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Articolo metodologico

Tecniche per l'Analisi dei extracellulare vescicole citometria a flusso

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⸱

DOI:

10.3791/52484

⸱

17 marzo 2015

 ,  , 
1Blood Systems Research Institute, 2Department of Medicine, University of California, San Francisco, 3Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco

In questo articolo

Sommario

Esistono molti metodi diversi per la misurazione delle vescicole extracellulari (EV) con citometria a flusso (FCM). Molti aspetti devono essere considerati nella determinazione del metodo più appropriato da utilizzare. Due protocolli per i veicoli elettrici di misurazione sono presentate, utilizzando il rilevamento individuo o di un approccio basato tallone-.

Abstract

Extracellulare vescicole (EV) sono piccoli, vescicole membrana derivata presenti nei fluidi corporei che sono altamente coinvolti nella comunicazione cellula-cellula e aiutano a regolare una vasta gamma di processi biologici. Analisi dei veicoli elettrici che utilizzano citometria a flusso (FCM) è notoriamente difficile a causa delle loro piccole dimensioni e la mancanza di popolazioni distinte positive per i marcatori di interesse. Metodi di analisi EV, mentre notevolmente migliorato nel corso dell'ultimo decennio, sono ancora un work in progress. Purtroppo, non vi è alcun one-size-fits-all protocollo, e molti aspetti devono essere considerati nella determinazione del metodo più appropriato da utilizzare. Presentato qui sono diverse tecniche per i veicoli elettrici di trasformazione e di due protocolli per l'analisi i veicoli elettrici utilizzando il rilevamento individuo o di un approccio basato tallone-. I metodi descritti qui assisterà con eliminando gli aggregati anticorpali trovano comunemente in preparazioni commerciali, aumentando il rapporto segnale-rumore, e cancelli impostazione in un f razionaleashion che riduce al minimo il rilevamento della fluorescenza di fondo. Il primo protocollo utilizza un metodo di rilevamento individuo che è particolarmente adatto per l'analisi di un elevato volume di campioni clinici, mentre il secondo protocollo utilizza un approccio basato tallone a catturare e rilevare EVs piccole e exosomes.

Introduzione

Extracellulare vescicole (EV) sono piccoli, vescicole membrana derivata presenti nei fluidi corporei che sono altamente coinvolti nella comunicazione cellula-cellula e aiutano a regolare una vasta gamma di processi biologici. Analisi dei veicoli elettrici che utilizzano citometria a flusso (FCM) è notoriamente difficile a causa delle loro piccole dimensioni e la mancanza di popolazioni distinte positive per i marcatori di interesse. Metodi di analisi EV, mentre notevolmente migliorato nel corso dell'ultimo decennio, sono ancora un work in progress. Purtroppo, non vi è alcun one-size-fits-all protocollo, e molti aspetti devono essere considerati nella determinazione del metodo più appropriato da utilizzare. Presentato qui sono diverse tecniche per i veicoli elettrici di trasformazione e di due protocolli per l'analisi i veicoli elettrici utilizzando il rilevamento individuo o di un approccio basato tallone-. I metodi descritti qui assisterà con eliminando gli aggregati anticorpali trovano comunemente in preparazioni commerciali, aumentando il rapporto segnale-rumore, e cancelli impostazione in un f razionaleashion che riduce al minimo il rilevamento della fluorescenza di fondo. Il primo protocollo utilizza un metodo di rilevamento individuo che è particolarmente adatto per l'analisi di un elevato volume di campioni clinici, mentre il secondo protocollo utilizza un approccio basato tallone a catturare e rilevare EVs piccole e exosomes.

EV, noto anche come microparticelle, sono piccoli, vescicole membrana derivata presenti nei fluidi corporei che sono coinvolti nella comunicazione cellula-cellula e aiutano a regolare una vasta gamma di processi biologici 1. Attraverso l'espressione di diversi marcatori di superficie e / o il trasferimento diretto di materiale biologico, i veicoli elettrici sono in grado di alterare la funzione delle cellule riceventi di giocare sia attivare o sopprimere ruoli nella comunicazione intercellulare 2-4. Clinicamente, veicoli elettrici di derivazione piastrinica sono noti per avere una forte attività anticoagulante 5, mentre altri hanno dimostrato di contribuire a una vasta gamma di condizioni, dalla promozione del tumore metastasis 6 per la protezione contro le malattie 7. Veicoli elettrici possono essere classificati in categorie più piccole di vescicole cellulari di derivazione, come esosomi e microvescicole (MV), a seconda delle loro dimensioni e il meccanismo di generazione 8. La nomenclatura di sottopopolazioni vescicole cellule derivate continua ad essere un argomento di dibattito in corso 8,9, tuttavia, esosomi sono generalmente descritti come piccoli, 40 a 100 particelle nm derivati ​​da fusione endosomal con la membrana plasmatica, mentre MV sono più grandi da 100 a 1.000 particelle nm formate versando della membrana plasmatica 10. Qui, il termine generico "EV" verrà utilizzato per riferirsi a tutti i tipi di vescicole biologici extracellulari rilasciate dalle cellule.

Isolamento dei veicoli elettrici da sangue intero è una procedura a più fasi e molte variabili di elaborazione diversi hanno dimostrato di influenzare il contenuto EV, tra cui temperatura di conservazione e la durata 11,12, anticoagulante / conservante usato 13 eMetodo di centrifugazione utilizzato 14. La necessità di standardizzazione di queste variabili ha portato a raccomandazioni della Società Internazionale sulla Trombosi e lavorazione del sangue e isolamento EV comitato di normalizzazione (ISTH SSC) per la corretta Emostasi scientifici e le procedure di 15,16, ma non esiste alcun consenso tra i ricercatori sul protocollo ottimale utilizzare 12. La maggior parte d'accordo, tuttavia, che le variabili pre-analitiche strettamente controllate sono cruciali per dati accurati e riproducibili.

Per analizzare i veicoli elettrici, i ricercatori hanno utilizzato vari metodi, tra cui microscopia elettronica a trasmissione 17, microscopia elettronica a scansione 18,19, microscopia a forza atomica, luce dinamica spargendo 20,21 e occidentale blotting 22,23. Mentre FCM è il metodo di scelta per molti ricercatori 9,24 - 26 grazie alle sue elevate capacità di throughput, l'analisi dei veicoli elettrici che utilizzano FCM è statonotoriamente difficile a causa delle loro dimensioni e la mancanza di discrete popolazioni positive 27-32. Rispetto alle analisi di cellule, la piccola dimensione delle EVs risultati in 1) meno fluorescenza emessa a causa del minor numero di antigeni per particella e 2) la fattibilità limitato di post-macchia di lavaggio, che è necessaria per ridurre fluorescenza di fondo. Sfide comuni tra i ricercatori sono i segnali derivanti da aggregati di immunoglobuline 27,28 e di auto-aggregazione di anticorpi 29. Inoltre, i lunghi tempi di lavorazione e lunghe procedure di lavaggio / isolamento utilizzati da molti dei protocolli attuali 33,34 richiedono impegni di tempo più giorni per analizzare un piccolo numero di campioni, rendendoli meno che ideale per applicazioni ad alta produttività. Alcuni ricercatori rinunciano una fase di lavaggio del tutto, rendendo utilizzati tradizionalmente controlli negativi FCM, come una fluorescenza meno (FMO) e isotipi anticorpali inutile per valutare con precisione bacfluorescenza kground 30.

I nostri protocolli affrontano tre problemi comuni che possono impedire la corretta analisi FCM dei veicoli elettrici: segnali derivanti da aggregati di anticorpi e altri non-vescicole, difficoltà nel rimuovere l'anticorpo non legato, e la mancanza di popolazioni positive distinguibili. Le tecniche qui descritte assisterà con eliminando gli aggregati anticorpali trovano comunemente in preparazioni commerciali, aumentando il rapporto segnale-rumore, e impostando cancelli in modo razionale che minimizza rilevamento di fluorescenza di fondo. Due diversi metodi di rilevamento sono presentati qui: il primo protocollo utilizza un metodo di rilevamento individuo che è particolarmente adatto per l'analisi di un elevato volume di campioni clinici, mentre il secondo protocollo utilizza un approccio basato perline per catturare e rilevare EVs piccole e exosomes.

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Protocollo

NOTA: I seguenti protocolli sono stati eseguiti in conformità a tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano. Tutti i campioni soggetti umani sono stati testati in un comitato di revisione istituzionale (IRB) Protocollo -approvato e con il consenso informato dei soggetti.

1. METODO A: Individual Metodo di rilevazione

1.1) Elaborazione di Campione di sangue / isolamento dei veicoli elettrici

  1. Disegnare sangue dal donatore / paziente in due tubi di vetro da 10 ml contenente 1,5 ml di ACD-A o altra soluzione adatta anticoagulante e processo immediatamente (entro 30 min max) utilizzando il seguente protocollo centrifugazione differenziale 2-step.
    NOTA: Questo protocollo produrrà circa 10 ml di plasma povero di piastrine (PPP) dalle combinate ~ 17 ml di sangue disegnate. Se è necessaria più o meno PPP, il numero di tubi di sangue raccolto può essere regolata di conseguenza.
  2. Centrifugare i campioni a 1.500 xg per 10 min a RTper separare il plasma dal buffy coat e globuli rossi. Trasferire 1,2 ml aliquote del surnatante del plasma di 1,5 ml provette, facendo attenzione a non disturbare gli strati inferiori contenenti il ​​buffy coat e globuli rossi.
  3. Spin a 13.000 xg per 10 min a RT per rimuovere le piastrine e frammenti di cellule di grandi dimensioni. Trasferire con cura il PPP, lasciando dietro di sé 200 microlitri per non disturbare il pellet e aggiungere il PPP ad un nuovo tubo.
  4. A questo punto, utilizzare PPP immediatamente per l'analisi o il trasferimento in 1,0 ml aliquote di nuovi 1,5 ml provette e conservare a -80 ° C per un massimo di due anni per una successiva analisi (fare riferimento alla figura 1A per una panoramica).
  5. Se sono necessarie EV purificate per esperimenti funzionali, di trasferimento di 6 ml di PPP per un tubo ultracentrifuga e aggiungere 28 ml di 0,2 tampone fosfato micron filtrata (PBS). Spin per 60 min a 100.000 xg a temperatura ambiente usando una un'ultracentrifuga dotato di un rotore oscillante secchio. Aspirare il surnatante e risospendere EV pellasciate in 1,5 ml media.
    NOTA: Per la massima riproducibilità, i campioni di sangue devono essere trattati nel modo più coerente possibile dal donatore al donatore. Ogni variazione nel metodo di isolamento EV potrebbe avere un impatto significativo il numero e il tipo di veicoli elettrici rilevati.

1.2) la preparazione dei campioni per l'analisi

NOTA: Da questo punto in poi, i passaggi spiegare un protocollo ad alta produttività per analizzare 12 campioni per 14 marcatori in 3 pannelli. Tuttavia, altre combinazioni di anticorpi possono essere usati qui; il protocollo può essere adattato per studiare altre popolazioni EV sostituendo i marcatori suggeriti per quelli di interesse.

  1. Rimuovere 12 campioni dal congelatore (se conservato a -80 ° C) e scongelare a 37 ° C.
  2. Contenuti pipetta su e giù più volte per mescolare. Togliere 320 ml da ogni campione e aggiungere alla riga superiore di una piastra ben 96.
    NOTA: Un multi-ben pipetta larghezza regolabile è estremamente utile per questo e molti altri passi in tutto il culoay, soprattutto quando si analizzano più campioni contemporaneamente.

1.3) colorazione EV Campioni

  1. Prima della colorazione, filtrare tutti gli anticorpi (Abs) per rimuovere gli aggregati, che può causare segnali positivi.
    1. Anticorpi combinano per essere utilizzati in ciascuno dei 3 pannelli in 0,22 micron tubi filtranti centrifughi separati e centrifugare utilizzando un angolo fisso centrifuga singola velocità (~ 750 xg) a temperatura ambiente per 2 minuti, o fino a quando tutta la miscela Ab è passato attraverso il filtro e nessun liquido anticorpi rimane sulla superficie del filtro. Conservare cocktail Ab in frigorifero per un massimo di due settimane, ma ri-filtro ogni volta prima dell'uso.
  2. Aggiungere la quantità appropriata di miscela Ab filtrato ad ogni pozzetto nella fila 2 (ad esempio, i campioni in Pannello I sono colorate con 2 ml di ogni Ab, così si aggiunge un totale di 12 ml di cocktail Ab filtrato per bene remare 2). Fare riferimento alla Figura 1B per un contorno di mappa piatto suggerito. Ripetere questi aggiuntas per le righe sotto se più pannelli vengono eseguiti (qui, aggiungere 8 ml / pozzetto del cocktail Panel II alla riga 3 e 11 ml / pozzetto del cocktail Panel III a remare 4; fare riferimento a Materiali Lista per informazioni specifiche del pannello).
  3. Utilizzando la pipetta multicanale, miscelare i campioni PPP in riga 1 su e giù e trasferire 100 ul dai pozzi in riga 1 per i pozzi in fila 2. Mescolare su e giù. Cambia suggerimenti e ripetere, trasferendo 100 ml dalla fila 1 alla fila 3 e 4. Incubare a 4 ° C per 30 minuti.

1.4) lavaggio MT Campioni

  1. Rimuovere la piastra a 96 pozzetti da 4 ° C e trasferimento in cella di sicurezza biologica. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 220 ml di PBS / bene alle righe 6-8 (da utilizzare per il risciacquo / lavaggio dei pozzetti contenenti macchiato PPP).
  2. Trasferire il contenuto di ogni ben di tubi filtranti centrifughe pre-etichettati con la pipetta multicanale larghezza regolabile (per 12 campioni, con 3 pannelli di anticorpi, 12 x 3 = 36 tubi filtroessere necessario). Utilizzando gli stessi suggerimenti, togliere 200 ml di PBS dai filari di lavaggio e aggiungere ai pozzetti da cui PPP è stato appena rimosso.
  3. Mescolare su e giù per sciacquare i pozzi e trasferire la soluzione di risciacquo per gli stessi filtri a cui il PPP è stato precedentemente aggiunto. Chiudi cime di filtri centrifughi. Cambia suggerimenti.
  4. Ripetere questa operazione con i restanti campioni macchiati fino a quando tutti i campioni di PPP colorati sono stati trasferiti con le loro soluzioni di risciacquo ai filtri centrifughi.
  5. Trasferire i filtri centrifughi ad una centrifuga rotore fisso e centrifugare a 850 xg per 3 min a RT.
    NOTA: Assicurarsi che rimanga liquido sulle cime del filtro. Dopo centrifugazione, il filtro deve apparire "secco" senza strato fluido rimanente visibile sulla parte superiore. Sebbene improbabile, alcuni campioni PPP possono richiedere un tempo più lungo per centrifugazione spostare efficacemente attraverso il filtro.
  6. Rimuovere i tubi filtranti centrifughe e tornare alla cappa di sicurezza biologica.Utilizzando la pipetta multicanale, sospendere nuovamente le cime dei filtri in 300 ml di PBS. Trasferire il contenuto in sospensione al tubi pre-etichettati per l'immediata analisi FCM.
    NOTA: E 'molto importante mantenere la forza e il numero di depressioni pipetta stantuffo coerenti tra campioni per evitare variazioni campione a campione. Questo dovrebbe idealmente essere fatto utilizzando una pipetta elettronico che è stato programmato per pipettare su e giù un volume specifico (ad esempio, 280 microlitri) un numero esatto di volte (ad esempio, 8 volte) per ogni campione.

1.5) Citometro Setup

  1. Aprire il software FCM. Prima di sperimentare l'installazione, eseguire la calibrazione dello strumento quotidiano e configurazione utilizzando perline di impostazione strumento (seguendo le istruzioni del produttore).
  2. Se i campioni EV sono state colorate con più di un anticorpo e molteplici fluorocromi sono da misurare contemporaneamente, calcolare valori di compensazione come segue:
    1. Aggiungere 2 gocce di sfere di compensazione di preTubi -labeled (1 tubo per ogni anticorpi coniugati a fluorocromi) e aggiungere la quantità raccomandata di anticorpi. Aggiungere 2 gocce di sfere di compensazione negativi a un altro tubo da utilizzare come il controllo di compensazione senza macchia.
    2. Incubare a 4 ° C per 30 minuti, lavare con PBS e risospendere in 400 ml di PBS.
    3. Utilizzando il citofluorimetro software fornito con lo strumento, eseguire ogni tubo di compensazione e regolare tensioni fluorescenti per posizionare ogni picco di circa 10 4 su una scala logaritmica 5-decade. Assicurarsi che il picco di fluorescenza è più elevata (più luminoso) in un proprio canale fluorescente rispetto a tutti gli altri canali, e regolare le tensioni di parametri fluorescenti di nuovo se necessario. Eseguire ogni tubo bozzetto singolarmente macchiato e catturare almeno 5.000 eventi per il tubo.
    4. Selezionare "Experiment", scheda e selezionare "compensazione", quindi selezionare "Calcola compensazione" per applicare valori di compensazione per tutti i campioni.
  3. Impostare la dispersione in avanti (FSC) e side scatter (SSC) parametri di tensione per accedere scala e selezionare le soglie più basse consentite dal citometro (FSC = 200 e SSC = 200) per ciascuna.
  4. Durante l'esecuzione di un tubo di 0,22 micron filtrata PBS, regolare le tensioni FSC e SSC per i valori più alti che escludono la maggior parte del rumore di fondo (cioè, appena sotto la soglia di tensione a cui tasso di eventi supera 5 eventi / sec).
  5. Successivamente, eseguire una provetta contenente 0,2 micron - 1,0 micron perline, diluito in PBS, se necessario. In un FCS e SSC plot, disegnare un cancello intorno popolazione tallone per acquisire gli eventi tra 0,2 micron e 1,0 micron. In alternativa, in un istogramma SSC-H, disegnare un cancello per includere tutti gli eventi più piccoli rispetto ai 1,0 micron perline.
  6. Impostare la portata del citometro a "Lo" (circa 8-12 ml / min). Usando il tubo perline (o altro tubo contenente una concentrazione nota di perline) regolare il selettore portata sul citometro fino alla vigiliatasso nt raggiunge circa 200 eventi / sec. Leggi tutte le provette dei campioni alla stessa velocità di flusso e utilizzare la stessa concentrazione tallone in esperimenti futuri per garantire che i flussi restano coerenti tra le esecuzioni.
  7. Eseguire un tubo di particelle fluorescenti arcobaleno diluito in PBS. Acquisire 5.000 eventi. Registrare i valori di intensità media per FSC, SSC, e ciascun canale di colore. Utilizzare questi valori per regolare tensioni in esperimenti futuri per garantire che intensità di fluorescenza restano coerenti tra esperimenti.

1.6) lettura del campione

  1. Impostare la portata del citometro a "Lo" (circa 8-12 ml / min) ed eseguire ogni campione per esattamente 1 o 2 minuti.
  2. Dopo la prima lettura, aggiungere 20 ml di 10% NP-40 per ciascun campione, pipetta su e giù, e rileggere per la stessa quantità di tempo (1 o 2 min) per consentire la sottrazione di eventi positivi rilevati in il campione lisato su un lasso di tempo uguali.
    NOTA: E 'estremamente important che i campioni essere miscelati utilizzando una pipetta piuttosto che un vortice. Nella nostra esperienza, vortex può provocare auto-aggregazione di alcuni anticorpi, portando a eventi positivi-EV imitando.
  3. Una volta che tutti i campioni sono stati letti, esportare tutti i file .fcs in un file separato da utilizzare per ulteriori analisi utilizzando il software di analisi FCM.

1.7) Analisi dei dati

  1. Aprire il software di analisi FCM. Importare tutti i file .fcs in un nuovo file esperimento.
  2. Aprire il perline solo tubo. Nel FSC-A vs SSC-A plot, disegnare un cancello intorno a tutte le perle di dimensioni tra 0,2 micron e 1,0 micron. Questa è la porta EV. Trascinate da aggiungere a tutti i campioni.
  3. Utilizzando i campioni lisati come controlli negativi, elaborare porte sul bordo della fluorescenza di fondo in ciascun canale fluorescenza utilizzato. Trascinare cancelli fluorescenti nella gate EV di ogni campione non lisato corrispondente.
    NOTA: A questo punto è anche utile esaminare dual fluorescenti trame bi-parametri. Forme Rocket inil quadrante a doppio positivo (vedi figura 8), in particolare se i marcatori sono noti a risiedere in tipi di cellule indipendenti, possono essere indicativi di artefatto da aggregazione o altri eventi-vescicole imitando.
  4. Per ciascun marcatore fluorescente, sottrarre il numero di eventi nel campione lisato dal numero di eventi nel campione non lisato. Facoltativamente, dividere questo numero per il numero totale di veicoli elettrici all'interno del cancello non lisati EV per ottenere valori positivi%.

2. METODO B: Metodo Beads

2.1) Elaborazione di Campione di sangue / isolamento dei veicoli elettrici

  1. Fare riferimento al metodo di lavorazione del sangue descritto nel metodo A (sezione 1.1).

2.2) la preparazione dei campioni per l'analisi

  1. Se lo si desidera, frazionare PPP o EV ultracentrifugato in esosomi e microvescicole. Aggiungere 250 ml di PPP o EV ultracentrifugato a 0.22 micron filtri centrifughi e trasferimento in una centrifuga del rotore fisso e far girare a 750 xg per 2 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Assicurarsi che rimanga liquido sulle cime del filtro. Dopo centrifugazione, il filtro deve apparire "secco" senza strato fluido rimanente visibile sulla parte superiore. Sebbene improbabile, alcuni campioni possono richiedere un tempo di centrifugazione leggermente più lungo per il fluido di muoversi efficacemente attraverso il filtro.
  2. Lavare patinati 6 micron perle di polistirene (per esempio, perle negative ABC) 2x con i media RPMI e risospendere in 2 ml. Aggiungi 6.000 perline per ogni provetta FACS. Per la provetta di controllo negativo, aggiungere 400 ml di RPMI supporto solo ai talloni. Per tutti gli altri tubi, aggiungere 200 ml di PPP o di veicoli elettrici ultracentrifugato (o loro frazioni) e 200 ml di RPMI media.
  3. Regolare il volume finale di tutte le provette a 400 microlitri con media e incubare una notte a 4 ° C su un agitatore.
  4. La mattina dopo, lavare perline con 2 ml di media. Aspirare il surnatante.
  5. Blocco con 5% di siero albumina bovina (BSA) in mezzi (400 ml) per 3 ore a 4 &# 176; C su un agitatore.
  6. Lavare perline con 2 ml di media. Aspirare e risospendere pellet in 100 ml di media.

2.3) I campioni di colorazione EV

  1. Filtrare tutti gli anticorpi. Utilizzare gli stessi pannelli di anticorpi utilizzati nel metodo A, o se desiderato, creare una diversa combinazione di anticorpi finché loro fluorocromi sono compatibili tra loro.
  2. Combinare tutti gli anticorpi da utilizzare in un unico pannello in un tubo filtro centrifugo 0,22 micron. Centrifugare utilizzando un angolo fisso centrifuga singola velocità per 2 minuti o fino a quando tutta la miscela Ab è passato attraverso il filtro e nessun liquido anticorpi rimane sulla superficie del filtro.
  3. Aggiungere il volume appropriato di cocktail di anticorpi filtrato a tutte le provette e incubare per 30 minuti a 4 ° C.
  4. Lavare perline con 2 ml di mezzi, risospendere in 400 ml di mezzi ed eseguire immediatamente (o entro il giorno stesso) sul citofluorimetro.

2.4) Cytometer Setup e Sample Reading

  1. Aprire il software FCM. Prima di sperimentare l'installazione, eseguire la calibrazione dello strumento quotidiano e configurazione utilizzando perline di impostazione strumento (seguendo le istruzioni del produttore).
  2. Se i campioni EV sono state colorate con più di un anticorpo e molteplici fluorocromi sono da misurare contemporaneamente, calcolare valori di compensazione come segue:
    1. Aggiungere 2 gocce di sfere di compensazione per i tubi pre-etichettati (1 tubo per ogni anticorpi coniugati a fluorocromi) e aggiungere la quantità raccomandata di anticorpi. Aggiungere 2 gocce di sfere di compensazione negativi a un altro tubo da utilizzare come il controllo di compensazione senza macchia. Incubare a 4 ° C per 30 minuti, lavare con PBS e risospendere in 400 ml di PBS.
    2. Utilizzando il software FCM, eseguire ogni tubo di compensazione e regolare tensioni fluorescenti per posizionare ogni picco di circa 10 4 su una scala logaritmica 5-decade. Assicurarsi che il picco di fluorescenza è più elevata (più luminoso) in un proprio canale fluorescente rispetto a tutti gli altri canali, eregolare le tensioni di parametri fluorescenti nuovo se necessario. Eseguire ogni tubo bozzetto singolarmente macchiato e catturare almeno 5.000 eventi per il tubo.
    3. Selezionare la scheda "Experiment", quindi "Compensation", poi "Calcola compensazione" per applicare valori di compensazione per tutti i campioni.
  3. Cambiare la FSC e parametri di tensione SSC per accedere scala e selezionare le soglie più basse consentite dal citometro (FSC = 200 e SSC = 200) per ogni.
  4. Campioni Run, porta sulla popolazione perline singoletto e acquisire 2.000 eventi in questa porta. File di esportazione .fcs.
  5. Utilizzare software di analisi FCM per analizzare .fcs file. Gate perline singoletto. Calcolare l'intensità geometrica fluorescenza media (MFI) per ogni fluorocromo e confrontare con la MFI del controllo negativo.

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Risultati

Figura 1 illustra lo schema di elaborazione globale per l'isolamento e la rilevazione dei veicoli elettrici utilizzando sia il metodo basato bead-o metodo di rilevamento individuale. Rilevazione individuale dei veicoli elettrici che utilizzano FCM funziona bene per l'analisi dei veicoli elettrici più grandi, ma la maggior parte dei citometri non sono in grado di rilevare singolarmente particelle piccolo come esosomi. Un approccio basato branello-permette piccoli EVs da rilevare, però, ci s...

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Discussione

Sono stati presentati due diversi protocolli per l'isolamento, il trattamento e l'analisi dei veicoli elettrici, utilizzando un rilevamento individuo o approccio basato bead-. Selezione del metodo più appropriato utilizzare non è sempre agevole e richiede una comprensione del campione in prova nonché le singole sottopopolazioni di interesse. Inoltre, la sensibilità del citometro utilizzato per l'acquisizione deve essere considerato nella scelta del metodo più appropriato. Spesso non c'è miglior protocoll...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno alcun conflitto di interesse a divulgare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare Dale Hirschkorn da sistemi Sangue Research Institute per il suo aiuto con citofluorimetro impostazioni dello strumento. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concede HL095470 e U01 HL072268 e contratti DoD W81XWH-10-1-0023 e W81XWH-2-0028.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Citometro a flusso da banco LSR IIBD Biosciences3-laser (20 mW Zaffiro coerente 488 nm blu, 25 mW Vioflame coerente 405 nm viola e 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm rosso)
Software FACS Diva BD BiosciencesPC versione 6.0
FlowJo software Treestar USMac versione 9.6.1 o PC versione 7.6.5
Sphero Rainbow particelle fluorescentiBD Biosciences556298utilizzato per regolare tutte le tensioni dei canali per mantenere la coerenza dell'intensità della fluorescenza.
Particelle fluorescenti Ultra Rainbow SpherotechURFP-10-5utilizzato in aggiunta alle perle Megamix-Plus SSC per garantire la coerenza del gating EV da lotto a lotto
Megmix-Plus SSC perlineBiocytex7803utilizzato per regolare le tensioni FSC e SSC per mantenere la coerenza tra le corse. Può anche essere utilizzato per monitorare la portata e regolare il quadrante della portata al fine di garantire che la stessa portata venga utilizzata in tutte le corse
Kit di perline anti-topo AbCLife TechnologiesA-10344utilizzato per i controlli di compensazione e le perle AbC negative utilizzate per il metodo basato sulle perline
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)Santa Cruz SC-281108utilizzato nel metodo di rilevamento individuale solo per lisare i campioni dopo la lettura iniziale per l'uso come controlli negativi. Il brodo può essere diluito a 1:10 in PBS e conservato in frigorifero per un massimo di 1 mese.
Provette BD TruCOUNT BDBiosciences340334utilizzato ogni volta che sono necessarie concentrazioni assolute di EV
Ultrafree-MC, GV 0,22 e micro; m Unità di filtraggio centrifugheMillipore UFC30GVNButilizzato per il lavaggio post-colorazione delle vescicole extracellulari e/o per il frazionamento delle vescicole extracellulari in base alle dimensioni
Provette per sangue intero in vetro Vacutainer ACD-ABD Biosciences364606
Provette Facs 12x75 polistreneBD Biosciences352058
50 ml Serbatoi confezionati singolarmentePuntali per pipette PhenixRR-50-1s
Green-Pak - 10 &; lPuntali per pipette RaininGP-L10S
Green-Pak -200 &; l PuntaliGP-L250S
Green -Pak - 1.000 &; l Puntali RaininGP-L1000S
Stable Stack L300 presterilizzatiRaininSS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 canali LTS  Regolabile  Distanziatore RaininLA8-300XLS
E& K ScientificEK-20180
RPMI 1640 Terreni (senza Hepes)Impianto di coltura cellulare UCSFCCFAE001terreni utilizzati per il metodo di rilevamento basato su microsfere
Dulbeccos PBS D-PBS, senza CaMg, 0,2 e micro; m filtratoUCSF Impianto di coltura cellulareCCFAL003
Provetta per ultracentrifuga, parete sottile, ultra-trasparenteBECKMAN COULTER INC
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5Biolegend3448082 &; l
CD14 APC-Cy7Biolegend3018202 µ l
CD16 V450BD Biosciences5604742 µ l
CD28 FITCbiolegend3029062 µ l
CD152 APCBD Biosciences5558552 µ l
CD19 A700Biolegend3022262 µ l
PANNELLO II
CD41a PerCP-Cy5.5BD Biosciences3409302 µ l
CD62L APCBiolegend3048102 & micro; l
CD108 PE BD Biosciences5528302 &; l
CD235a FITCbiolegend3491042 µ l
PANNELLO III
CD11b PE-Cy7Biolegend3013222 µ l
CD62p APCBiolegend3049102 &; l
CD66b PE Biolegend3051062 µ l
CD15 FITCexalphaX1496M5 µ l
CD9 PEBiolegend555372
CD63 APCBiolegend353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κBioleggenda400230
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