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Articolo metodologico

Indagare Mast Cellula secretoria Granuli; dal Biosintesi a Esocitosi

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DOI:

10.3791/52505

⸱

26 gennaio 2015

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Division of Allergy and Immunology, Department of Pediatrics, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, University of Cincinnati College of Medicine, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences, Tohoku University

In questo articolo

Sommario

L'obiettivo del presente protocollo è stato quello di sviluppare un metodo che permetterà analisi di genomica funzionale della secrezione mastociti. Il protocollo si basa sulla valutazione quantitativa del rilascio di un gene reporter fluorescente cotrasfected con il gene di interesse e l'analisi in tempo reale della morfologia del granulo secretorio.

Abstract

Mastociti (MC) sono cellule secretorie del sistema immunitario che svolgono le loro funzioni fisiologiche e patologiche rilasciando mediatori allergici, infiammatorie e immunomodulanti preformati e di nuova sintesi. Mediatori MCs 'riguardano diversi tessuti e organi che culminano nelle risposte allergiche e immunitarie. La sintesi, lo stoccaggio e il rilascio dei mediatori MC sono altamente regolamentati. I mediatori preformati sono confezionati in granuli secretori citoplasmatici (SG), che si fondono con la membrana plasmatica e rilasciano il loro contenuto per esocitosi regolata. Presentiamo un protocollo, basata sulla co-espressione di un gene di interesse con un gene reporter che si rivolge alla SGS e viene rilasciato in modo regolato fianco dei mediatori endogeni SG. Il protocollo consente di alta risoluzione quattro confocale tridimensionale analisi del MC SGS e il controllo della loro linea temporale dal biogenesi a esocitosi innescato. Così, con questo protocollo per lo screening dei geni di Interest per il loro impatto fenotipica e funzionale permette di decifrare i meccanismi molecolari che regolano la biogenesi e esocitosi del MC SGS e identificare i regolatori coinvolti. In tal modo, dovrebbero essere fornite ulteriori informazioni sui meccanismi cellulari che rappresentano la funzione MCs in salute e malattia.

Introduzione

Mastociti (MC) sono cellule immunitarie che sono più noti per il loro coinvolgimento nelle reazioni allergiche e infiammatorie come l'artrite, l'asma, esofagite eosinofila, dermatite cronica e shock anafilattico 1,2 così come altre patologie tra cui la malattia coronarica e 3,5 cancro 3,4. Inoltre, MCs svolgono un ruolo importante in innata e adattativa, sia in difesa dell'ospite contro i batteri e parassiti e dalla soppressione delle risposte immunitarie, ad esempio inducendo la tolleranza dell'organo trapiantato 5,6.

MCs provengono dal midollo osseo, lo sviluppo di CD34 + / CD117 + cellule progenitrici pluripotenti 7. Committed midollo osseo MC progenitori vengono rilasciati nel sangue e migrano nei tessuti periferici localizzative prevalentemente all'interno dei tessuti connettivi e superfici epiteliali 8. Maturazione e differenziazione terminale vengono poi raggiunti sotto l'influenza of citochine all'interno l'ambiente circostante 8,9.

MCs possono essere attivati ​​da un allergene (antigene, Ag), il cui incontro portato alla generazione di immunoglobulina E (IgE) tipo anticorpi. Il legame di tale IgE ai recettori FcεRI del MC, seguito da reticolazione di cellula legata IgE upon riesposizione allo stesso Ag, provoca l'aggregazione FcεRI e apertura di una cascata di segnalazione che culmina in degranulazione [recensione in 10,11] . MCs sono attivati, indipendentemente da IgE, da neuropeptidi 5,12, le tossine 13, batterica e antigeni virali 14,15, un numero di peptidi caricati positivamente collettivamente come secretagoghi di base, le cellule immunitarie e citochine 5,13,12,16 , 17. MCs sono anche attivati ​​da molti dei propri mediatori rilasciati, che amplificano ulteriormente la risposta infiammatoria.

MCs sono confezionati con granuli di secreto (SGS) che contengono immunomediatori regolamentari, anche amine vasoattive, come l'istamina e la serotonina (in roditori), proteoglicani, proteasi, come chimasi e triptasi, fattore di crescita vascolare endoteliale e diverse citochine e chemochine 8,9. Questi mediatori sono "pronti a partire" e una volta MCs sono attivati ​​da uno stimolo adeguato, questi mediatori vengono rilasciati dalle cellule di esocitosi regolata (degranulazione) in pochi secondi a minuti 18,19. Questo evento iniziale è seguita dalla sintesi de novo e il rilascio di una vasta gamma di sostanze biologicamente potenti, tra metaboliti dell'acido arachidonico, più citochine e chemochine 20,21,22. Rilascio di prodotti di nuova sintesi si verifica indipendentemente dal rilascio SG. Collettivamente, questi mediatori avviare prime e fase tardiva infiammatori e allergici risposte. Pertanto, la comprensione dei meccanismi che rappresentano per l'attivazione e la degranulazione MC sono entrambi di imp teorica e clinicaortance.

La difficoltà di manipolare geneticamente MCs primarie e coltivate ha ostacolato i tentativi di chiarire i meccanismi alla base MC degranulazione, che è rimasto mal risolti. Per ovviare a questo problema abbiamo sviluppato un giornalista saggio basato da co-trasfezione linea cellulare della mucosa mast, rat leucemia basofili (RBL) -2H3 (di seguito denominato RBL) o di midollo osseo derivate MCs (BMMCs) 30 con un gene di interesse e neuropeptide Y (NPY) fusa RFP monomero (MRFP), come SG giornalista.

NPY è stato precedentemente dimostrato di ricapitolare il comportamento dei marcatori SG endogeni in altri sistemi. Inoltre, perché MRFP fluorescenza è pH insensibile, espressione di NPY-MRFP consente la visualizzazione delle SG acidi e valutazione quantitativa di esocitosi utilizzando piastre da 96 pozzetti e un lettore di fluorescenza. Abbiamo dimostrato che NPY-MRFP viene consegnato al SGS acide delle cellule RBL e BMMCs e viene rilasciato dalle cellulein modo regolato lungo il SG carico endogena (cioè, β-esosaminidasi e serotonina) 30, 32. Questo protocollo fornisce una metodologia di imaging-based ad alta risoluzione che permette di geni di screening di interesse per la loro fenotipica e l'impatto funzionale su caratteristiche SG e degranulazione in cellule RBL 32. In particolare, questo protocollo permette il monitoraggio in tempo reale di MC SGS e quantificazione della loro area o dimensioni del volume, il loro numero, la cinetica di assemblaggio, il loro movimento lungo il citoscheletro cellulare e la loro ultima fusione con la membrana plasmatica in condizioni diverse. Ad esempio, sensibilizzando le cellule con DNP-IgE specifiche e innescando le cellule con un Ag polivalente (DNP coniugato albumina sierica) in diverse perturbazioni (ad esempio, l'abbattimento dei geni di interesse, oltre l'espressione di geni wt o mutanti, o manipolazioni farmacologiche) e confronto alle cellule di controllo.

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Protocollo

1. Preparazione di RBL Cellulari Media Cultura

  1. Mescolare 500 ml di mezzo modificato Eagle glucosio basso di Dulbecco (DMEM) con 56 ml di siero fetale bovino (questo fa 10% FBS), e poi aggiungere 5,5 ml di penicillina streptomicina (questo fa ~ 1% PEST).
  2. Filtrare il mezzo utilizzando 500-1000 ml Bottle-Top Filtri vuoto con 0,22 micron dimensione dei pori e conservare a 4 ° C.

2. coltura di cellule RBL

  1. Grow cellule RBL in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 a 37 ° C sia in lastre o flaconi. Cellule RBL che stanno crescendo in 10 centimetri piastre devono essere integrati con 10 ml di media e formano monostrato confluente di ~ 10 7 cellule / piastra.
  2. Quando lo strato di cellule si avvicina confluenza, replate la coltura ad una densità inferiore.
    1. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra / beuta usando una pipetta pasteur sterile collegata al vuoto.
    2. Sciacquare il monostrato cellulare con preriscaldata (37° C) 0,25% tripsina / EDTA che copre tutta monostrato (il volume dipende dalle dimensioni della piastra di coltura / beuta; 2 ml da 10 cm Piatto). Ciò staccare le cellule.
    3. In alternativa, lavare il monostrato cellulare con tampone fosfato (PBS), togliere la PBS e aggiungere preriscaldata (37 ° C) tripsina / EDTA. Questo passaggio stacca le cellule più veloce.
    4. Posizionare la piastra / beuta in un incubatore a 37 ° C (non più di 10 min).
    5. Ispezionare le cellule sotto il microscopio ottico per controllare se hanno staccato. Se le cellule non si staccano dopo 10 min, picchiettare delicatamente sulla piastra / fiasco.
    6. Aggiungere mezzo alla piastra di coltura / beuta di sospendere le cellule (il volume del mezzo deve essere di almeno 2 volte superiore al volume della soluzione di tripsina).
    7. Agglomerare le cellule per centrifugazione per 3 min a 200 ga 25 ° C.
    8. Risospendere le cellule in medium. Diluire le cellule 01:10 e seminare in un nuovo piatto cultura. Incubare le cellule per 48-72 ore, fino a quando non REACh circa il 90% di confluenza.
    9. Ripetete la stessa procedura (sezione 2.2.1-2.2.8) per un massimo di 3 mesi (30 passaggi).

3. Preparazione di Transfection media.

  1. Preparare una soluzione 100 mM di K-Pipes pH 7, soluzione 1 mM di Ca 2+ acetato e soluzione 100 mM di acetato di Mg 2+.
  2. Diluire soluzione mM 100 di K-Pipes pH 7 in 20 mM con DMEM media, aggiungere la soluzione 1 mM di Ca 2+ acetato ad una concentrazione finale di 10 mM e 100 mM di soluzione di acetato di Mg 2+ ad una concentrazione finale di 2 mm.
  3. Pesare glutammato potassio e aggiungere alla soluzione ad una concentrazione finale di 128 mM, mescolare bene e mantenere a 4 ° C fino al momento dell'uso. Mantenere le restanti soluzioni (es., K-Tubi, Ca 2+ acetato, Mg 2+ acetato) a -20 ° C.

4. Trasfezione delle cellule RBL

  1. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra / beuta utilizzando unsterile pipetta pasteur collegata al vuoto.
  2. Sciacquare il monostrato cellulare con preriscaldata (37 ° C) tripsina / EDTA che dovrebbe coprire l'intero monostrato. Posizionare la piastra / beuta in un incubatore a 37 ° C (non più di 10 min). Controllare se le cellule hanno staccato con il microscopio ottico.
  3. Aggiungere mezzo alla piastra di coltura / beuta di sospendere le cellule (il volume dei media dovrebbe essere di almeno 2-grande più del volume della soluzione tripsina).
  4. Contare il numero di cellulare utilizzando emocitometro.
  5. Pellet 1,5 × 10 7 cellule mediante centrifugazione per 3 min a 200 xg a 25 ° C. Eliminare il surnatante e aggiungere 280 ml di media trasfezione. Trasferire la miscela di reazione in 4 millimetri cuvetta.
  6. Aggiungere 20 mg di NPY-MRFP plasmide e uno di 30 microgrammi di plasmide di controllo vuota o un plasmide testato. Il volume finale della miscela di reazione deve essere di 300 microlitri.
  7. Porre immediatamente in ghiaccio per 10 min. Pulire la cuvetta dall'acqua residua e proceed di elettroporazione a 300 V per 9 msec.
  8. Per le misure di esocitosi, replate immediatamente le cellule in 24 e piastre di coltura dei tessuti contenenti 300 ml di media. Aggiungere 8 ml di miscela di reazione (4 × 10 5 cellule) a ciascun pozzetto. Aggiungi cellule 4 × 10 5 non trasfettate per pozzi addizionali per il controllo. Preparare sufficienti pozzetti per avere almeno pozzetti duplicati per ogni trattamento per ogni trasfezione.
  9. Per la microscopia lasso di tempo, replate immediatamente le cellule in un sistema coverglass borosilicato camera 8-pozzetti contenenti 80 microlitri di media. Aggiungere 1,5 ml di miscela di reazione (7,5 × 10 4 cellule) per ciascuna camera. (Prova per evitare di utilizzare le camere a bordo del coprioggetti, le camere al centro della coprioggetti sono più facili da immagine).
    NOTA: È importante sottolineare che non tutte le cellule di risposta a un trigger e, occasionalmente, la microscopia time-lapse è abrogata a causa della perdita di concentrazione e deriva della borosi camera 8-benesistema coprioggetti licate. Pertanto, preparare almeno 8 camere per ogni trattamento per ogni trasfezione.
  10. Per sensibilizzare le cellule per FcεRI attivazione mediata, aggiungere 1 mg / ml di topo DNP monoclonale specifico IgE ai media (incubare le cellule con IgE per almeno 2 ore).
  11. Dopo 18-24 ore di utilizzare un microscopio a fluorescenza per confermare che le cellule esprimono i plasmidi. I eccitazione e di emissione di fluorescenza MRFP sono: λEx 584, λEm 607 nm. NPY-MRFP dovrebbe apparire in strutture vescicolari che corrispondono ai SG. Se il secondo gene di interesse è fuso a un tag fluorescente utilizzare un microscopio a fluorescenza per confermare la co-espressione di due plasmidi alle stesse cellule. Ad esempio, se il gene testato è fuso con GFP, le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di fluorescenza GFP sono: λEx 488, λEm 507 nm. La proteina GFP tag dovrebbe apparire le stesse cellule che esprimono NPY-MRFP.
  12. Per misure esocitosi procedere to punto 5 e per la microscopia lasso di tempo, procedere al punto 6.

5. Misura NPY-MRFP Esocitosi

  1. Preparazione del tampone di Tyrode:
    1. Preparare una soluzione di 54 mM KCl, 20 mM MgCl 2, 2.74 M NaCl e 8 mm NaH 2 PO 4 in DDW. Mescolare bene e conservare a 4 ° C. Questo passo è per la preparazione di 20x tampone Tyrode.
    2. Preparare una soluzione di 20 mM Hepes pH 7, 1.8 mM CaCl 2, 1 mg / ml BSA, 5.6 mM glucosio e da 1 a 20 diluizione Tyrode 20x in DDW e mescolare bene. Questo passo è per la preparazione di 1x tampone Tyrode.
    3. Aliquota del buffer 1x Tyrode e conservare a -20 ° C. Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti.
  2. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra 24 pozzetti e lavare 3 volte con tampone di Tyrode. Preparare le cellule stimolate con l'aggiunta di 200 microlitri di buffer Tyrode per controllare i pozzi.
  3. Preparare 10 ml / pozzetto di 20X concentrata attivazione reagente [(ad esempio 1.000 ng / ml DNP-BSA o DNP-HSA (Ag), 200 mM Ca 2+ ionoforo (A23187 esempio), e una combinazione di 20 mM Ca 2+ ionoforo e 1000 nM 12-O- tetradecanoylphorbol-13-acetato (TPA)]. Se i reagenti sono conservati in DMSO, diluire i reagenti in 20x concentrazione in tampone di Tyrode contenente 1% DMSO. Incubare a 37 ° C per 30 min.
  4. Rimuovere il surnatante di ciascun pozzetto con attenzione ad una piastra da 96 pozzetti, disporli sul ghiaccio ed evitare dalla luce. (I surnatanti contengono il peptide chimerico NPY-MRFP che è stato rilasciato dalle cellule).
  5. Aggiungere 200 microlitri tampone di Tyrode contenente 0,5% Triton X-100 in ciascun pozzetto ed incubare a 37 ° C per 10 min. (Questo passaggio è importante per la preparazione di lisati cellulari contenenti la restante NPY-MRFP che non è stato rilasciato dalle cellule). Raccogliere i lisati cellulari e versare in un piatto ben 96, disporli sul ghiaccio e di evitare la luce.
  6. Misurare la fluorescenza dei supernatanti cellulari e lisati cellulari utilizzando un flza lettore di piastra, con un 590-, 20 nm di larghezza di banda di eccitazione filtro e 635-filtro emissione di larghezza di banda di 35 nm.
  7. Calcolare la percentuale di NPY-MRFP rilasciato:
    NOTA: La misura lettore di fluorescenza unità fluorescenza arbitrarie (AFU). AFU valori dipendono dalla macchina e la sua sensibilità e l'efficienza di trasfezione.
    1. Impostare l'autofluorescenza delle cellule RBL nontransfected come vuoti. Dividere il AFU di ogni surnatante alla fluorescenza totale (AFU dei surnatanti + AFU della corrispondente lisato) e moltiplicare per 100.

6. Time-lapse Microscopia di Esocitosi

  1. Seed 7.5 × 10 4 della transfettate cellule / camera in un sistema coprioggetti borosilicato camera 8 pozzetti. Dopo 18-24 ore, rimuovere il terreno di coltura dalle camere e lavare 3 volte con tampone di Tyrode
  2. Aggiungere 72 ml di tampone di Tyrode per ciascuna camera. Diluire i reagenti attivanti nel buffer Tyrode a 10x concentrazione.
  3. Utilizzare un microscopio a fluorescenza confocale dotato di una camera riscaldata (37 ° C) e CO 2 di controllo (4,8%) e un obiettivo 40X o 63X. Accendere i sistemi microscopio: lampada al mercurio, computer, e laser. Assicurarsi che la camera riscaldata è alla giusta temperatura prima di avviare l'esperimento.
  4. Posizionare la camera nella camera riscaldata e assicurarsi che la camera sia installato correttamente e stabile.
  5. Accendere la luce di fluorescenza secondo il fluoroforo pertinente e visualizzare le cellule transfettate. Spegnere fluorescenza volta una cellula di interesse nel settore al fine di minimizzare il candeggio e citotossicità. È importante che questo campo conterrà circa 2-3 cellule trasfettate. Le cellule transfettate devono essere ben distribuite ma non si toccano.
  6. Regolare la potenza del laser (a seconda del microscopio) per ridurre il rumore e sovrasaturazione nonché la tossicità, e impostare il guadagno e offset per modificare il rapporto segnale-rumore. Scansione veloce oder per minimizzare la durata di esposizione laser (media 2).
  7. Regolare le dimensioni pinhole ad un massimo, questo consente diminuendo la potenza del laser e mantenere immagini focalizzate per un lungo periodo di tempo. Se lo si desidera, impostare i parametri per lo stack Z per ricostruire l'immagine tridimensionale, regolare la dimensione foro stenopeico di 1 unità arioso (AU), che dà il meglio rapporto segnale rumore e acquisire la scansione successiva di bidimensionali fette ottica confocale in -axes z con fette ottici ≤0.7 micron.
  8. Impostare l'intervallo di tempo tra ogni acquisizione di 15-30 sec e la durata totale di acquisizione per 15 min e cominciare ad acquisire immagini. Dopo 5 minuti di pausa acquisizione della serie storica. Aggiungere 8 ml di trigger 10x e continuare immediatamente l'acquisizione.
  9. Salvare le immagini, eseguire deconvoluzione utilizzando un software deconvoluzione e ricostruire le pile di immagini tridimensionali e di un filmato utilizzando software Imaris.

7. Analisi immagine

  1. Importare i dati dalle immagini della serie tempo deconvoluto che sono stati ottenuti con il microscopio confocale a software Imaris. Questo software legge più di 40 file microscopia. Se il software non è in grado di leggere i file; convertire i file in file TIF e di importazione.
  2. Per aggiungere punti di tempo alla fine di una serie di dati aperta premete Modifica -> Aggiungi Punti Tempo e importare i nuovi set di dati.
  3. Creare la superficie del canale MRFP usando l'opzione wizard di superficie. Scegliere l'algoritmo di default. Scegliere il canale di NPY-MRFP. Segnare l'opzione smoothing per ridurre il rumore. Per evitare la perdita di piccoli dettagli riducono livello dell'area dettaglio 0,05 micron.
  4. Impostare la soglia di intensità. Viene visualizzato Nuovo superficie grigia. Vai su "Impostazioni" e cambiare lo stile da "Punto centrale" a "Surface".
  5. Vai alla scheda statistica nelle proprietà dell'oggetto selezionato, selezionare la scheda dettagliata e il valore specifico such come intensità di fluorescenza, volume, ecc
  6. Rivedere i dati e verificare che i valori siano compatibili con le immagini. Per esempio, due o più granuli adiacenti possono essere misurate come uno granello grande. Per quantificare la dimensione media dei granuli dividere la dimensione dei granuli uniti al numero effettivo di granuli.
  7. Esportare i set di dati desiderati in file Excel e analizzare i dati.
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Risultati

A causa della bassa efficienza di trasfezione di MC, manipolazioni genetiche è improbabile che lasciare un impatto sulle letture di secrezione media misurate dai mediatori endogeni SGS. Tuttavia, stabilendo completa co-espressione del gene reporter NPY-MRFP e il plasmide co-trasfettato nelle stesse cellule, monitoraggio dei risultati NPY-MRFP nel monitoraggio esclusivamente popolazione cellulare che esprime il gene di interesse. Pertanto, il vantaggio di questo test rispetto ai metodi convenzionali è la capacità di cont...

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Discussione

Descriviamo una strategia innovativa che combina la quantificazione di MCs esocitosi e quattro (x, y, z, t) quantificazioni dimensione da immagini tridimensionali e ritardi delle SG in cellule viventi con un gene reporter per esocitosi. Questa tecnica consente proiezione di famiglie di proteine ​​per il loro impatto sulla funzione MC come SGs monitoraggio inizio già a loro uscita dal Golgi attraverso la loro maturazione, acquisizione di competenze esocitosi e degranulazione. La combinazione di misure di esocitosi insiem...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse finanziari.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Dr. U. Ashery per il dono di NPY-MRFP cDNA. Ringraziamo Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani, e Y. Zilberstein per la preziosa assistenza di microscopia e analisi dell'immagine. Ringraziamo anche il Dr. Joseph Orly per la lettura critica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Israel Science Foundation, fondata dall'Accademia di Israele per le Scienze (1139-1112 di RS-E.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEMSigma-AldrichD6046-500MLCaldo in 37 gradi C bagno d'acqua prima dell'uso
Fetale Bovino SieroGE assistenza sanitaria Scienze della vitaSH30071.01
Penicillina-StreptomicinaTecnologie
Membrana in acetato di cellulosa, dimensione dei pori 0,22   μ mSigma-AldrichCLS430769-1EA
Piastre di coltura trattate con coltura tissutale CorningSigma-AldrichCLS430167
Soluzione di tripsina/EDTA (TE)Tecnologie di vitaR001100Warm in 37 ° C bagnomaria prima dell'uso
TUBI sale dipotassicoSigma-Aldrich108321-27-3 
Acetato di calcio idratoSigma-Aldrich114460-21-8
Acetato di magnesio tetraidratoSigma-AldrichM5661 
Acido L-glutammico sale di potassio monoidrato (glutammato di potassio)Sigma-AldrichG1501
4 mm elettroporazione cuvetteprogetti cellulariEP-104
GENE PULSER CON CONTROLLER DI IMPULSI & CAPACITANCEBio rad
Coverglass a cameraThermo scientific155411
24 pozzetti, fondo piattoSigma-AldrichCLS3524
Corning Piastre a 96 pozzettiSigma-AldrichCLS3367 o CLS390
Lettore di fluorescenza per piastre a 96 pozzetti - Infinite 200Tecan
Calcium ionoforo A23187Sigma-AldrichC7522Evitare dall'esposizione diretta alla luce
12-O-tetradecanoyl-13-acetato (TPA)CalbiochemP3766
anti-DNP monoclonale IgESigma-AldrichD8406 
DNP-BSA/ DNP-HASSigma-AldrichA6661Evitare l'esposizione alla luce diretta
Triton-x-100Sigma-AldrichT8787
Microscopio confocale fluorescente:
Zeiss LSM 510
LeicaSP5
Nikon A1 invertito
Software ImarisBITLANE
Microsoft exel o Prism o altri software
Altri reagenti:
Cloruro di magnesioMERK5833
Cloruro di sodioMERK6404
Cloruro di calcioMERK2382
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichA4503
GlucosioBDH Laboratories284515V
Fosfato monosodico MERK5345
Acqua
di vitadi analisi sterile

Riferimenti

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