula....

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Protocollo

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1. Generale Endothelial Cell Culture

  1. Culture bovina cellule endoteliali aortiche (passaggi 4-9) su gelatina rivestita fiasche di coltura tissutale (rivestimento superficiale coltura tissutale con 0,1% w / v di gelatina in PBS a temperatura ambiente per 15 min) in EGM-2 supporti (con l'EGM-2 proiettile kit contenente siero bovino fetale 5%, fattori di crescita e tutti gli integratori fornite dal produttore, tranne idrocortisone).
  2. Quando le cellule sono quasi confluenti (circa 3 giorni dopo la semina dopo un 1: 4 split), cellule raccolto mediante trattamento con 0,05% w / v tripsina / 0.02% w / v EDTA in PBS a 37 ° C. Dopo la maggioranza delle ....

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Risultati

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In tempo reale quantificazione delle cellule endoteliali de-adesione da fibronectina in risposta ad ossidazione fibronectina MPO-mediata (Esperimento 2). La semina di sospensioni cellulari endoteliali su nativo (MPO gratuito) fibronectina o MPO-cuscinetto risultati fibronectina in allegato cellule massima e la diffusione in 2 ore, come giudicato da un plateauing di valori di indice cella nella misure di impedenza substrato cellulare (Figura 3A). Questa fase iniziale di adesione delle ce.......

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Discussione

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Adesione cellula-matrice e processi de-adesione possono essere quantificati con precisione in tempo reale ad alta risoluzione temporale con impedenza di cellule-substrato e imaging cellulare dal vivo analisi. Questi approcci in tempo reale forniscono un grande vantaggio rispetto end-point analisi di adesione cellulare, che offrono scarsa risoluzione temporale. Per quantificare con precisione le risposte de-adesione rapide con alta risoluzione temporale, queste analisi possono fornire spunti critici in modalità morfologi.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno informativa da fare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato da un National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) e, in parte, da un UNSW Faculty Faculty Research Grant (MDR).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Array di microelettrodi di impedenza cellula-substrato d'oro a 96 pozzettiACEA Biosciences / RocheE-Plate 96piastra monouso utilizzata per l'esecuzione di saggi basati su cellule sul sistema xCELLigence
blebbistatinSigmaB0560inibitore selettivo delle
cellule endoteliali aortiche bovine non muscolari miosina-II, crioconservate LonzaBW-6001
Albumina sierica bovinaSigma05470
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162Kit di terreni di crescita di cellule endoteliali
Fibronectina, polvere liofilizzataSigmaF-4759da plasma bovino
Piatto di coltura cellulare con fondo in vetro da 35 mmWorld Precision InstrumentsFD35-100Piatto di coltura cellulare con fondo in vetro di qualità ottica per l'imaging
Gelatina da pelle bovinaSubstrato di coltura cellulareSigmaG9391
salina bilanciata di HankLife Technologies14025076
Perossido di idrogenoMerck107298
Medium-199Life Technologies11150-059terreno cellulare privo di siero
MetioninaSigmaM9500estingue gli ossidanti cloruranti generati dalla mieloperossidasi
Mieloperossidasi, leucociti polimorfonucleati umaniMillipore475911
RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance systemACEA Biosciences / Rocheè costituito da analizzatore RTCA, stazione MP RTCA (piastra multipla) e unità di controllo RTCA
tripsina-EDTA (0,5%)Gibco15400-054 
Soluzione

Riferimenti

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  1. Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
  2. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
  3. Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J.....

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Cellule endotelialimieloperossidasirivestimento con fibronectinaimaging time lapsecontrasto di interferenza differenzialemisurazioni dell indice cellulare

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