Imaging locale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Segnali in cellule di mammifero coltivate

Jeffrey T. Lock; Kyle L. Ellefsen; Bret Settle; Ian Parker; Ian F. Smith

doi:10.3791/52516

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Articolo metodologico

Imaging locale Ca

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DOI:

10.3791/52516

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3 marzo 2015

Jeffrey T. Lock¹ , Kyle L. Ellefsen¹ , Bret Settle¹ , Ian Parker¹^,² , Ian F. Smith¹

¹Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, ²Physiology and Biophysics, University of California, Irvine

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo tecniche per l'imaging di eventi locali di Ca²⁺ mediati da IP₃ utilizzando la microscopia a fluorescenza in cellule di mammifero intatte caricate con indicatori di Ca²⁺ insieme a un algoritmo che automatizza l'identificazione e l'analisi di questi eventi.

Abstract

Ca citosolico ^{2 +} ioni regolano numerosi aspetti della attività cellulare in quasi tutti i tipi di cellule, il controllo dei processi più ampio respiro, come la trascrizione genica, eccitabilità elettrica e la proliferazione cellulare. La diversità e la specificità di Ca ²⁺ segnale deriva da meccanismi con cui Ca ²⁺ segnali vengono generati ad agire su diversi temporali e spaziali scale, che vanno da oscillazioni e onde a livello delle cellule che si verificano durante i periodi di minuti per locali transitorie Ca ²⁺ microdomini (Ca ²⁺⁾ sbuffi millisecondi duraturi. I recenti progressi nella elettroni moltiplicati CCD (EMCCD) telecamere ora consente l'imaging di locali Ca ²⁺ segnali con una risoluzione spaziale 128 x 128 pixel a velocità> 500 fotogrammi sec ^-1 (fps). Questo approccio è altamente parallelo e consente il monitoraggio simultaneo di centinaia di canali o siti sfoglia in un singolo esperimento. Tuttavia, la grande quantità di dati generati (ca. 1 pe Gbr min) rendono identificazione visiva e l'analisi di Ca ²⁺ locale eventi impraticabile. Qui si descrivono e dimostrare le procedure per l'acquisizione, la rilevazione e l'analisi di IP locale ₃ mediata Ca ²⁺ segnali nelle cellule dei mammiferi intatte cariche di Ca ²⁺ indicatori utilizzando sia a livello di campo epi-fluorescenza (WF) e la riflessione interna totale fluorescenza (TIRF) microscopia. Inoltre, descriviamo un algoritmo sviluppato all'interno del software dell'ambiente Python open-source che automatizza l'identificazione e l'analisi di questi locali Ca ²⁺ segnali. L'algoritmo localizza i siti di rilascio di Ca ²⁺ con una risoluzione sub-pixel; permette recensione dei dati; e uscite sequenze temporali di segnali rapporto di fluorescenza con ampiezza e dati cinetici in una tabella compatibile con Excel.

Introduzione

Ioni calcio (Ca ²⁺⁾ regolano ubiquitariamente una vasta gamma di processi biologici, tra cui l'espressione genica, la secrezione e cambiamenti duraturi nella plasticità sinaptica ^1. Un modo attraverso il quale Ca ²⁺ può agire in modo così eterogeneo è attraverso i diversi modelli spaziali e temporali di Ca ²⁺ segnala una cellula in grado di generare. Ad esempio aumenti globali in citosolico [Ca ^2+] contrazione grilletto nel tessuto muscolare liscio ² mentre più piccola, aumenti transitori localizzati (locali Ca ²⁺ microdomini) stimolare l'espressione genica indispensabile per l'a....