Articolo metodologico

Nucleocapside Ricottura-Mediated elettroforesi (NAME) Assay permette la rapida identificazione del virus HIV-1 nucleocapside Inibitori

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DOI:

10.3791/52474

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19 gennaio 2015

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1Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, University of Padova, 2The RNA Institute, SUNY Albany

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive NAME, un test che permette la rapida identificazione di molecole in grado di inibire in vitro le attività chaperoniche della proteina nucleocapside HIV-1.

Abstract

RNA o DNA piegato in stabile ripiegamento tridimensionale sono interessanti bersagli per lo sviluppo di antitumorali o antivirali. In caso di HIV-1, proteine ​​virali coinvolte nella regolazione dell'attività virus riconoscono numerosi acidi nucleici. La proteina nucleocapsidica NCp7 (NC) è una proteina chiave che regola diversi processi durante la replicazione del virus. NC è infatti un chaperone destabilizzare le strutture secondarie di RNA e DNA e facilitando la loro ricottura. L'inattivazione di NC è un nuovo approccio e un target interessante per la terapia anti-HIV. Il N ucleocapsid A nnealing- M ediated E lectrophoresis (NAME) test è stato sviluppato per identificare molecole in grado di inibire la fusione e ricottura di RNA e DNA ripiegato in conformazioni tridimensionali termodinamicamente stabili, come le strutture di tornanti TAR ed elementi CTAR di HIV, per la proteina del nucleocapside di HIV-1. Il nuovo test utilizza sia il rericombinante o la proteina sintetica, e oligonucleotidi senza la necessità della loro etichettatura precedente. L'analisi dei risultati è ottenuta mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide standard (PAGE) seguita da convenzionale colorazione acido nucleico. Il protocollo riportato in questo lavoro descrive come eseguire il test NAME con la proteina full-length o la sua versione troncata privo del dominio N-terminale di base, sia competente come acidi nucleici accompagnatori, e come valutare l'inibizione dell'attività chaperone NC da un threading intercalante. Inoltre, NAME può essere eseguita in due modi differenti, utile per ottenere indicazioni sul meccanismo putativo di azione degli inibitori NC identificati.

Introduzione

La proteina nucleocapsidica NCp7 (NC) del virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) è un piccolo, proteina basica che è strettamente associata a RNA genomico del virus infettivo maturo, giocando un ruolo fondamentale nella replicazione del virus come cofattore durante la trascrizione inversa , riconoscimento genoma, e l'imballaggio. 1-3 NC funge da chaperon acido nucleico che catalizza la destabilizzazione strutture stabili acidi nucleici e la ricottura di sequenze complementari. La sua attività di acido nucleico aggregazione risiede principalmente nei 11 aminoacidi dominio N-terminale, mentre il duplex destabilizzare l'attività è stato mappato le proprie strutture delle dita di zinco (12-55 peptide). 4 La proteina carica positiva abbassa la barriera elettrostatica della reazione di ricottura e aumenta la velocità con cui due sequenze complementari distinte si uniscono.

Gli acidi nucleici piegato in conformazione stabile richiedono le attività chaperone di NC per agevolarnee loro ricottura 5 Ciò è particolarmente importante in trascrizione inversa, dove NC è critica in eventi di trasferimento filo:. nel trasferimento meno strand, fermata DNA strand meno, solo retrotrascritto, deve essere trasferito e ricotto ad una sequenza complementare nella regione R alla 'fine del genoma RNA 3 modello. 6 Sebbene termodinamicamente favorita, questa reazione non si verifica ampiamente in assenza di NC per la presenza della struttura stabile dell'attivazione trans regione sensibile (TAR) RNA nelle regioni R, che deve essere associato alla sua copia di DNA (CTAR DNA). 7 regioni CTAR e TAR sono, infatti, altamente strutturato con una caratteristica conformazione stem-loop. Proteine ​​NC denatura questi tornanti, e promuove minus-strand trasferimento aumentando il tasso di ricottura intermolecolare tra i filamenti complementari di acidi nucleici. Il meccanismo di NC ricottura del TAR e CTAR è stato oggetto di studi approfonditi e dedescritto come TAR ricottura test in diversi articoli di ricerca e lo schema proposto è rappresentato in ottime recensioni. 8-11 Riassumendo, NC destabilizza la struttura secondaria di RNA stabile come TAR-RNA, destabilizza la struttura secondaria della sua sequenza complementare, CTAR-DNA , e promuove la reazione ricottura di RNA / DNA che porta al TAR / CTAR formazione heteroduplex. 10,11 Come risultato, il passo strand transfer durante la replicazione dell'HIV è favorita. 12

NC è un bersaglio attraente per lo sviluppo di nuovi agenti antivirali in quanto l'interferenza potenziale indotta da piccole molecole verso NC comporterebbe una riduzione della trascrizione inversa del genoma virale come conseguenza di un'attività NC compromessa. 2,13 Questo approccio potrebbe in ultima analisi, portare allo sviluppo di farmaci anti-HIV di successo. Nel corso di uno screening per NC inibitori 14 abbiamo sviluppato un saggio basandosi sulle proprietà ben notedi nucleocapside di destabilizzare in modo efficiente e ricottura oligonucleotidi complementari. 10,11 abbiamo chiamato N ucleocapsid A nnealing- M ediated E lectrophoresis (NAME) test. Assay NAME utilizza NC per mediare la ricottura tra le copie stabilmente strutturati di acidi nucleici complementari, nel nostro caso del oligonucleotide corrispondente alla parte apicale di una sequenza TAR-RNA con la sua sequenza di DNA complementare (CTAR) a dare il TAR ibrida / CTAR heteroduplex . L'analisi del TAR / CTAR reazione ricottura in presenza di NC può essere indagata mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo (PAGE).

Questo protocollo illustra come eseguire il saggio NAME per ricottura rapidamente a temperatura ambiente oligonucleotidi piegate in strutture stabili forcella, come analizzare i risultati della reazione e possibili guasti dell'esperimento. Etichettatura radioattivo dell'acido nucleico non è richiesto, e detectisu bande oligonucleotide può essere eseguita con metodi convenzionali di colorazione. Il dosaggio, che impiega sia il ricombinante proteina intera o una versione troncata sintetica di NC, permette di identificare intercalanti filettatura inibenti NC, un'attività mostrato correlazione con forte legame al DNA e RNA. 14

Protocollo

1. Preparazione del materiale, acidi nucleici e proteine

  1. Acidi nucleici
    1. Autoclave i tubi da 1,5 ml e memorizzarli in un contenitore sterile. Eseguire ogni passo con puntali con filtro sterili per eliminare gli agenti contaminanti cioè nucleasi dal consumo di laboratorio.
    2. Preparare Tris-HCl 10 mM a pH 7,5 in acqua DEPC trattati e filtrare la soluzione con un filtro di dimensioni 0,22 micron pori.
    3. NOTA: Il oligonucleotide chiamato "TAR" corrisponde alla sequenza RNA breve (29-mer) 5'-GGCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGCC-3 '15 mentre CTAR è la sua sequenza complementare DNA 5'-GGCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATCTGCC-3'.
      1. Solubilizzare sia TAR e CTAR nel buffer Tris di cui sopra (1.1.2.) Per fare 100 micron soluzioni stock. Conservare la soluzione di magazzino CTAR a -20 ° C (aliquote può essere conservato per mesi in queste condizioni). Per la conservazione a lungo termine di RNA, fare 20 aliquote microlitri del TARsoluzione madre, asciugare ciascuna aliquota mediante un concentratore centrifuga a vuoto e conservare a -80 ° C. Appena prima dell'uso, risospendere ciascuna aliquota TAR in 20 acqua DEPC trattati microlitri.
        NOTA: aliquote TAR di lavoro può essere conservato a -20 ° C per due settimane.
  2. Proteine ​​e NC (12-55) NC peptide
    1. Preparare il full-length proteina ricombinante NC come riportato. 16 Conservare la soluzione di riserva in aliquote a -20 ° C. Determinare la concentrazione di proteine ​​esatta con uno spettrofotometro UV-Vis con un coefficiente di estinzione a 280 nm di 6.410 M -1 cm -1.
    2. Risospendere il sintetico (12-55) NC peptide in Tris-HCl 10 mM pH 7.5 e conservare la soluzione di riserva in aliquote a -20 ° C. Determinare la concentrazione di peptide corretta su uno spettrofotometro UV-Vis utilizzando un coefficiente di estinzione a 280 nm di 5.700 M -1 cm -1.
      NOTA: La (12-55) NC peptide è stato ottenuto HPLC purificato e lyophilized su una soluzione contenente due equivalenti di cloruro di zinco.
  3. Composto 1
    1. Pesare circa 1 mg del composto liofilizzato 1 utilizzando una bilancia analitica e sciogliere in 100 ml di 100% DMSO, opportunamente pesati, per ottenere una concentrazione elevata (≈10 mM) soluzione madre. Determinare la concentrazione del composto esatto su un UV-Vis spettrofotometro con il suo coefficiente di estinzione (a 354 nm: 11.387 M -1 cm -1). Conservare la soluzione madre al buio a -20 ° C prima dell'uso.

2. Creazione di Gel Apparecchi e Casting del Gel

  1. Per impostare il gel, lavare due piatti (uno lungo e uno corto) con il 70% di etanolo, lasciarli asciugare e quindi inserire due distanziali 1 mm lungo i bordi lunghi della piastra lungo; coprirlo con breve piatto, e assicuri allineare le due piastre a fondo.
  2. Per lanciare il gel, seguire le istruzioni fornite dal suppLier (diversi fornitori, usare un apparato leggermente diverso; pinze a sandwich e pile sono forniti da ciascun apparato casting). In tutti i casi, essere sicuri che morsetti, faraglioni e le guarnizioni sono pulite, e rimuovere le tracce di acrilamide lasciati dagli utenti precedenti.
  3. Posizionare il sandwich di gel assemblato nello stand casting e seguire le istruzioni specifiche da parte del fornitore.
    NOTA: Solitamente una guarnizione siliconica pulita nella parte inferiore della scanalatura colata garantisce una buona tenuta e aiuta a evitare perdite quando si versa il gel.
  4. Per controllare le perdite, versare acqua distillata con una pipetta tra le lastre di vetro. Aggiungere acqua per riempire il panino e attendere qualche minuto per assicurarsi che non ci siano perdite. Se il sandwich è montato correttamente, rimuovere l'acqua e inserire una carta da filtro tra i due bicchieri per asciugare i bicchieri. Rimuovere la carta e ora il panino è pronto per il gel casting.
  5. Versare il gel a temperatura ambiente (RT, 25 ° C). Poiché poliacrilammide è altamente neurotossico, indossare guanti. Noie continui 12% gel di poliacrilammide in non-denaturazione condizioni (nativi) per eseguire test NAME.
    1. Preparare la soluzione di gel al 12%: mescolare 12 ml di 40% acrilammide / bisacrilammide soluzione (19/1), 4 ml TBE 10x tampone (10x: Tris-HCl 890 mm, 890 mm borato, EDTA 20 mm) ed acqua 24 ml MilliQ . Aggiungere 400 microlitri APS e 50 ml TEMED immediatamente prima dell'uso. Mescolare la soluzione e rapidamente utilizzare una pipetta per versare la soluzione giù tra le lastre di vetro. Introdurre il pettine tra le lastre di vetro, evitando bolle. Aggiungere la soluzione di gel per riempire completamente il panino.
  6. Lasciate che il gel polimerizzare per 45 minuti a 1 ora. Immediatamente prima del caricamento del campione, rimuovere il pettine lentamente e sciacquare i pozzetti a fondo con acqua distillata.
  7. Dopo le fasi di polimerizzazione e pozzi risciacquo, seguire le istruzioni specifiche da parte del fornitore per posizionare il sandwich di gel nell'apparato per elettroforesi su gel verticale. Se un sistema di raffreddamento è presente, assicurarsi di collocare il sistema gel nel correct posizione del nucleo raffreddamento.
  8. Se il sistema è progettato per gestire più di un gel, ma solo un gel deve essere eseguito, collegare un sandwich di gel come buffer di sbarramento al nucleo raffreddamento sul lato opposto per formare la camera di completa tampone superiore.
    NOTA: se la diga non è posizionato correttamente, il buffer superiore perderà probabilmente fermare la corsa del gel.
  9. Preparare 2,5 L di TBE tampone di corsa (1x: Tris-HCl 89 mM, borato 89 mm, EDTA 2 mM) in acqua deionizzata. Distinguono circa 500 ml di tampone TBE per la camera tampone superiore e versare il resto nella camera polmone inferiore. Versare il restante tampone TBE 500 ml nella camera tampone superiore.
  10. Posizionare il coperchio sulla parte superiore della camera polmone inferiore, in modo che l'anodo e il catodo sono nella posizione appropriata.
  11. Collegare il nucleo di raffreddamento, se presente, ad un rubinetto dell'acqua utilizzando tubi. Riempire il nucleo con acqua di rubinetto, che fungerà da dissipatore di calore durante l'elettroforesi, e lasciare che l'acqua del rubinetto circolare attraverso il nucleo durante elettirophoresis.

3. nucleocapside Ricottura-mediata elettroforesi (NAME) Assay

  1. Preparazione del buffer
    1. Preparare tampone TNMG (1x: Tris-HCl 10 mM, NaCl 20 mM, Mg (ClO 4) 2 1 mM, pH 7,5) acqua in DEPC trattati e filtrare la soluzione con un filtro di dimensioni 0,22 micron pori.
      NOTA: Tampone TNMG può essere conservato a 4 ° C fino a 7 giorni. Per ottenere i migliori pieghevoli e ricottura risultati, si consiglia l'uso di buffer appena fatte.
    2. Preparare il tampone contenente SDS gel Loading (GLB SDS: Tris-HCl 100 mM, EDTA 4 mM, 50% w / v glicerolo, 2% w / v SDS, 0,05% w / v blu di bromofenolo) in acqua trattata con DEPC.
      NOTA: GLB aiuta a tenere traccia di quanto i campioni oligonucleotidi sono in esecuzione nel sistema gel e permette di affondare i campioni nel gel. L'aggiunta di SDS al GLB è una fase critica per il successo ottimale di dosaggio NAME. Se questo passaggio non è seguita, non è possibile distinguere banda acidi nucleici nella gel Sistema (Figura 2).
  2. Controlla la preparazione
    1. Diluire serialmente gli oligonucleotidi soluzioni madre e utilizzando appena fatte 10 mM soluzioni per preparare 10 ml di una soluzione 1 mM di TAR. Preparare nello stesso modo, separatamente, 10 ml di una 1 mM in tampone CTAR TNMG 1x. Riscaldare ogni tubo a 95 ° C per 5 minuti e poi lasciare raffreddare a RT perché TAR e CTAR ad assumere le loro strutture stem-rigonfiamento-loop.
    2. Preparare 1 micron soluzione TAR ibrida / CTAR come controllo. Mescolare 1 ml di 10 mM TAR con 1 ml di 10 mM CTAR in TNMG 1x, in un volume totale di 10 microlitri. Denaturare gli oligonucleotidi riscaldando il tubo a 95 ° C per 5 minuti e lasciare raffreddare lentamente a RT affinché TAR per ricottura alla sua sequenza complementare CTAR e per formare il doppio filamento ibrido TAR / CTAR.
    3. Quando le soluzioni sono raffreddati a RT, eseguire una centrifugazione breve-spin. Aggiungere 3 ml di GLB SDS, pipetta eacsoluzione h all'interno del tubo 3 volte e mettere il tubo in ghiaccio. Mantenere i campioni di controllo costante sul ghiaccio fino alla fase di carico.
  3. I campioni di preparazione per l'analisi delle proteine ​​e NC (12-55) NC attività peptide
    1. Utilizzare 2,5 ml di soluzione appena fatto oligonucleotide 4 micron per ogni campione. Preparare sempre una piccola quantità in eccesso di ogni soluzione per evitare errori di pipettamento. Piegatura 32,5 ml di 4 mM soluzione TAR e, separatamente, di CTAR in TNMG 1x tampone come riportato per la preparazione controlli suddetto (passo 3.2.1.).
    2. Diluire la soluzione madre sia di proteine ​​e NC (12-55) NC peptide a 80 micron soluzione con acqua MilliQ.
    3. Quando le soluzioni TAR e CTAR vengono raffreddati a RT, eseguire una centrifugazione a breve giro di entrambi i tubi e avviare la preparazione dei tubi campioni.
    4. Preparare 12 vuoti da 0,5 ml tubi in autoclave. Mettere 3 file di 4 tubi nel rack per campioni di laboratorio. Ogni riga indica rispettivamente i campioni da analizzare the full-length proteina NC, i campioni senza proteine ​​e campioni per analizzare il (12-55) NC attività di peptide.
    5. Sostituire sempre consigli ogni volta viene utilizzato un reagente diverso.
    6. Aggiungere in ciascun tubo di 2,5 ml di TAR piegato e 2,5 ml di piegato CTAR. Aggiungere acqua trattata con DEPC 4 microlitri ai campioni per l'analisi di NC e (12-55) NC. Aggiungere acqua DEPC trattati con 5 microlitri agli altri campioni.
    7. Aggiungere 1 ml di 80 micron NC o 1 ml di 80 micron (12-55) NC per i campioni per, rispettivamente, NC o (12-55) Analisi NC.
    8. Aggiungere immediatamente 3 ml di GLB SDS al tempo 0 min campioni (segnalato come 0 'nella figura 1), la soluzione pipettando all'interno di ogni tubo 3 volte, e infine mettere la provetta in ghiaccio. Ripetere questo passaggio per tutti i campioni ed i controlli. Mantenere i campioni costante sul ghiaccio fino alla fase di carico.
    9. Dopo 15 min, 30 min e 1 ora di incubazione a RT, aggiungere 3 ml di GLB SDS, pipetta la soluzione all'interno each tubo 3 volte e mettere il tubo in ghiaccio. Ripetere questo passaggio per tutti i campioni ed i controlli, rispettivamente, e tenere in ghiaccio fino alla fase di carico.
    10. Rimuovere il coperchio dell'apparecchiatura gel. Carico 13 microlitri di ciascun campione nei pozzetti formata come precedentemente descritto per fusione del gel con un pettine ben formatura. Caricare i campioni secondo l'ordine riportato in Figura 1.
    11. Sostituire il coperchio dell'apparecchiatura gel. Attaccare i cavi dell'apparato gel all'alimentatore. Verificare che gli elettrodi sono collegati nelle fessure corrette di alimentazione.
    12. Accendere ed eseguire il gel per 2 ore e 30 minuti ad una tensione costante di 200 V, fino a quando il colorante è migrato a 1,5 cm sopra il fondo del gel.
  4. La preparazione del campione per analizzare l'attività antrachinone su NC e (12-55) NC
    1. Diluire la soluzione stock compound 1. Preparare 10 ml di 500 micron, 250 micron, 50 micron, la diluizione 5 micron di composto 1 in acqua MilliQ.
    2. Preparare i campioni di controllo, come riportato in precedenza (punto 3.2.).
    3. Utilizzare 2,5 ml di soluzione appena fatto oligonucleotide 4 micron per ogni campione. Preparare sempre una piccola quantità in eccesso di ogni soluzione per evitare errori di pipettamento. Piegare 27,5 ml di 4 micron soluzione di TAR e, separatamente, di CTAR in tampone TNMG 1x come sopra menzionato (punto 3.2.1.).
    4. Diluire la soluzione madre sia di proteine ​​e NC (12-55) NC peptide di 80 micron soluzione in acqua.
    5. Quando le soluzioni TAR e CTAR vengono raffreddati a RT, eseguire una centrifugazione a breve giro di entrambi i tubi e avviare la preparazione dei campioni.
    6. Preparare 20 vuoti da 0,5 ml tubi in autoclave. Mettere 2 file di 10 tubi ciascuno nel rack per campioni di laboratorio.
    7. Sostituire sempre consigli ogni volta viene utilizzato un reagente diverso.
    8. Aggiungere ogni tubo della prima fila con 2,5 ml di TAR piegato. Aggiungere ogni tubo della seconda fila con 2,5 ml di piegato CTAR.
    9. Aggiungere 2 ml di composto appropriata 1 di diluizione (concentrazioni crescenti dai 5 micron a diluizione 500 micron) al TAR e al CTAR. Sostituire composto con acqua nei campioni per l'analisi di NC e (12-55) NC in assenza del composto. Incubare i campioni per 15 minuti a RT.
    10. Dopo 15 min di incubazione, miscelare i campioni CTAR (tubi di seconda fila) con i campioni corrispondenti TAR (tubi di prima fila).
    11. Aggiungere 1 ml di 80 micron NC o 1 ml di 80 micron (12-55) NC ai campioni di NC o (12-55) analisi NC, rispettivamente.
    12. Dopo 15 min di incubazione, aggiungere 3 ml di GLB SDS, pipetta ogni tubo 3 volte e mettere il tubo in ghiaccio. Ripetere questo passaggio, rispettivamente, con i campioni di NC e (12-55) Analisi NC. Mantenere i campioni costante sul ghiaccio fino alla fase di carico.
    13. Rimuovere il coperchio dell'apparecchiatura gel. Caricare 13 ml di ciascun campione nei pozzetti. Caricare i campioni con la sequenza indicata in FigUre 3B.
    14. Sostituire il coperchio dell'apparecchiatura gel. Attaccare i cavi dell'apparato gel all'alimentatore. Verificare che gli elettrodi sono collegati nelle fessure corrette di alimentazione.
    15. Accendere ed eseguire il gel per 2 ore e 30 minuti ad una tensione costante di 200 V, fino a quando il colorante è migrato a 1,5 cm sopra il fondo del gel.
  5. Preparazione del campione: la modalità Oligo-preincubazione vs modalità NC-preincubazione
    1. Diluire il composto 1 soluzione madre. Preparare 10 ml di 500 micron, 250 micron, 50 micron, 5 micron di diluizione del composto 1 in acqua MilliQ.
    2. Preparare i campioni di controllo, come riportato in precedenza (punto 3.2.).
    3. Utilizzare 2,5 ml di soluzione di oligonucleotide 4 mM per ogni campione. Preparare sempre una piccola quantità in eccesso di ogni soluzione per evitare errori di pipettamento. Piegare 27,5 ml di 4 micron soluzione di TAR e, separatamente, di CTAR in tampone TNMG 1x come sopra accennato (punto 3.2.1.).
    4. Diluire la soluzione madre sia di proteine ​​e NC (12-55) NC peptide di 80 micron soluzione in acqua.
    5. Quando le soluzioni TAR e CTAR vengono raffreddati a RT, eseguire una centrifugazione a breve giro di entrambi i tubi e avviare la preparazione dei campioni.
    6. Sostituire sempre consigli ogni volta che i reagenti vengono modificate o se qualsiasi altro liquido o soluzione contenuta nella provetta di reazione viene toccato.
    7. Da questo passo assicurarsi di etichettare in modo chiaro e separare i campioni per le due diverse procedure di pre-incubazione.
      1. Modalità Oligo-preincubazione
        1. Preparare 10 vuoti da 0,5 ml tubi in autoclave. Mettere 2 file di 5 tubi nel rack per campioni di laboratorio.
        2. Aggiungere in ciascun tubo della prima fila 2.5 ml di TAR piegato. Aggiungere in ciascun tubo della seconda fila 2.5 ml di piegato CTAR.
        3. Aggiungere 2 ml di composto appropriata 1 di diluizione (concentrazioni crescenti dai 5 micron a diluizione 500 micron) al TAR e al CTAR.Sostituire composto con acqua nei campioni per l'analisi di NC in assenza del composto. Incubare i campioni per 15 minuti a RT.
        4. Dopo 15 min di incubazione, prendere i campioni CTAR (seconda fila) e metterli con i campioni corrispondenti TAR (prima fila).
        5. Aggiungere 1 ml di 80 mM NC a ciascun campione e incubare i campioni per 15 minuti a RT.
        6. Dopo 15 min di incubazione, aggiungere 3 ml di GLB SDS, pipetta ogni tubo 3 volte e mettere il tubo in ghiaccio. Mantenere i campioni costante sul ghiaccio fino alla fase di carico.
      2. NC-preincubazione mode
        1. Preparare 5 vuote 0,5 ml tubi autoclave e metterli nel rack per campioni di laboratorio.
        2. Aggiungere in ciascun tubo 4 microlitri del composto 1 di diluizione appropriata (crescente concentrazione dal 5 mM alla diluizione 500 mM). Sostituire composto con acqua nei campioni per l'analisi di NC in assenza del composto.
        3. Aggiungere in ogni provetta 1 ml di 80 μ; M NC e incubare i campioni per 15 minuti a temperatura ambiente.
        4. Mescolare 15 ml di TAR piegato con 15 ml di piegato CTAR in un tubo e utilizzare questa soluzione TAR + CTAR nella fase successiva.
        5. Dopo 15 min di incubazione, aggiungere a ciascun campione 5 ml della soluzione di miscela TAR + CTAR e incubare i campioni per 15 minuti a RT.
        6. Dopo 15 min di incubazione, aggiungere 3 ml di GLB SDS, pipetta ogni tubo 3 volte e mettere il tubo in ghiaccio. Mantenere i campioni costante sul ghiaccio fino alla fase di carico.
          NOTA: Dal punto 3.5.8 in poi, l'analisi può essere eseguita con tutti i campioni (curriculum da 3.5.7).
    8. Rimuovere il coperchio dell'apparecchiatura gel. Caricare 13 ml di ciascun campione nei pozzetti. Caricare i campioni secondo l'ordine riportato in Figura 4.
    9. Sostituire il coperchio dell'apparecchiatura gel. Attaccare i cavi dell'apparato gel all'alimentatore. Verificare che gli elettrodi sono collegati nelle fessure corrette della suppl poterey.
    10. Accendere ed eseguire il gel per 2 ore e 30 minuti ad una tensione costante di 200 V, fino a quando il colorante è migrato a 1,5 cm sopra il fondo del gel.

4. Rimozione Gel e Gel colorazione

  1. Dopo l'elettroforesi, spegnere l'alimentazione e scollegare i cavi elettrici. Chiudere il rubinetto dell'acqua del sistema di raffreddamento e scollegare i tubi dal nucleo.
  2. Rimuovere il coperchio, e, se il sistema è stato raffreddato, rimuovere il nucleo di raffreddamento e versare il tampone da entrambe le camere.
  3. Disassemblare delicatamente il gel sandwich dall'apparecchio e rimuovere tutti i morsetti dalle lastre di vetro. Per rimuovere il gel dalle piastre, premere uno dei distanziatori fuori al lato delle piastre e ruotarlo delicatamente per tirare e rimuove la lastra di vetro superiore. Afferrare due angoli del gel e sollevarlo delicatamente per rimuoverlo dal vetro.
  4. Porre il gel in un contenitore adatto con la soluzione colorante per acidi nucleici desiderata30-45 min sotto agitazione.
  5. Dopo la colorazione, mettere il gel su un transilluminatore sistema di imaging per rilevare acidi nucleici segnale di fluorescenza nel sistema gel.

Risultati

La Figura 1 mostra un risultato rappresentativo del saggio nucleocapside Annealing Mediated Electrophoresis (NAME), eseguito i) con la proteina ricombinante intera lunghezza, ii) senza la proteina, cioè miscelazione CTAR + TAR e incubazione per 1 ora a RT, e iii ) stesso test eseguito con (12-55) NC, un peptide sintetico privo dei 11 amminoacidi di dominio N-terminale. Il TAR pre-piegato e CTAR sono stati miscelati e la formazione del TAR heteroduplex ricotto / CTAR è stato controllato nella presenza del full-length ricombinante NC (corsie sinistra di figura 1), in assenza di proteine ​​(corsie centrali a figura 1 ), e in presenza delle troncate (12-55) NC peptidici (corsie di destra in figura 1). I controlli sono: piegati CTAR, piegati TAR, e ricotto ibrido (TAR / CTAR), ottenuta attraverso denaturazione termica delle strutture stabilmente piegato di TAR per CTAR seguito dal loro annealin lentag. 14

La capacità di NC di denaturare due sequenze di acido nucleico stabili nella helix heteroduplex esteso è evidente: la proteina NC full-length porta immediatamente alla formazione del TAR / CTAR ibrido: 0 'indica il tempo minimo passando tra aggiunta di NC i campioni e aggiunta di tampone di caricamento del gel, che ferma la reazione; formazione completa è già raggiunto dopo 15 'tempo di incubazione. L'aumento dell'intensità del heteroduplex ricotto parallela alla diminuzione dell'intensità dei CTAR e TAR oligonucleotidi piegate. La formazione heteroduplex si ottiene anche in presenza della forma troncata, cioè la (12-55) NC, confermando l'attività biologica del peptide sintetico. In assenza della proteina o del peptide formazione eteroduplex non si osserva, e TAR e oligonucleotidi CTAR non ricottura a temperatura ambiente nel heteroduplex (Figura 1). Intutti gli esperimenti, la rapida formazione di intermedi instabili ("complessi intermedi" in Figura 1) che diminuiscono nel tempo si osserva, coerentemente con il meccanismo proposto di scambio del filo attraverso le forcelle di CTAR e TAR fino gli acidi nucleici corretto ripiegamento. 17

Una possibile risoluzione dei problemi di questo esperimento è la mancanza di SDS nel buffer Gel Caricamento. In assenza di SDS in GLB l'esito della reazione è mostrato in figura 2 e confrontato con il risultato GLB + SDS. Il TAR pre-piegato e CTAR sono stati miscelati e incubati per 3 ore a temperatura ambiente di per 3 ore a 37 ° C con l'intera lunghezza proteina NC ricombinante. Dopo l'incubazione i campioni sono stati divisi in due: un tampone di caricamento metà gel senza SDS (GLB) è stato aggiunto, mentre per l'altra metà GLB era con SDS (GLB SDS). I campioni sono stati caricati sul gel, e la posizione delle bande acidi nucleici è stata visualizzata dopo il gel gestito datintura colorazione. Quando NC era presente, ma i campioni sono stati caricato con GLB, tutte le bande acidi nucleici sono stati spostati up: questo è previsto e indica un forte legame tra la proteina e gli acidi nucleici. I risultati con GLB SDS sono mostrati in estrema destra del gel: l'aggiunta di SDS denatura la proteina e rilascia gli acidi nucleici dal complesso stabile con la proteina, permettendo il confronto con i controlli.

Il dosaggio NAME viene utilizzato per valutare la capacità di filettatura intercalanti stabilizzare strutture di acido nucleico dinamiche e di inibire l'attività NC chaperone. 14 intercalanti filettatura sono molecole planari aromatici sostituiti da catene laterali voluminose situate nei siti opposti del sistema ad anello, come l'antrachinone mostrati nella Figura 3A. 18 Questi intercalanti sono in grado di infilare attraverso la doppia elica di acidi nucleici, infine localizzare le loro catene laterali in ciascuna scanalatura del doppioelica. 19,20

Figura 3B mostra i risultati del test NAME in presenza del composto 1, intercalante una filettatura noto, 18 in presenza di full-length NC o del peptide troncato. In entrambi i casi, la formazione dell'ibrido TAR / CTAR da NC viene ridotto aumentando la concentrazione del intercalante, mentre, allo stesso tempo, la quantità di catrame e aumenta CTAR. La forma troncata della proteina priva coda N-terminale (12-55NC) è più sensibile alla inibizione della sua attività: tale differenza è stata verificata con tutti i composti esaminati finora.

Il dosaggio NAME può essere eseguita in due modi, o pre-incubando il composto in esame con NC, seguita da aggiunta di oligonucleotidi piegate (modalità NC-preincubazione), o preincubando il composto di prova per 15 min con i substrati piegate acido nucleico , seguita da aggiunta di NC e un'ulteriore incubazione per 15 min (oligo-prModalità eincubation). Anche se il tempo totale di incubazione è la stessa nelle due diverse modalità, la preincubazione con gli oligonucleotidi piegate prima dell'aggiunta del NC permette più tempo per la filettatura dei intercalanti nell'acido nucleico piegato. Ciò si traduce in una stabilizzazione più forte delle loro strutture dinamiche e in un'inibizione facile attività chaperone NC. L'analisi del saggio NAME nelle due modalità migliora pertanto differenze nel meccanismo di azione degli inibitori NC, come mostrato in figura 4: quando il composto 1 è stato analizzato mediante NAME nel modo oligo-preincubazione (Figura 4, corsie a sinistra) mostra potente inibizione di ricottura NC-mediata, mentre l'inibizione molto più basso si osserva in modalità NC-preincubazione (Figura 4, corsie a destra). Si prega di notare che, per la determinazione delle concentrazioni inibitorie, mentre lo screening serie di composti correlati con questo test e in queste condizioni, ciascuno rienzemento deve essere eseguita almeno in triplicato utilizzando concentrazioni ravvicinati (in particolare intorno al valore IC 50). 14

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Figura 1:. NOME test con full-length NC e con il tronco (12-55) NC TAR Piegato e CTAR, ogni 1 micron, sono state incubate con ricombinante NC o con (12-55) NC (oligo / NC = 1 / 8) per 0 min, 15 min, 30 min e 1 ora. TAR e CTAR incubate in assenza di proteine ​​(0 min, 15 min, 30 min e 1 ora) sono stati utilizzati come controllo negativo. TAR piegato, piegato CTAR e il TAR ibrido / CTAR ottenuti dopo denaturazione termica seguita da sono stati utilizzati in vitro ricottura come controlli. Le reazioni sono state poi smesso di usare GLB SDS. I campioni sono stati risolti su un gel di poliacrilammide al 12% in TBE 1x; dopo elettroforesi acidi nucleici su gel erano macchiati e rilevato su un transilluminatore.

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Figura 2:. Effetto della SDS in tampone di gel di carico (GLB) nell'analisi TAR / CTAR ricottura da NC TAR e CTAR, già piegati in TNMG 1x, sono stati incubati con full-length ricombinanti NC (oligo / NC = 1/8) per 3 hr a temperatura ambiente oa 37 ° C. GLB o GLB SDS stati poi aggiunti ai campioni incubati con NC. Controlli: TAR, CTAR e il TAR ibrido ricotto / CTAR (ogni 1 micron). L'elettroforesi è stata eseguita utilizzando un gel di poliacrilammide al 12% in TBE 1x; dopo elettroforesi acidi nucleici su gel erano macchiati e rilevato su un transilluminatore. Questo dato è stato modificato dalla figura S4 di:. Sosic, A. et al Progettazione, sintesi e valutazione biologica di TAR e leganti CTAR come HIV-1 nucleocapside inibitori MedChemComm 4, 1388-1393, doi:. 10,1039 / c3md00212h (2013) .

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Figura 3: (A) Struttura chimica della filettatura intercalante 1. (B) Effetto di filettatura intercalante 1 valutata mediante test NAME. Piegato TAR e CTAR, ogni 1 mM, sono state incubate in presenza di concentrazioni indicate del composto 1 con il full-length NC o con il (12-55) NC, ogni 8 mM. TAR piegato, piegato CTAR e il TAR heteroduplex estesa / CTAR sono stati utilizzati come controlli. Le reazioni sono state poi smesso di usare GLB SDS. I campioni sono stati risolti su un gel di poliacrilammide al 12% in TBE 1x; dopo elettroforesi acidi nucleici su gel erano macchiati e rilevato su un transilluminatore.

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Figura 4: Oligo-preincubazione modalità versus NC-preincubazione: effetti sui test NOME oligo-preincubazione mod.e: TAR piegata e piegata CTAR, ogni 1 mM, sono state preincubate con le concentrazioni indicate di intercalante filettatura 1 per 15 min, e poi per altri 15 min in presenza del full-length NC (8 mM) NC-preincubazione. modalità: le concentrazioni indicate di intercalante filettatura 1 sono state preincubate con il full-length NC (8 mM) per 15 minuti, e poi per altri 15 min in presenza di TAR piegata e piegata CTAR, ogni 1 pM. TAR piegato, piegato CTAR e il TAR heteroduplex estesa / CTAR sono stati utilizzati come controlli. Tutte le reazioni sono state finalmente smesso di usare GLB SDS. I campioni sono stati risolti su un gel di poliacrilammide al 12% in TBE 1x; dopo elettroforesi acidi nucleici su gel erano macchiati e rilevato su un transilluminatore.

Discussione

NAME è un metodo che consente di determinare velocemente la inibizione dell'attività chaperone della proteina del nucleocapside di HIV-1, un target interessanti nella ricerca di nuovi farmaci anti-HIV. NC annealing veloce ea temperatura ambiente acidi nucleici cui pieghevole stabile altrimenti richiederebbero denaturazione termica ad alta temperatura seguito da un'attenta ricottura. L'analisi può essere eseguita sia con full-length NC o con l'troncato (12-55) NC: in entrambi i casi i due acidi nucleici (RNA e la sua copia di DNA complementare) vengono ricotti rapidamente. Questo è coerente con l'osservazione letteratura con il peptide troncato NC: ricottura viene avviata dallo scioglimento efficace dello stelo di CTAR seguita dalla interazione del suo ciclo apicale complementare, che è un sito di legame debole NC, con la sequenza complementare di TAR anello apicale, finendo attraverso diversi intermediari instabili ibrido ricotto esteso. 21

NC è un prot molto stabileein e pochi problemi mentre possono verificarsi l'esecuzione di NAME. E 'molto importante comunque aggiungere SDS appena fatte nel caricamento Gel Buffer utilizzato per arrestare la reazione: se ciò non viene raggiunto, il gel non mostrerà le bande di acido nucleico nelle posizioni corrette. Infatti, NC è una proteina legante acido nucleico, in modo che per visualizzare correttamente TAR / CTAR heteroduplex mediante elettroforesi su gel SDS deve essere presente nel gel Loading Buffer per denaturare la proteina e rilasciarlo dal suo complesso stretto con gli acidi nucleici. Questo è anche una possibile risoluzione dell'esperimento, cioè la formazione di bande spostato durante la corsa gel. Questo effetto è particolarmente evidente quando il full-length NC è stato impiegato, come in Figura 2, ed è collegato alla presenza della coda N-terminale fortemente basico, con un forte effetto aggregante sugli acidi nucleici.

La presenza della coda terminale di base rende la reazione ricottura più difficile essere inibita, come esposizionen in figura 3 con compound 1, una filettatura intercalante rappresentante, vale a dire un intercalante particolarmente efficace a stabilizzare le strutture stem-loop di TAR e di CTAR. Infatti, questo tipo di interazione con gli acidi nucleici è favorita quando rigonfiamenti e loop interrompono la continuità doppia elica, consentendo un più facile filettatura dei sostituenti ingombranti nelle coppie di basi. Stabilizzazione del TAR e CTAR da questi legante di acidi nucleici è stato precedentemente analizzato dalla determinazione dell'aumento della temperatura di fusione dei due oligonucleotidi. 14 Inoltre, l'aumento della temperatura di fusione correla con l'inibizione della ricottura catalizzata da HIV-1 NC, portando alla formazione ridotta del heteroduplex TAR / CTAR e indicando che intercalanti filettare sono un'interessante classe di leganti per strutture dinamiche di RNA, come l'elemento TAR. 14

Il meccanismo d'azione invocato per queste compounds può essere ulteriormente convalidati eseguendo il test NAME in diversi formati alternativi, come mostrato in figura 4: in caso di intercalanti inibizione della heteroduplex ricotto è aumentata quando il farmaco viene incubato con le due oligo piegate. Composti che agiscono con diversi meccanismi d'azione, quali leganti diretti della proteina NC, sarebbero meno colpiti dal modo preincubazione diverso. Test NAME eseguita in due metodi quindi potrebbe essere utilizzati per lo screening librerie di composti per l'identificazione di inibitori NC, e anche per valutare il meccanismo putativo di azione dei risultati positivi durante la ricerca di farmaci anti-HIV mirati a NC. Chiaramente, l'uso di queste tecniche solo quando rivendicate per uno specifico meccanismo di azione degli inibitori NC identificati non è sufficiente, e altri saggi biochimici idonei sono necessari per sostenere l'ipotesi di lavoro. 14

Infine, va sottolineato che il NOME utilizza altamenteenzimi purificati, sia ricombinanti o sintetici, dando preziose informazioni sulla inibizione "in vitro" di NC dai composti testati. Questa è la "forza e debolezza" del test: nome può ben integrare screening virtuale e modellazione molecolare approcci nelle fasi preliminari di programmi di scoperta della droga, che consente di costruire rapidamente e analizzare le relazioni struttura-attività e, infine, riorientare la sintesi e droga design. Tuttavia, come altri saggi biochimici utilizzati in progetti di sviluppo di farmaci in HIV, NAME non darà informazioni sugli effetti degli inibitori putativi nelle cellule infettate da virus.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unità per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) e dal MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
cTAR, oligo di DNA a 29 meri. Dissalato. Purificato HPLC.Metabion International AGImmagazzina la soluzione a magazzino a -20 gradi C 
TAR, 29-mer RNA oligo. Dissalato. HPLC purificato.   Metabion International AGConservare l'aliquota di magazzino a -80 ° C 
(12-55)peptide NCEspiKem srlConservare la soluzione madre a -20 gradi C
Provette da 1,5 mlEppendorf0030 120 086Autoclave prima dell'uso
Provette da 0,5 mlEppendorf0030 121 023Autoclave prima dell'uso
Puntali filtranti per biosfera 0,1-10 &; lSarstedt701,130,210
Puntali con filtro a biosfera 2-20 & micro; lSarstedt70.760.213
Puntali con filtro a biosfera 200  µ lSarstedt70.760.213
Filtro per siringa 0,22  µ mBiosigma srl51,798
EtanoloCarlo Erba414631
Sodio Dodecil SolfatoSigma-Aldrich71725-50G
Dimetil SolfossidoSigma-AldrichD8418-1L
Cloruro di SodioSigma-Aldrich71376-1KG
Acido BoricoSigma-AldrichB0252-2.5KG
Acido etilendiamminotetraaceticoSigma-AldrichE5134-500G
Perclorato di magnesioSigma-Aldrich222283-100GConservare il 1  Soluzione M a -20  ° C
gliceroloSigma-Aldrich49770-1L
blu di bromofenoloGE sanità scienze della vita17-1329-01
N,N′,N′ -TetrametiletilendiamminaSigma-AldrichT9281-100ML
Persolfato di ammonioSigma-AldrichA7460-500GPreparare la soluzione al 10% appena prima dell'uso
Acrilammide-bis soluzione pronta all'uso 40% (19:1)Merck Millipore1006401000Il poliacrilammide è altamente neurotossico: indossare guanti durante la colata di gel
Tris ultrapureApplichemA1086, 1000
Acqua trattata DEPCAmbionAM9922
Centrifuga 5415REppendorf22.621.408
Spettrometro NanoDrop 1000Spettrometro UV-VIS Thermo Scientific
Lambda 20Perkin Elmer
Protean II xi CellBio-Rad165-1803
PowerPac Alimentatore di baseBio-Rad164-5050
SybrGreen II RNA Gel ColorazioneLonza50523Effettuare la diluizione 1/10.000 in TBE 1x. Conservarlo al buio a 4  ° C per due settimane.
Sistema di imaging Geliance 600Perkin Elmer

Riferimenti

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