Imaging locale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Segnali in cellule di mammifero coltivate

Sommario

Qui presentiamo tecniche per l'imaging di eventi locali di Ca²⁺ mediati da IP₃ utilizzando la microscopia a fluorescenza in cellule di mammifero intatte caricate con indicatori di Ca²⁺ insieme a un algoritmo che automatizza l'identificazione e l'analisi di questi eventi.

Abstract

Ca citosolico ^{2 +} ioni regolano numerosi aspetti della attività cellulare in quasi tutti i tipi di cellule, il controllo dei processi più ampio respiro, come la trascrizione genica, eccitabilità elettrica e la proliferazione cellulare. La diversità e la specificità di Ca ²⁺ segnale deriva da meccanismi con cui Ca ²⁺ segnali vengono generati ad agire su diversi temporali e spaziali scale, che vanno da oscillazioni e onde a livello delle cellule che si verificano durante i periodi di minuti per locali transitorie Ca ²⁺ microdomini (Ca ²⁺⁾ sbuffi millisecondi duraturi. I recenti progressi nella elettroni moltiplicati CCD (EMCCD) telecamere ora consente l'imaging di locali Ca ²⁺ segnali con una risoluzione spaziale 128 x 128 pixel a velocità> 500 fotogrammi sec ^-1 (fps). Questo approccio è altamente parallelo e consente il monitoraggio simultaneo di centinaia di canali o siti sfoglia in un singolo esperimento. Tuttavia, la grande quantità di dati generati (ca. 1 pe Gbr min) rendono identificazione visiva e l'analisi di Ca ²⁺ locale eventi impraticabile. Qui si descrivono e dimostrare le procedure per l'acquisizione, la rilevazione e l'analisi di IP locale ₃ mediata Ca ²⁺ segnali nelle cellule dei mammiferi intatte cariche di Ca ²⁺ indicatori utilizzando sia a livello di campo epi-fluorescenza (WF) e la riflessione interna totale fluorescenza (TIRF) microscopia. Inoltre, descriviamo un algoritmo sviluppato all'interno del software dell'ambiente Python open-source che automatizza l'identificazione e l'analisi di questi locali Ca ²⁺ segnali. L'algoritmo localizza i siti di rilascio di Ca ²⁺ con una risoluzione sub-pixel; permette recensione dei dati; e uscite sequenze temporali di segnali rapporto di fluorescenza con ampiezza e dati cinetici in una tabella compatibile con Excel.

Introduzione

Ioni calcio (Ca ²⁺⁾ regolano ubiquitariamente una vasta gamma di processi biologici, tra cui l'espressione genica, la secrezione e cambiamenti duraturi nella plasticità sinaptica ^1. Un modo attraverso il quale Ca ²⁺ può agire in modo così eterogeneo è attraverso i diversi modelli spaziali e temporali di Ca ²⁺ segnala una cellula in grado di generare. Ad esempio aumenti globali in citosolico [Ca ^2+] contrazione grilletto nel tessuto muscolare liscio ² mentre più piccola, aumenti transitori localizzati (locali Ca ²⁺ microdomini) stimolare l'espressione genica indispensabile per l'apprendimento e la memoria ^3.

Citosolico libero [Ca ^2+] viene mantenuta a ~ 100 nm a riposo, ma può rapidamente salire a diversi micro-molare dopo l'afflusso di Ca ²⁺ nel citoplasma attraverso Ca ²⁺ canali ionici -permeable situati nella membrana plasmatica e la liberazione di Ca ²⁺ da s intracellulariTores. Il nostro laboratorio si concentra sulla inositolo 1,4,5-trifosfato recettore (IP ₃ R), che forma un canale di rilascio Ca ²⁺ trova nella membrana del reticolo endoplasmatico (ER). In seguito al legame di entrambi IP ₃ e Ca ²⁺ al citosolico attivando siti del recettore, il canale IP ₃ R apre per liberare Ca ²⁺ sequestrato nel lume ER. Il rilascio di Ca ²⁺ può rimanere spazialmente limitata ad un piccolo gruppo di IP ₃ Rs per generare un microdomini citosolico locale del Ca ²⁺ (Ca ²⁺ sfoglia ⁴⁾ oppure, a seconda della prossimità del cluster vicini di IP ₃ Rs, può propagare una cella con l'assunzione di più siti sfoglia attraverso un processo di Ca ²⁺ indotta Ca ²⁺ -release (CICR) ^5,6.

L'introduzione di piccole molecole fluorescenti Ca ²⁺ indicatore coloranti sviluppato da Roger Tsien ^7, insieme con avanzate di microscopia Imagitecniche ng, ha notevolmente facilitato la nostra comprensione di Ca ²⁺ segnalazione. I recenti progressi nella telecamere utilizzate per microscopia permettono ora per l'imaging transitori locali Ca ²⁺ eventi come sbuffi con risoluzione spaziale e temporale senza precedenti. Attualmente disponibili telecamere EMCCD consentono di imaging con 128 x 128 pixel a> 500 fotogrammi sec ^-1 (fps) e la nuova generazione di complementari a semiconduttore metallo-ossido (CMOS) telecamere forniscono pixel di risoluzione più alta, e la velocità ancora più veloce a scapito della leggermente superiore livelli di rumore. In combinazione con la riflessione interna (TIRF) microscopia totale è ora possibile per singola immagine Ca ²⁺ eventi di canale ^8,9. Questo approccio permette di immagini di centinaia di canali / eventi contemporaneamente, mentre la generazione di grandi quantità di dati (circa 1Gb al minuto) che rendono l'elaborazione manuale, identificazione visiva e l'analisi impraticabile e pongono un onere per lo sviluppo di algoritmi automatizzati.

Qui, vi presentiamo le procedure e protocolli per l'imaging locali Ca ²⁺ segnali nelle cellule di mammifero intatte utilizzando fluorescenti Ca ²⁺ indicatori. Dimostriamo inoltre un algoritmo sviluppato in ambiente Python open-source che automatizza l'identificazione e l'analisi dei locali Ca ²⁺ eventi immaginati sia TIRF e convenzionale ampio campo epi-fluorescenza (WF) microscopia. Anche se descriviamo questi approcci nel contesto di IP ₃ -Generata Ca ²⁺ segnali, essi sono facilmente suscettibili di studiare i cambiamenti locali in citosolico [Ca ^2+] provenienti da una varietà di Ca ²⁺ canali ionici -permeable situate sia in superficie membrana o organelli intracellulari ^8-10.

Protocollo

Vi presentiamo le procedure dettagliate per l'imaging locali Ca ²⁺ eventi nelle cellule SH-SY5Y neuroblastoma umano. Tali procedure possono essere adattati a immagine intracellulare Ca ²⁺ segnali in molti tipi cellulari ^8-10.

1. Preparazione di cellule

1. Cultura le cellule per essere ripreso secondo le istruzioni elencate sul sito web del fornitore.
2. Pochi giorni prima di imaging, le cellule coltivate raccolto in un pallone di coltura di tessuto utilizzando 1 ml di 0,25% tripsina / EDTA (2-3 min). Dopo il distacco, aggiungere un volume uguale di terreni di coltura per inattivare la tripsina.
3. Eseguire un numero di cellule utilizzando un emocitometro e sementi cellule in piatti di imaging con fondo di vetro ad una densità di 3-7 x 10 ⁴ cellule per piatto. Selezionare le celle per esperimenti di imaging quando raggiungono il 60% di confluenza (2-3 giorni).

2. preparazione di soluzioni e reagenti

1. Preparare un Ca ²⁺ -contenenti HEPES bufferedsoluzione salina (Ca ²⁺ -HBSS) composto (mM): 135 NaCl, KCl 5,4, 2 CaCl _2, 1 MgCl _2, 10 e 10 HEPES, glucosio; pH = 7,4 a temperatura ambiente (RT) con NaOH. Preparare Ca ²⁺ -HBSS senza l'aggiunta di glucosio e conservare a 4 ° C; aggiungere alla soluzione di glucosio immediatamente prima dell'uso.
2. Solubilizzare forme membrana permeanti della fluorescenza Ca ²⁺ indicatore Cal-520 (1 mM), CI-IP ₃ (200 mM), e EGTA (100 mM) in dimetil solfossido (DMSO) contenente il 20% Pluronic F-127. Aliquota questi reagenti in provette Eppendorf e conservare, al riparo dalla luce e dall'umidità, a -20 ° C.

3. celle di carico con membrana permeabile Cal-520, ci-IP ₃ e EGTA

1. Preparare il "tampone di caricamento" diluendo soluzioni di riserva di membrana permeabile Cal-520 e ci-IP ₃ ad una concentrazione finale di 5 micron e 1 micron, rispettivamente, a Ca ²⁺ -HBSS.
2. Aspirare cusupporti lture e risciacquare cellule sostituendo media con Ca ²⁺ -HBSS tre volte.
3. Rimuovere Ca ²⁺ -HBSS e incubare cellule in tampone di caricamento per 60 minuti a temperatura ambiente al buio.
4. Rimuovere tampone di caricamento e lavare le cellule sostituendo media con Ca ²⁺ -HBSS tre volte.
   1. Se lo si desidera, in questa fase, celle di carico con EGTA / AM diluendo la soluzione madre di una concentrazione finale di 5 micron di Ca ²⁺ -HBSS e poi incubare cellule per 30-60 min a RT al buio. A seguito di questa incubazione, lavare le cellule tre volte con Ca ²⁺ -HBSS prima di procedere alla fase 3.5.
5. Incubare le cellule a Ca ²⁺ -HBSS per 30 minuti per consentire la de-esterificazione di reagenti caricati.
6. Immediatamente prima di imaging, sostituire Ca ²⁺ -HBSS con "fresco" Ca ²⁺ -HBSS per rimuovere il colorante che potrebbe essere fuoriuscito nella vasca durante l'incubazione finale.

4. Ca ²⁺ Acquisizione Immagine

1. Mettere una piccola goccia di olio per immersione sul 'obiettivo 100X APO TIRF (NA 1.49).
2. Montare il piatto di imaging sul palco del microscopio invertito e portare le cellule a fuoco con luce trasmessa. È importante proteggere il piatto di imaging per evitare movimenti durante la registrazione.
3. Illuminare le cellule con un laser 488 nm per eccitare Cal-520 e raccogliere fluorescenza emessa (λ> 510 nm) utilizzando una fotocamera EMCCD ad alta velocità.
   NOTA: Il pacchetto software che opera il microscopio consente all'utente di tradurre una lente di focalizzazione consentendo il fascio laser da introdurre sia sul bordo estremo della apertura posteriore dell'obiettivo (per TIRF eccitazione) o più centralmente (per l'eccitazione "WF").
4. Utilizzando il software EMCCD, ridurre il campo dell'imaging dai pieni 512 x 512 pixel per raccogliere dati a risoluzione temporale necessaria per catturare locali Ca ²⁺ eventi.
   NOTA: Per esempio, quad centroacquisizione di 256 x 256 pixels accelera il tasso di acquisizione di 66 fps. È anche possibile aumentare ulteriormente la frequenza di quadro della telecamera EMCCD a 500 fps utilizzando una funzione modalità coltura isolata.
5. Configurare il software per registrare automaticamente pochi secondi di attività di base, fornire un lampo UV alle cellule e continuare la registrazione per altri 10-30 secondi.
   NOTA: Un flash UV viene trasportato utilizzando una sorgente di luce ad arco allo xeno introdotto attraverso un UV riflettente specchio dicroico nella porta posteriore del microscopio. La durata e l'intensità del flash UV è regolata empiricamente ad evocare una frequenza desiderata di locali Ca ²⁺ eventi.
6. Salvare i file come immagine pile per l'analisi off-line.

5. Automated Ca ²⁺ Analysis Immagine

NOTA: E 'possibile visualizzare, elaborare e analizzare i dati acquisiti utilizzando molti pacchetti software commerciali. Tuttavia, abbiamo sviluppato un algoritmo per automatizzare rapidamente all'identificazione di und analisi dei locali Ca ²⁺ segnali. Una descrizione dettagliata dei filtri spaziali e temporali utilizzati in questo algoritmo, generazione di Af / F ₀ e identificazione / analisi di routine può essere trovato in ^11. Questo algoritmo è stato sviluppato per funzionare su piattaforma software Python open-source, e può essere ottenuto, insieme ai campioni di dati sperimentali e istruzioni di utilizzo, inviando l'autore corrispondente (ismith@uci.edu).

1. Convertire i file da importare nella algoritmo personalizzato scritto nel formato di file multi-piano .tiff.
2. Individuare la cartella che contiene l'algoritmo di analisi e fare doppio clic run.exe.
3. Selezionare il file .tiff da analizzare.
4. Scegli parametri di analisi nella finestra di dialogo aperta. Vedi Figura 2A per i parametri di default per i dati di esempio.
5. Determinare il livello di nero per essere compensato dalla pila dell'immagine o spostando il cursore su una parte del campo di vista che fa not contengono una cella (Figura 2B) o inserendo manualmente un livello di nero con il prompt 'Set Black Level'.
6. Osservare quattro finestre sullo schermo seguente analisi dal software (Figura 2C-F). C è una immagine in bianco e nero di riposo di fluorescenza dalle cellule in fase di analisi. Quadrati bianchi sovrapposti su questa immagine sono i luoghi per eventi, determinati come le posizioni baricentro delle funzioni gaussiana bidimensionali dotati di eventi.
7. Clicca su ogni luogo dell'evento o premere i tasti cursore per scorrere tra gli eventi. Fatto questo il background-sottratto, gaussiana lisciato cambiamenti rapporto di fluorescenza (Af / F ₀₎ a ciascuno di questi update siti finestra D.
   NOTA: Red evidenziato eventi sono determinati a provenire da quel particolare sito e non da 'sanguinare-through' dall'attività localizzata a siti adiacenti. La traccia blu inferiore indica se il segnale di fluorescenza al sito selezionato superato il rilevamentosoglia, mentre la linea nera identifica eventi provenienti da quel particolare sito (corrispondente al rosso eventi evidenziata).
8. Clicca su un rosso evidenziato evento per aggiornare finestra E che mostra l'evoluzione temporale della manifestazione, e finestra F che mostra il profilo spaziale della manifestazione mediata su suo sviluppo nel tempo, insieme con il profilo spaziale della funzione gaussiana attrezzata.
9. Rivedere manualmente gli eventi che sono stati identificati in modo che gli artefatti possono essere rifiutati dall'analisi. Eliminare tali eventi facendo clic destro rosso evidenziato eventi.
   NOTA: Nelle nostre mani, Ca ²⁺ flusso attraverso i canali singoli IP ₃ R evoca segnali con Af / F ₀ su 0,11, quindi sono suscettibili di essere falsi positivi eventuali "eventi" rilevati sensibilmente più piccoli di questo.
10. Esportazione dei dati selezionando 'Salva in Excel' o esportare i dati su una base per cella disegnando intorno alla cella di interesse e selezionare 'Salva CellR17 ;.
    Nota: i dati vengono salvati nella stessa cartella stack immagine originale.

Risultati

La figura 1A mostra un'immagine WF di riposo Cal-520 di fluorescenza in cellule di neuroblastoma SH-SY5Y umani anche carichi di ci-IP _3. L'esposizione di queste cellule di un lampo di 100 msec UV per foto-release i-IP ₃ suscitato transitori Ca ²⁺ sbuffi in siti discreti (rilevate dai cerchi bianchi in Figura 1A). Tracce di fluorescenza misurati a questi siti hanno mostrato una rapida fase di lievitazione causa aperture transitori di IP ₃

Discussione

Descriviamo qui di protocolli per l'imaging locali Ca ²⁺ eventi in cellule di mammifero utilizzando fluorescenti Ca ²⁺ indicatori. Inoltre, descriviamo un algoritmo con un'interfaccia utente intuitiva che consente di automatizzare l'identificazione e l'analisi dei dati acquisiti. La procedura descritta qui utilizzare la fluorescenza Ca ²⁺ indicatore Cal-520, ma molti altri Ca ²⁺ coloranti sensibili come Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 e Oregon verde BAPTA-1 eseguire suf...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Neuroblastoma umano SH-SY5Y cellule	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropilidene-6-O-(2-nitro-4,5-dimetossi)benzil-mio-inositolo 1,4,5-trisfosfato-esakis(propionossimetile) estere	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronico F127	Invitrogeno	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
Piastre di imaging con fondo in vetro da 35 mm	MatTek	P35G-1.5-14-C