Targeted DNA metilazione Analisi per sequenziamento di prossima generazione

Sommario

Il sequenziamento dell'amplicone del bisolfito (BSAS) è un metodo per quantificare la metilazione della citosina in regioni genomiche mirate di interesse. Questo metodo utilizza la conversione del bisolfito abbinata all'amplificazione PCR delle regioni target prima del sequenziamento di nuova generazione per produrre una quantificazione assoluta della metilazione del DNA a livello base-specifico.

Abstract

Il ruolo dei processi epigenetici nel controllo dell'espressione genica è noto da diversi anni. La metilazione del DNA nei residui di citosina è di particolare interesse per gli studi epigenetici in quanto è stato dimostrato che è un regolatore dinamico e duraturo dell'espressione genica. Gli sforzi per esaminare i cambiamenti epigenetici nella salute e nella malattia sono stati ostacolati dalla mancanza di metodi ad alto rendimento e quantitativamente accurati. Con l'avvento e la diffusione delle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS), questi strumenti vengono ora applicati all'epigenomica in aggiunta alle metodologie genomiche e trascrittomiche esistenti. Per le indagini epigenetiche sulla metilazione della citosina in cui sono state identificate regioni di interesse, come specifici promotori genici o isole CpG, e c'è la necessità di esaminare un numero significativo di campioni con un'elevata accuratezza quantitativa, abbiamo sviluppato un metodo chiamato Sequenziamento dell'Amplicone di Bisolfito (BSAS). Questo metodo combina la conversione del bisolfito con l'amplificazione mirata delle regioni di interesse, la costruzione di librerie mediate da trasposomi e l'NGS da banco. BSAS offre un metodo rapido ed efficiente per l'analisi di un massimo di 10 kb di regioni mirate in un massimo di 96 campioni alla volta, che può essere eseguito dalla maggior parte dei gruppi di ricerca con competenze di base in biologia molecolare. I risultati forniscono una quantificazione assoluta della metilazione della citosina con specificità di base. La BSAS può essere applicata a qualsiasi regione genomica da qualsiasi fonte di DNA. Questo metodo è utile per gli studi di verifica delle ipotesi delle regioni target di interesse, nonché per la conferma delle regioni identificate nelle analisi di metilazione dell'intero genoma, come il sequenziamento del bisolfito dell'intero genoma, il sequenziamento del bisolfito a rappresentazione ridotta e il sequenziamento dell'immunoprecipitazione del DNA metilato.

Introduzione

E 'passato più di mezzo secolo da quando il primo rapporto di naturalmente modifiche del DNA in forma di citosina metilazione ^1. Citosina metilazione è una base citosina nucleotide modificato in cui il 5 ^° di carbonio sull'anello di base ha un gruppo metilico (5-MC), più frequentemente si verificano nel dinucleotide CpG motivo nei genomi dei mammiferi. La presenza funzionale della 5-mC in promotori genici è generalmente associata con la repressione trascrizionale, mentre l'assenza è associato con l'attività trascrizionale ^2.

Enormi progressi sono stati fatti nella comprensione del ruolo della metilazione del DNA in fase di sviluppo ^3, transgeneration propagazione di profili epigenetici ^4, cancro patogenesi ^5,6, e un certo numero di altri settori di ricerca. Molti di questi progressi sono venuti negli ultimi anni come nuove metodologie sono state sviluppate al profilo di metilazione del DNA ^7. Con l'avvento edivulgazione di tecniche di sequenziamento di prossima generazione (NGS) ora ci sono una serie di metodi per profilare la metilazione del DNA di un intero genoma o grandi regioni del genoma ^8. Questi approcci aprono la possibilità di studi scoperta che quantificano metilazione del DNA e le differenze di metilazione del DNA. In aggiunta a questi approcci ipotesi che generano, vi è una forte necessità di target / Test di ipotesi DNA metodi metilazione di quantificazione.

Pyrosequencing, metilazione specifico PCR, e Sanger sequenziamento diretto del DNA bisolfito convertito sono stati i metodi più utilizzati per l'analisi delle regioni mirati (ad esempio, una regione del promotore di un singolo gene o un'isola CpG) ^9-12. Tutti questi metodi si basano sulla conversione bisolfito, una reazione chimica deaminazione dove citosina non metilate del sono convertiti in uracile di, mentre citosina metilati di ^13,14 rimangono intatte. Amplificazione PCR di bisulfite-convertiti risultati del DNA in sostituzione di uracile di con timina ¹⁵ che consentono la metilazione differenziale leggere come una differenza di base. Mentre molto utile, le limitazioni a questi metodi includono bassa precisione quantitativa, lunghezza lettura breve, e la velocità bassa del campione. Per far fronte a queste limitazioni abbiamo sviluppato un metodo che abbiamo definito bisolfito Amplicon Sequencing (BSAS) ^16. L'obiettivo di questo metodo è quello di poter analizzare bersaglio regioni genomiche di interesse in un gran numero di campioni con elevata precisione quantitativa.

BSAS utilizza elementi di metodi esistenti (conversione bisolfito e specifiche regione amplificazione PCR) e li combina con semplice costruzione di nuova generazione library (transposome-mediata) ¹⁷ e da banco NGS ¹⁸ (Figura 1). Questo approccio prevede un metodo di throughput più quantitativa e superiore per esaminare la metilazione citosina in qualsiasi regione di interesse. Ecco a voi laMetodo in dettaglio e descrivere approcci per la risoluzione dei problemi e la qualità controllo del processo BSAS.

Protocollo

1. Nucleic Acid isolamento dal tessuto

NOTA: Co-isolamento di DNA e RNA dallo stesso campione di tessuto offre la possibilità di raccogliere DNA per l'analisi epigenetica e RNA accoppiato per analisi di espressione genica. L'esempio dato qui è una forma di purificazione colonna dal tessuto sperimentale, ma approcci alternativi per i diversi tipi di campioni o altri metodi di isolamento possono essere impiegati. L'esigenza principale è per l'acido nucleico altamente purificato senza contaminare proteine ​​o solventi organici.

1. Selezionare un pezzo di tessuto fresco congelato o fresco per omogeneizzazione meccanica e disporli sul ghiaccio. Store o tessuto trasferimento in una provetta a fondo rotondo ml 2.0.
2. Aggiungere una 5 millimetri tallone in acciaio inox ad ogni provetta contenente tessuti. Aggiungere una quantità appropriata di tampone di lisi, sulla base dei suggerimenti di numero di cellulare o il peso dei tessuti del produttore.
3. Omogeneizzare il tessuto utilizzando un omogeneizzazione meccanica mulino a tallone30 Hz per 30 sec.
   NOTA: La frequenza e la durata di omogeneizzazione meccanica dipende dal tipo di tessuto. Tessuti morbidi saranno completamente omogeneizzare utilizzando le impostazioni consigliate, mentre i tessuti più difficili richiedono l'impostazione di ottimizzazione.
4. Effettuare l'isolamento del DNA e RNA utilizzando colonne di rotazione silice a temperatura ambiente seguendo il protocollo del produttore.
   1. Eluire RNA in 50 ml di acqua RNase-free e posto sul ghiaccio. Utilizzare RNA per l'analisi di espressione dell'mRNA per qPCR.
   2. Eluire DNA in 100 ml di tampone TE. Ripetere eluizione off colonna DNA utilizzando l'eluente per aumentare la concentrazione del DNA e la resa. Usa DNA per mirata quantificazione metilazione.
5. Valutare la qualità di DNA e RNA utilizzando uno spettrofotometro standard per l'assorbanza a 230 nm, 260 nm, 280 nm e 320 nm.
   NOTA: il rapporto / A280 A260 dovrebbe essere ~ 1,8-2 per DNA di alta qualità. Rapporto / A280 A260 dovrebbe essere ~ 2 per l'RNA di alta qualità. La presenza di un eccesso di assorbanza a 230 nm indicAtes contaminanti dalla procedura di isolamento.
6. Controllare la qualità del RNA ulteriormente utilizzando un chip elettroforesi capillare secondo le istruzioni del produttore.
   NOTA: RNA di alta qualità avrà un numero di integrità dell'RNA (RIN)> 8. La presenza di picchi supplementari in elettroferogramma oltre picchi rRNA indica contaminazione dei campioni.
7. Quantificare il DNA e RNA da test di fluorescenza secondo il protocollo del produttore.
   NOTA: Utilizzando un saggio fluorimetrico è più sensibile e specifico per la quantificazione degli acidi nucleici di spettrofotometria solo.
8. Conservare isolato il DNA e l'RNA a -80 ° C.

2. Obiettivo Identificazione e Primer design

1. Determinare la regione genomica (s) di interesse da analizzare da BSAS base alla sequenza di riferimento genoma appropriata. Promotori di geni di geni differenzialmente espressi sono obiettivi comuni di metilazione quantificazione.
2. Preparare una in silico bisolfito-convertgenoma di riferimento ed in seguito per l'allineamento di sequenziamento legge modificando il file di sequenza .fasta in un editor di testo. Nel orientamento 5'-3 ', sostituire non CpG-citosina del con di timina (Figura 2).
3. Progettazione Primer imposta per amplificare regioni di interesse da bisolfito DNA convertito.
   1. Selezionare e copiare la regione di interesse non convertito, in orientamento 5'-3 ', in un programma di progettazione PCR primer specifico bisolfito (Figura 3).
      NOTA: Un ottimale bisolfito-PCR lunghezza amplicone è 250-400 bp per amplicone come frammenti trattamento bisolfito DNA ed è difficile per amplificare grandi> 400 bp regioni. Se, per esempio, una regione di 1 kb è di interesse, più coppie di primer possono essere progettati per coprire questa regione. Ampliconi di design per essere di dimensioni bp parità per una facile condivisione. Evitare lunghezze ampliconi <250 bp, perché questi possono essere di lunghezza sufficiente per la generazione biblioteca. Una lunghezza fondo ottimale per BSAS è>20 bp per primer.
   2. Selezionare un intervallo T _m di 55-65 ° C e max T differenza _m tra avanti e indietro primer di 1-2 ° C.
   3. Selezionare coppie di primer che meglio coprono la regione di interesse. Non selezionare primer che contengono siti CpG o direttamente adiacenti ai siti CpG, ciò causerebbe pregiudizio nelle reazioni PCR. Utilizzare primer PCR standard che possono essere ordinati da qualsiasi numero di fornitori di accademici o commerciali.
   4. Ricostituire primer liofilizzati in RNase / DNase acqua libera ad uno stock di lavoro di 100 micron.
4. Conservare primer PCR a -20 ° C. Diluire 100 micron di primer magazzino a 10 micron magazzino che lavorano per le reazioni PCR.

3. bisolfito specifico Ottimizzazione PCR

NOTA: Per la conversione bisolfito di DNA genomico, un certo numero di diversi kit commerciali per la conversione bisolfito sono disponibili. Selezionare il kit o il protocollo che meglio si adatta l'esperimento previsto.

1. Utilizzare tra 200 ng a 2 mg di DNA genomico. Per gli esperimenti di ottimizzazione, eseguire le reazioni di conversione multipli in modo da avere bisolfito sufficienti convertiti DNA per reazioni multiple BS PCR.
2. Usare piccoli (ad esempio, 10 ml) volumi di eluizione di bisolfito DNA convertito a mantenere le concentrazioni di DNA elevate.
   NOTA: 1-2 ml di bisolfito DNA convertito è sufficiente per l'ottimizzazione reazioni PCR se 1 mg DNA genomico è stato utilizzato per l'ingresso di conversione.
3. Amplifica bisolfito DNA convertito dal bisolfito specifico PCR. Reazioni BS-PCR richiedono usando una polimerasi Taq grado di amplificare DNA bisolfito convertito.
   1. Montare la seguente reazione per l'ottimizzazione bersaglio amplificazione di un singolo amplicone. Per più campioni, assemblare le reazioni in un piatto PCR 96 pozzetti.
      25 microlitri tampone di reazione 2x
      0,5 microlitri dNTP Mix
      5 ml 10 micron Forward Primer (Finale 1 micron)
      5 ml 10 micron Reverse Primer(Finale 1 micron)
      2 ml modello bisolfito convertito DNA
      0,4 microlitri (5 U / ml) DNA polimerasi
      12.1 ml acqua priva DNase (volume di reazione finale di 50 ml)
   2. Sigillare piastra PCR con l'adesivo appropriato o pellicola termosaldata.
   3. Mettere reazione in un adeguato termociclatore e utilizzare le seguenti condizioni di ciclismo con un coperchio riscaldato:
      1. Eseguire una denaturazione iniziale a 95 ° C per 10 min.
      2. Denaturare a 95 ° C per 30 sec.
      3. Anneal per 30 sec alla specifica T _m di primer utilizzato. Inizia a una temperatura di ricottura alcuni ° C al di sotto della T _m del primer per reazioni di ottimizzazione.
         NOTA: Le migliori temperature di ricottura possono essere determinate utilizzando un termociclatore gradiente per testare una vasta gamma di temperature.
      4. Eseguire una estensione a 72 ° C per 30 sec. Allungare il tempo di estensione per ampliconi più lunghi.
      5. Ripetere i passaggi 3.3.3.2-3.3.3.4 per 35 cicli aTal per l'ottimizzazione iniziale. Numero di cicli più alti potrebbero essere necessarie ma dovrebbero essere generalmente evitato per evitare amplificazioni clonali che creeranno manufatti di reazione.
      6. Eseguire una estensione finale a 72 ° C per 7 minuti.
      7. Tenere reazioni a 4 ° C.
   4. Visualizza ampliconi di PAGE elettroforesi. In alternativa, utilizzare un chip DNA elettroforesi capillare secondo il protocollo del produttore.
      1. Mescolare 24 ml di reazione PCR con 6 ml di 5x loading dye su ghiaccio e vortex.
      2. Fate 1 L di 1x TBE tampone di corsa mescolando 200 ml di 5x TBE tampone di corsa e 800 ml di DDH ₂ O. Diluire ladder DNA per una concentrazione finale di 0,5 mg per pozzetto in DDH ₂ O e loading dye.
      3. Pozzetti di carico con 30 ml di reazioni PCR o scala.
      4. Attivare il gel a 200 V per ~ 45 min. Arrestare il ciclo di gel quando il primo fronte del colorante raggiunge la fine del gel.
      5. Macchia il gel con 5 mg / mletidio bromuro mescolando 5 ml di 10 mg / ml in 100 ml di DDH ₂ O. Coprire l'intero gel e lasciare incubare per ~ 5 min.
      6. Immagine il gel mediante una scatola luminosa UV o imager multimodale ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 482 nm.
      7. Con riferimento alla scala, dimensioni gli ampliconi della PCR e determinare la specificità della reazione, cercando di più bande diverse dimensioni previste amplicone (Figura 4A e C).
   5. Una volta che le condizioni ottimali per BS-PCR sono stati determinati, effettuare BS-PCR su campioni sperimentali.
      1. Purificare ampliconi provenienti dagli altri fondi e di altri componenti della reazione. Eseguire silice purificazione colonna, SPRI tallone, o a base di gel di pulizia e la quantificazione.
      2. Ampliconi Eluire in 30 microlitri di buffer TE.
      3. Quantificare ampliconi con dosaggio fluorimetrico utilizzando i protocolli del produttore.
      4. Se ci sono più amplificati per campione, li piscina a parità di peso per volumeimporti e conservare a -20 ° C.

4. NGS Biblioteca Preparazione e Biblioteca QC

NOTA: BSAS NGS preparazione libreria utilizza un protocollo transposome mediata semplificata con dual-indicizzazione (vedi elenco dei materiali per i dettagli su libreria preparazione selezione kit). Questo metodo fornisce un percorso estremamente rapido e high-throughput per la costruzione di libreria che è stato convalidato e mostra poco o nessun pregiudizio in applicazioni di sequenziamento bisolfito ^16,19. Dual-indicizzazione consente una multiplazione elevata di campioni di singolo indicizzazione. Altri stili di preparazione biblioteca può essere possibile, ma non sono stati testati.

1. Preparare librerie NGS da ampliconi BS PCR in una piastra PCR da 96 pozzetti. Diluire ampliconi a 0,2 ng / ml per una massa di ingresso finale di 1 ng, o 5 ml di 0,2 ng / ml di diluizione. Eseguire un clean-up di librerie generati utilizzando SPRI perline. Utilizzare 50-90 microlitri perline SPRI per isolare le biblioteche wesimo questo protocollo. Il volume di SPRI perline dipende dalla dimensione obiettivo di biblioteca e numero di cicli di reazioni di sequenziamento desiderati.
   NOTA: Utilizzare un vortex o piastra vortex per risospendere le sfere.
   1. Eluire le librerie al largo delle perline e trasferire ad una nuova piastra a 96 pozzetti e sigillare con la pellicola termosaldatura per la conservazione a -20 ° C.
2. Determinare la dimensione e la concentrazione di librerie (Figura 4B e D).
   1. Biblioteche eseguito su un DNA elettroforesi capillare dimensionamento del circuito integrato secondo protocolli del produttore.
      1. Utilizzare un'alta sensibilità del test elettroforesi capillare DNA per determinare la dimensione media dei picchi rilevati biblioteca e una stima della molarità secondo protocolli del produttore.
   2. Quantificare le librerie da qPCR, utilizzando primer disegnati contro le sequenze adattatori nelle librerie generati e le norme d'uso con una concentrazione nota.
      1. Run qPCR reazioni su uno strumento in tempo reale utilizzando le impostazioni di quantificazione assoluta secondo i protocolli del produttore.
      2. Utilizzare la dimensione delle librerie e quantificazione molare compreso tra qPCR per calcolare le concentrazioni molari delle librerie.
3. Diluire librerie a 4 nM utilizzando 10 mM Tris-Cl con 0,1% Tween-20 a pH 8,5. Biblioteche Conservare in un pozzo-96 piastra PCR sigillati con pellicola termosaldatura a -20 ° C.

5. biblioteche Sequencing usando un sequencer da banco

1. Scongelare e preparare i reagenti in base alle istruzioni del produttore.
2. Scongelare 4 biblioteche nm su ghiaccio.
3. Effettuare 1 ml di 0,2 N NaOH in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
4. Pool 4 biblioteche nm in quantità uguali di volume, se più librerie sono da utilizzare.
5. Diluire e denaturare le librerie messe in comune secondo le istruzioni del produttore della concentrazione molare finale desiderato.
   1. Tenere diluito e denaturarebiblioteca pool sul ghiaccio fino al momento di caricare sulla cartuccia reagenti.
6. Generare un foglio campione contenente i nomi dei campioni e le corrispondenti informazioni di indice e specificare per generare .fastq solo i file.
   1. Foglio di esempio Load nella cartella scheda del campione corrispondente sul sequencer.
7. Aggiungere un totale di 600 microlitri diluiti e biblioteca denaturato alla cartuccia di reagente nel pozzetto corrispondente.
8. Eseguire le reazioni di sequenziamento per il completamento.

Analisi 6. metilazione quantificazione dei dati

NOTA: Ci sono diversi programmi disponibili per l'analisi dei dati NGS compreso sia commerciali che open source. Dettagli su programmi in esecuzione possono essere trovati con ogni pacchetto specifico. Istruzioni generali sono date ad ogni passo insieme ai comandi specifici per questo pacchetto software. (Vedi Materiali Lista per ulteriori informazioni sul software utilizzati in questo protocollo).

1. Importare file .fastq.gz in appropriata sequencing analisi condotta mantenendo punteggi di qualità (Qscores) per l'uso in lettura taglio. (Per questo programma di esempio selezionare 'Importa' e selezionare il metodo di sequenziamento utilizzato per generare letture. Selezionare .fastq.gz leggere i file da importare, e mantenere Qscores da file .fastq di lettura taglio applicazioni deselezionando "punteggi di qualità disfarsi» in 'Generale Opzioni ". Scegliere una posizione per il importata legge e selezionare 'Fine'.)
   1. Tagliare e conservare letture utilizzando le seguenti impostazioni in un NGS analisi dei dati pipeline. (Per questo programma selezionare "Trim Sequenze 'sotto' NGS core Strumenti ', e selezionare la legge da tagliare.)
      1. Conservare legge solo che contiene punteggi ≥ Q30. (Per questo programma selezionare 'Trim con punteggi di qualità' e impostare il limite di 0.001.)
      2. Legge Conservare solo contenente ≤ 1 nucleotide ambiguo. (Per questo programma selezionare 'nucleotidi ambigue Trim "e impostare il'Numero massimo di ambiguità' a 1. Selezionare un percorso in cui salvare rifilato legge e selezionare 'Fine'.)
   2. Mappa tagliato legge al in silico bisolfito di riferimento gene convertito da 2.2. (Ad esempio il software seleziona 'Mappa Legge di riferimento' sotto 'NGS Strumenti fondamentali. Selezionare rifilato legge da mappare e selezionare' prossimo '. Selezionare la sequenza di riferimento convertito e selezionare' no mascheramento 'sotto' mascheramento di riferimento '. Selezionare' il prossimo '.)
      1. Assegnare un pena massima per i disallineamenti, inserimenti ed eliminazioni. Impostare i parametri in modo tale che il 100% della lunghezza di lettura è necessario per mappare con il 90% sequenza identità. Ad esempio il software, assegnare un punteggio di 3 per i disallineamenti, inserimenti ed eliminazioni. Assegnare un punteggio di 1 a frazione minima di lunghezza lettura mappato riferimento, e assegnare un punteggio di 0,9 per frazione minima di identità tra mappata leggere e di riferimento.
      3. Per l'uscita di allineamento generare ogni campione come un file indipendente. Ad esempio il software, selezionare 'Create stand-alone leggere mappature' sotto 'Opzioni di uscita' e 'Save' sotto 'la manipolazione dei risultati'. Selezionare un percorso per salvare la mappatura di lettura e selezionare 'Fine'.
   3. Eseguire un flusso di lavoro variante chiamando al mappato legge. Per il software esempio, selezionare 'probabilistica Variant Detection' sotto 'Resequencing Analysis', selezionare il mapping di lettura da analizzare e selezionare 'prossimo'. Seleziona 'Ignora non specifici incontri' sotto 'Leggere filtri' e selezionare 'prossimo'.
      1. Assicurarsi che la sequenza è a un depesimo ≥ 1000 x impostando la 'copertura minima' sotto 'significato' a 1.000.
      2. Assicurarsi che la chiamata variante è presente sia in avanti che indietro legge. Ad esempio il software, selezionare 'Richiedi presenza sia in avanti che indietro stand' sotto "filtri Variant 'e selezionare' prossimo '.
      3. Export allineati, variante chiamata dati come una tabella annotato. Ad esempio il software, selezionare 'Crea una tabella ragionata' sotto 'le opzioni di output "e scegliere un percorso in cui salvare il file tabella di variante. Seleziona 'Fine'.
2. Calcolare 5-mC percentuale utilizzando le frequenze variante in siti CpG annotati nella regione di interesse dal file tabella di variante. La frequenza di citosina ad un riferimento C in CG è la percentuale 5-mC.
   NOTA: quando si utilizza la variante chiama algoritmi per CpG altamente metilato di sostituire cytosines CpG con timina. Ciò identify il mappato citosina di come varianti, con conseguente frequenza citosina a CpG di.
3. Determinare bisolfito efficienza di conversione (BSC) mediante il calcolo della percentuale di C non è in siti CpG nel riferimento (C). Moltiplicare la percentuale di non CpG C di per numero di mappatura (T _mp) totale di T, e dividere per totale C di mappato al riferimento del T (C _MPT). 100 meno la frequenza calcolato è l'efficienza di conversione bisolfito (BSC) di quella libreria (Equazione 1).



Equazione 1. Bisolfito efficienza di conversione.
NOTA: Mentre genomi dei mammiferi contengono quantità molto basse di non-CpG citosina metilazione (con l'eccezione di cellule staminali potenzialmente ^20), genomi vegetali contengono una quantità significativa. Per determinare bisolfito efficienza di conversione in questi reference genomi, un percorso adatto è per sequenziare una porzione del genoma mitocondriale o cloroplasto genoma o noti geni non metilate presenti in pianta genomi ²¹ e calcolando efficienza di conversione come descritto sopra. Bisolfito efficienza di conversione dovrebbe essere ≥98% nella maggior parte dei casi, con il non convertito del C potenzialmente derivanti dalla non metilazione CpG.

Risultati

BSAS si legge correttamente allineato a sequenza di riferimento convertito sarà simile alla Figura 5. Dinucleotides CPG possono chiaramente essere identificati e gli stati di metilazione possono essere stimati osservando le chiamate di base a siti CpG nel mappato legge. Ad esempio, con comandi metilazione, 0% metilazione comporta tutte le letture mappati a siti CpG contenenti T (Figura 5A). 100% dei controlli metilazione comporterà tutta la letture mappato legge a siti contenenti CpG di C (Figura 5B).

La quantificazione della frequenza di citosina (C / C + T) in siti CpG produce la frequenza metilazione nel campione originale. Una curva standard generata dal rappresentante interi controlli genoma metilazione (n = 3 / rapporto metilazione) mostra linearità metilazione quantificazione nonché precisione quantificazione a ciascun rapporto metilazione (Figura 6). Come esempio di questo metodo in totale, RNA e DNA sono stati co-iso lata di topo cervelletto e retina (n = 4 / group). Espressione Rhodopsin, selettivamente espresso in tessuto retinico, è stata misurata utilizzando qPCR. Expression è stata rilevata in retina (Figura 7A). Utilizzando BSAS, i livelli di metilazione CpG sono stati quantificati nella regione del promotore rodopsina. Livelli di metilazione cumulativi tutta la regione promotore erano> 80% nel cervelletto rispetto al <15% nella retina (p <0,001, t-test parametrico) (Figura 7B). BsAs benefici metilazione di quantificazione di site-specific metilazione quantificazione, e livelli di metilazione possono essere confrontati su base CpG-specifica attraverso una determinata regione genomica. Livelli di metilazione CpG in tutto il promotore rodopsina erano significativamente più alti nei campioni cerebellari rispetto ai campioni di retina (p <0.001, t-test parametrico in ciascun sito CpG) (Figura 7c).

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Figura 1:. Schema del metodo BSAS In questo metodo, il DNA genomico è bisolfito convertito modificare cytosines unmethylation a uracils. Successivamente, durante la PCR questi uracils vengono modificati a timina. Amplificazione PCR è diretto contro le regioni di interesse e altamente arricchisce solo per queste sequenze. I risultanti ampliconi della PCR sono fatti in librerie dual-indicizzati attraverso un semplice processo tagmentation. Successivamente le librerie sono in sequenza su un banco di nuova generazione sequencer e il sequenziamento letture sono mappati in silico convertito sequenza di riferimento e cento metilazione della citosina di è determinata in modo specifico-base.

Figura 2:. In silico conversione bisolfito di regione di interesse Tutte le regioni di interesse da ogni riferimento genomico può essere Selected per la conversione in silico bisolfito. Cytosines non-CpG sono sostituiti con timina nella sequenza di riferimento. Cytosines CpG restano cytosines del bisolfito convertiti riferimento.

Figura 3:. Primer placement Primer bisolfito PCR sono progettati contro una in silico bisolfito convertito sequenza di riferimento. Primer devono essere progettati in modo che non si sovrappongano dinucleotidi CG o progettati adiacente dinucleotidi CG.

Figura 4: Esempi di ampliconi alti e poveri PCR qualità e le librerie di sequenziamento elettroferogramma tracce rappresentative e gel spettacolo (A) amplicone ideale per la generazione biblioteca transposome mediata con una sola alta.Prodotto concentrazione. (B) Biblioteca generata da questo amplicon mostra elevata concentrazione e la distribuzione, anche le dimensioni. (C) scarso ampliconi della PCR qualità possono essere bassi in termini di dimensioni, la concentrazione, e contengono più prodotti e / o dimeri di primer. Questi ampliconi di scarsa qualità porterà a (D) fallito generazione biblioteca a bassa concentrazione e la distribuzione bassa dimensione.

Figura 5: Esempi di uscite di sequenziamento di controlli metilazione. (A) In silico convertito sequenziamento di riferimento con i siti CpG evidenziata in rosso. 0% di controllo metilazione mappato legge alla regione mostrando timina selezionati (avidità evidenziare) mappatura a siti CpG. Di controllo (B) 100% metilazione mappato legge mostra (blu highlight) mappatura di citosina in siti CpG.

Figura 6:. Quantificazione metilazione in una serie di controlli di metilazione dell'intero genoma controlli metilazione mescolato a rapporti di metilazione (n = 3 / ratio) da 0% a 100% sono stati quantificati con BSAS. Tracciamento quantificazione del previsto contro quantificata dimostra linearità del controllo metilazione quantificazione. Attraverso tutti i controlli, si è ad alta precisione in metilazione quantificazione.

Figura 7: Esempio di abbinato metilazione del DNA ed espressione genica analisi da campioni di tessuto. (A) Rhodopsin espressione di mRNA relativa dal topo cerebellare e tessuto retinico. (B) Rhodopsin metilazione media promotore quantificato da BSAS tra cerebellare e il DNA della retina (*** p <0.001, parametrico t-test). livelli di metilazione C) sito-specifica CpG tutto promotore rodopsina (-244 a +6, rispetto al sito di inizio della trascrizione [TSS]) nel topo cervelletto e DNA retina.

Discussione

BSAS consente concentrata, precisa quantificazione metilazione del DNA con elevate capacità di throughput sia il numero di campioni e il numero di obiettivi. Inoltre, questa generazione biblioteca utilizzando tagmentation transposome-mediata richiede meno DNA di ingresso, è più veloce e contiene meno passaggi rispetto tosatura tradizionale e successive tecniche adattatore legatura. Questi miglioramenti rispetto ai metodi attuali consentono precise a livello di base di analisi di metilazione del DNA di qualsiasi target di interesse. Inoltre, BSAS fornisce un nuovo metodo per la conferma delle regioni di interesse (regioni metilazione differenziale (tipo DMRS), isole CpG, regioni di regolamentazione) che sono stati identificati mediante intero genoma bisolfito ²² o catturare ²³ approcci. Utilizzando approcci conferma ortogonali e più quantitativamente metodi precisi migliora il rigore analitico degli studi epigenomiche. La profondità elevata di lettura realizzato con BSAS consente per la quantificazione precisa in un intervallo di confidenza stretto, risultazione in quantificazione precisa ^16. Inoltre, la possibilità di eseguire molti campioni in un singolo esperimento può aumentare la dimensione del campione per le conferme di metodi intero genoma, che consentirà di aumentare la potenza statistica; una debolezza di molti attuali studi epigenetici. È importante sottolineare che, BSAS fornisce un CpG metilazione quantificazione specifica-base, che consente la generazione di ipotesi verificabili per la ricerca epigenetica. Ipotesi come l'aumento metilazione in un elemento di risposta specifica si tradurrà in una diminuzione legame di un fattore di trascrizione specifico. BSAS, combinati con dati di espressione di mRNA appaiati, fornisce un metodo per ottenere sia la regolazione epigenetica e l'espressione di mRNA in un unico pezzo di tessuto o di una popolazione di cellule. Misure appaiati di regolamentazione e di espressione anche aumentare il rigore scientifico e l'impatto dei risultati.

Passaggi critici all'interno del protocollo BSAS comprendono la progettazione di primer, ottimizzazione amplicon, e la generazione di biblioteca /QC. Polarizzazione PCR è introdotto se primer non sono progettati correttamente e amplificano a diverse efficienze ^8. L'utilizzo di standard di metilazione, come enzimaticamente generati 100% e 0% citosina standard metilati, può essere utilizzato per determinare il grado, se presente, di polarizzazione metilazione quantificazione, ed è un controllo metodologico appropriato quando quantificare metilazione ^16. Allo stesso modo, si deve prestare attenzione quando si ottimizza reazioni PCR per la generazione di un singolo amplicone di alta qualità. Se non amplicone è presente con le linee guida suggerite descritti nel protocollo, passaggi di ottimizzazione includono un numero crescente di ciclo PCR o importo ingresso bsDNA. Se ci sono più prodotti PCR, compreso di primer-dimeri, passaggi di ottimizzazione includono diminuendo quantità di input bsDNA, diminuendo le concentrazioni di ingresso molari PCR Primer, aumento delle temperature di ricottura, o diminuendo il numero di ciclo PCR. Uno o una combinazione di questi procedimenti di ottimizzazione produce risultati sufficienti per generare una singola higamplicon h-qualità. In alternativa, ridisegnando primer è un buon approccio per i set di primer che non producono un singolo amplicone. Per le regioni in cui la riprogettazione non è adatto o possibile, degenerare set di primer, tra cui sia possibile lavorare di citosina e timina all'indirizzo siti CpG in primer avanti e adenina e guanina di di in siti CpG in primer inverso. Tuttavia, questi set di primer devono ottimizzare ulteriormente per garantire l'assenza di pregiudizi PCR è in corso, un processo al di fuori del campo di applicazione di questo protocollo. Librerie di qualità sono estremamente importanti per il successo. Garantire che le misure di controllo di qualità vengono effettuati per determinare le dimensioni, la qualità e la quantità delle librerie prima di sequenziamento. Le reazioni di sequenziamento sono inclini al fallimento con il contributo di librerie di bassa qualità. Bias in metilazione quantificazione può essere mitigato assicurando che le frequenze di metilazione sono presenti in entrambi avanti e retromarcia sequenziamento legge. Inoltre, i punteggi di qualità delle basi allineando a siti CpG dovrebbero essere ≥Q30 per alta confidence in quantificazione. Mentre altri hanno mostrato in precedenza poco o nessun pregiudizio in reazioni tagmentation di bisolfito DNA convertito ^19, garantendo i parametri sopra descritti consente la conferma della bassa quantificazione pregiudizi metilazione.

BSAS misura attualmente metilazione in siti CpG, però, le future espansioni di questo metodo consentirà misurazioni appaiate del CpG 5-HMC con l'aggiunta di fasi sperimentali distinguendo tra 5-MC e 5-HMC quali l'introduzione di perruthenate potassio prima della conversione bisolfito ^24. Ciò aumenterà l'impatto dell'utilità BSAS consentendo metilazione associato, sia dati di espressione 5-mC e 5-HMC, e per determinare espressione genica ruoli normativi di metilazione del DNA. Preparazione biblioteca Transposome-mediata di ampliconi della PCR non comporta approfondito sequenziamento diminuito alle estremità delle regioni amplificate. Pertanto, le regioni di grande interesse dovrebbero essere progettati per risiedere nel mezzo di ampliconi. Comemai, perché BSAS genera sequenziamento leggere profondità di> 1.000 X, la precisione quantitativa di 5-MC misurazioni vicino ai confini delle regioni amplificate rimane elevato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agilent 2100 Bioanalizzatore	Agilent	G29393AA
Agilent RNA 6000 Nano kit	Agilent	5067-1511
Agilent Kit DNA ad alta sensibilità	Agilent	5067-4626
Typhoon 9200	Amersham/GE Healthcare Life Sciences
Agencourt AMPure XP - Purificazione PCR	Beckman Coulter	A63880	5 ml
Alimentatore di base PowerPac	Bio Rad	164-5050
twin.tech piastra PCR 96	Eppendorf	951020362	film termosaldante semi-gonna
	Eppendorf	0030127838
foglio termosaldante	Eppendorf	0030127854
termosigillante	Eppendorf	5390000.024
0.1-10 μ l Suggerimenti	Eppendorf	0030073.002
2-200 μ l Suggerimenti	Eppendorf	0030073.045
50-1.000 μ l Punte	Eppendorf	0030073.100
MixMate	Eppendorf	5353000.014
Provette per microcentrifuga da 1,5 ml	Eppendorf	0030121.023
Centrifuga 5424	Eppendorf	5424000.010
Provetta per microcentrifuga da 2,0 ml	Eppendorf	022363352
Nextera XT Kit di preparazione del campione di DNA	Illumina	FC-131-1024	24 rxn
Nextera XT Index Kit	Illumina	FC-131-1001	24 indici
MiSeq Desktop Sequencer	Illumina
Kit di reagenti MiSeq v2	Illumina	MS-102-2002	300 cicli
KAPA SYBR FAST Kit qPCR universale	KAPA Biosystems	KK4824
Quant-iT Kit di analisi del DNA PicoGreen Life	Technologies	P7589
Kit di analisi dell'RNA Quant-iT RiboGreen	Life Technologies	R11490
Sistema PCR ProFlex a 96 pozzetti	Life Technologies	4484075
gel di DNA Novex 6% TBE	Life Technologies	EC6261BOX	10 pozzetti
	Life Technologies	LC6675	5x (1 L)
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer	Life Technologies	LC6678	5x (10 ml)
1 Kb Plus DNA Ladder	Life Technologies	10787-018
Xcell SureLock Mini-Cell	Life Technologies	EI0001
UltraPure 10 mg/ml Etidio bromuro	Life Technologies	15585-011
7900HT Sistema PCR rapido in tempo reale	Life Technologies	Life Technologies 4329001	blocco a 384 pozzetti
DynaMag-96 Side Skirted	Life Technologies	12027
SpectroMax M2 Multi-Mode Lettore di micropiastre	Molecular Devices/VWR	89429-532
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204
Perline in acciaio inossidabile	Qiagen	69989	5 mm
CLC Genomics Workbench	Qiagen		Software per la pipeline di metilazione
QIAQuick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	50 rxn
TissueLyser II	Retsch/Qiagen	85300
Acqua senza nucleasi	Sigma	W4502
TRIS cloridrato	Sigma	PHG0002-100G
Tween-20	Sigma	P9416-50ML
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
Piastra a gonna intera a 384 pozzetti, Standard	Thermo Scientific	AB-1384
Absolute qPCR Seal	Thermo Scientific	AB-1170
EZ Kit di metilazione-fulmine del DNA	Zymo Research	D5030	50 rxn
ZymoTaq DNA polimerasi	Zymo Research	E2001	50 rxn