Articolo metodologico

Valutare l'encefalopatia spongiforme trasmissibile Specie Barriere con un

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DOI:

10.3791/52522

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10 marzo 2015

 ,  ,  ,  , 
1USGS National Wildlife Health Center, 2Department of Soil Science, University of Wisconsin–Madison, 3Laboratory of Immunology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 4Merial Veterinary Scholars Program, School of Veterinary Medicine, University of Wisconsin–Madison, 5Department of Neurology, University of British Columbia

In questo articolo

Sommario

Misurare la barriera alla trasmissione interspecie delle malattie da prioni è impegnativo e in genere comporta sfide animali o saggi biochimici. Qui, presentiamo un saggio di conversione della proteina prionica in vitro con la capacità di prevedere le barriere di specie.

Abstract

Gli studi per comprendere la trasmissione interspecie delle encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE, malattie da prioni) sono impegnativi in quanto in genere si basano su lunghi e costosi studi di provocazione animale in vivo. Sono stati sviluppati numerosi saggi in vitro per aiutare a misurare le barriere tra le specie di prioni, riducendo così l'uso da parte degli animali e fornendo risultati più rapidi rispetto ai biotest sugli animali. Qui, presentiamo il protocollo per un test di conversione rapida dei prioni in vitro chiamato test del rapporto di efficienza di conversione (CER). In questo saggio, la proteina prionica cellulare (PrPC) proveniente da un cervello ospite non infetto viene denaturata sia a pH 7,4 che a 3,5 per produrre due substrati. Quando il substrato a pH 7,4 viene incubato con l'agente TSE, la quantità di PrPC che si converte in uno stato resistente alla proteinasi K (PK) viene modulata dalla barriera della specie dell'ospite originale all'agente TSE. Al contrario, la PrPC nel substrato a pH 3,5 è mal ripiegata da qualsiasi agente TSE. Confrontando la quantità di proteina prionica resistente alla PK nei due substrati, è possibile effettuare una valutazione della barriera di specie dell'ospite. Mostriamo che il test CER predice correttamente le barriere note tra le specie di prioni dei topi di laboratorio e, ad esempio, mostriamo alcuni risultati preliminari che suggeriscono che le linci rosse (Lynx rufus) possono essere suscettibili all'agente della malattia del deperimento cronico del cervo dalla coda bianca (Odocoileus virginianus).

Introduzione

Encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE, malattie prioniche) sono un gruppo di malattie neurodegenerative fatali con periodi di incubazione lunghi che interessano una varietà di animali ed esseri umani. L'agente eziologico putativo di TSE comprende un isomero misfolded della proteina prionica host (PrP) che è in grado di auto-propagazione per conversione template-driven della forma cellulare normale PrP (PrP C) in una, associata malattia infettiva forma (PrP TSE) che si accumula nei tessuti del sistema nervoso centrale dell'ospite infettato 1. Prioni mammiferi infettive in genere trasmettono da host-to-host in modo specifico per le specie, che ha dato origine al concetto di "TSE specie barriera" limitare gli eventi di trasmissione interspecie 2. I fattori biologici della barriera prione specie non sono ben compresi. Sequenza aminoacidica somiglianza tra il infettiva PrP TSE e l'host PrP C cUn'influenza fortemente se conversione avviene 3-5, ma rimane insufficiente per spiegare tutti gli eventi di trasmissione dei prioni osservati in vivo 6,7.

Così, la caratterizzazione delle barriere di specie TSE ha largamente invocato studi di provocazione animale: esporre animali ingenui da una determinata specie di prioni da un altro e misurando il tempo di incubazione risultante per l'insorgenza della malattia e il tasso di attacco come indicatori di efficienza di trasmissione. I topi che esprimono PrP C da specie eterologhe sono utilizzati anche per questo tipo di studio 8. I costi associati alla produzione di topo transgenico e biotest prioni prolungati, così come le considerazioni etiche di utilizzo degli animali, sono ostacoli alla ricerca sperimentale di TSE barriere di specie. Valutazione della barriera di specie umana di TSE si basa su topi ingegnerizzati per esprimere umana PrP C. Questi topi richiedono periodi di incubazione lunghi a soccombere alle TSE o modifiche al T umaniegli molecola PrP C umana per la malattia rapida insorgenza 9. Periodi di incubazione delle EST non umano in questi topi possono estendersi oltre la normale durata di vita del mouse facendo interpretazione dei risultati negativi difficili. I primati non umani sono stati utilizzati anche come proxy per lo studio delle barriere di specie umane, ma questi studi sono irto le stesse sfide degli altri tipi di sperimentazione animale e primati non umani non può ricapitolare precisamente malattia procede nell'ospite umano.

Analisi su animali rimangono il metodo "gold standard" per misurare la suscettibilità di una specie di TSE, ma gli ostacoli, i costi e l'etica di questi studi su animali vivi hanno costretto indagini alternative. Un certo numero di saggi in vitro, basati sulla valutazione della conversione di ospitante PrP C ad una proteinasi K (PK) Stato -resistenti (res PrP) quando seminato da PrP TSE, sono stati sviluppati e utilizzati per studiare TSE spECIES barriere 10-12. Esempi di saggi in vitro includono test cell-free di conversione, proteine ​​misfolding di amplificazione ciclica (PMCA), e il rapporto di efficienza di conversione (CER) dosaggio 10-14. Anche se nessuno di questi test tiene conto di fattori periferici coinvolti in barriere di specie dopo l'infezione naturale, tutto può essere utile per identificare gli host potenzialmente sensibili per le TSE.

Qui vi presentiamo il protocollo per il test CER, in cui due substrati denaturati PrP C derivati ​​da normali omogenati cerebrali sono utilizzati in reazioni di conversione prione banco (Figura 1) 13. PrP C nel substrato denaturato a pH 7,4 può essere convertito solo res PrP da PrP TSE seminate nella reazione in assenza di una barriera di specie 14. Al contrario, denaturazione di PrP C in altro substrato a pH 3.5 permette di essere convertito PrP res seguente incubazionecon PrP TSE da qualsiasi specie e serve come controllo per la conversione. Il rapporto di conversione di PrP C res PrP in pH 7,4 substrato rispetto a quella del substrato pH 3.5 fornisce una misura della barriera di specie. Abbiamo scoperto che il test CER predice noto barriere di specie di topi di laboratorio per varie TSE e hanno utilizzato il test nel tentativo di prevedere la barriera di specie di numerose specie di mammiferi, tra cui pecore bighorn, alla malattia del dimagrimento cronico (CWD) e altre TSE 14, 15. Gli investigatori interessati in uno strumento che consenta il rapido screening delle TSE specie barriere o valutazione della conversione PrP C-to-PrP res troveranno questa metodologia utile.

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Protocollo

Animal lavoro condotto presso l'USGS National Wildlife Health Center è stata eseguita in accordo con l'Ufficio NIH di linee guida Laboratory Animal Welfare e sotto la cura degli animali istituzionale e comitato uso protocollo # EP080716. I tessuti di animali cacciatori-raccolta erano doni del Wisconsin o Michigan dipartimenti delle risorse naturali.

1. Soluzione Preparazione

NOTA: Le soluzioni elencate di seguito sono necessari per la preparazione del substrato test CER nella Sezione 2 sotto. Preparare ciascuna di queste soluzioni di elevate soluzioni concentrazione azionari; Le concentrazioni consigliate per soluzioni madre sarà dato in parentesi dopo ogni rispettivo nome chimico elencato. Preparare tutte le soluzioni fresche sulla preparazione del substrato e conservare a 4 ° C fino al momento dell'utilizzo.

  1. Per tampone di lisi, preparare una soluzione delle seguenti in Tris 10 mM, pH 7.5 (1 M Tris, pH 7.5 soluzione madre consigliato): 100 mm scloruro di odium (NaCl, 1 M soluzione madre), 10 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, EDTA 500 mm, pH 8.0 soluzione madre), 0,5% NP-40 (10% soluzione madre), 0,5% desossicolato (DOC, 10% soluzione madre ).
  2. Per buffer di conversione, preparare una soluzione di 0,05% sodio dodecil solfato (SDS, 10% soluzione madre) e 0,5% Triton X-100 (10% soluzione madre) in 1 tampone fosfato salino (PBS, 10, pH 7.4 soluzione stock).
  3. Per le soluzioni caotropici, preparare due 3 M soluzioni di guanidina cloridrato (GdnHCl, 8 m stock) in 1x PBS (10x soluzione madre). Regolare il pH di una delle soluzioni di 3,5 ± 0,05 con acido cloridrico concentrato (HCl). Verificare che il pH della seconda soluzione rimane a pH 7,4 ± 0,05 e regolare utilizzando idrossido concentrato HCl o di sodio (NaOH) se necessario.

2. Preparare CER Assay substrato Pairs

  1. Ottenere tessuto cerebrale sano, non-TSE-infettati da specie di interesse e preparare un volume peso-per-10%(W / v) omogenato in tampone di lisi utilizzando uno dei seguenti metodi: Dounce, branello-mulino, o mortaio e pestello omogeneizzazione. Ulteriori definire risultante omogenati sottoponendoli a siringa e ago omogeneizzazione, usando aghi di calibro crescente fino substrato può essere aspirato ed espulsa con facilità attraverso un ago di siringa G 27.
    1. Per sottofondi preparati da roditori e altri piccoli mammiferi, omogeneizzare tutto il cervello (s); per substrati preparati da grandi mammiferi, utilizzare OBEX (tronco encefalico) tessuto da preparare omogeneizzati. Quando si seleziona la quantità di omogenato cerebrale, preparare non più del 50% della capacità della centrifuga utilizzata per precipitazione delle proteine ​​nel passo 2.6.
    2. Se la qualità del tessuto cerebrale acquisita è discutibile, valutare i livelli di PrP C da SDS-PAGE 16 e immunoblot 17 prima del substrato di preparazione.
  2. Dividere omogenato cervello in due volumi uguali a tubi conici di plastica etichettati separati. Aggiungi GdnHCl (3 M soluzioni in 1 PBS) a pH 3,5 o 7,4 a ciascuna provetta in un rapporto 1: 1 volume di omogenato cerebrale.
  3. Controllare i valori di pH delle due soluzioni. Regolare il pH del pH 3.5 ± substrato a pH 0,05 con HCl concentrato. Assicurarsi che il pH del altro substrato rimane a pH 7,4 ± 0,05 e regolare il pH se necessario con HCl o NaOH come necessario. Evitare di superamento dei valori di pH da giudiziosa aggiunta di acido o di base.
  4. Ruotare soluzioni in un mixer end-over-end a temperatura ambiente (RT) per 5 ore.
  5. Precipitato proteico aggiungendo quattro volumi di metanolo alle soluzioni substrato in ogni provetta conica, vortex per miscelare bene, e incubare a -20 ° C per 16-18 ore.
  6. Campioni di sedimento di centrifugazione a 13.000 xg per 30 min a 4 ° C. Decantare con cautela e scartare il surnatante e lasciare evaporare il metanolo dai pellet. Utilizzare applicatori con punta di cotone per aiutare ad assorbire metanolo aggrappato alla parte interna del tubo. Non permettere pellets di over-dry e una volta metanolo non è più visibile, procedere al passo successivo.
  7. Pellets proteine ​​Risospendere in tampone di conversione. Utilizzare una quantità di tampone di conversione pari alla quantità di omogenato cerebrale materiale di partenza erogato in ogni provetta nel passo 2.2.
    NOTA: E 'fondamentale che il buffer di conversione usato per risospendere pellet di proteine ​​sia da pH 3,5 e preparati substrato 7,4-trattati è la soluzione di cui al precedente punto 1.2 (che contiene bassi livelli di detersivi e un pH fisiologico).
  8. Soluzioni brevemente agli ultrasuoni substrato in un sonicatore cuphorn (10 sec al ~ 30% di potenza massima), aliquota in 0,5-1,0 ml di volume in etichetta 1,5 ml microprovette. Eseguire un immunoblot controllo di qualità (passo 2.9) su un'aliquota di ciascun substrato. Conservare le altre aliquote a -80 ° C fino al momento di effettuare test CER (sezione 4).
  9. Eseguire il controllo della qualità su coppie substrato CER prima dell'uso (Figura 2). Questi passaggi assicurano che substrati CER saranno provide risultati ottimali in studi di conversione.
    1. Garantire quantità comparabili di PrP C nei due substrati. Confronta i livelli di PrP in 10-25 ml di ogni substrato mediante SDS-PAGE 16 e immunoblotting 17. Se i livelli di proteine ​​nel pH 7.4 e 3.5 supporti si trovano a circa il 10% di ogni altro, le coppie substrato sono appropriati per l'utilizzo in studi CER.
      NOTA: Le immunoblots PrP non dovrebbero mostrare la prova di un'eccessiva degradazione PrP C. L'immunoreattività PrP dovrebbe essere principalmente> 20 kDa. Bands meno di questa massa molecolare possono essere prodotti di degradazione. Modelli banding dovrebbero essere più o meno equivalente tra coppie substrato.
    2. Come la PrP C in entrambi i substrati dovrebbe essere sensibile PK, trattare 10-25 microlitri di ciascun substrato con PK ad una concentrazione finale di 100 mg / ml e digerire campioni a 1,000 rpm a 37 ° C per 1 ora in termo-shaker. Valutare qualsiasi segnale PrP rimanente SDS-PAGE 16 e immunoblotting 17.Substrati con res PrP non sono adatti per l'utilizzo in studi CER.

3. Preparare TSE Agente Seeds

  1. Ottenere tessuto cerebrale TSE-infettati da specie di interesse e di preparare un 10% (w / v) omogeneizzato in 1x PBS pH 7.4 con le modalità di cui al punto 2.1.
    NOTA: Semi potrebbero essere ottenuti anche da altri tessuti infetti da TSE fuori del sistema nervoso centrale, tuttavia, l'efficienza di conversione del cervello derivato substrati da semi derivati ​​da tessuti periferici TSE-infette non è ancora stata valutata sperimentalmente nella letteratura pubblicata.
  2. Aliquota risultante omogeneizzato (s) in 100-300 volumi microlitri in 0,5 ml provette da microcentrifuga e conservare a -80 ° C fino al momento di eseguire il test CER.

4. CER Assay

NOTA: Il test CER comporta aggiunta di una quantità relativamente piccola di PrP TSE (fornito nel "seme") da una speciein un eccesso relativo di PrP C (fornito nel cervello non infette "substrato") da un'altra specie che è stato parzialmente denaturati a pH 3.5 o 7.4. Dopo un periodo di incubazione prolungato tremante, la conversione template-driven di PrP C da PrP TSE in ogni reazione è valutata dal segnale densitometrica di PrP res rimanente dopo PK digestione e la rilevazione immunoblot. Confrontando livelli res PrP nei substrati precedentemente denaturate a pH 3,5 contro 7,4 fornisce una misura della barriera di specie. Una panoramica sperimentale di questa procedura di analisi è fornito in Figura 1.

  1. Lentamente scongelare infetti coppie substrato CER (test richiede volumi uguali di substrati precedentemente denaturato sia a pH 3.5 e 7.4) e le soluzioni di semi TSE-infetti mettendoli sulla cima di un letto di ghiaccio (a circa 1 ora di tempo disgelo).
  2. Una volta completamente scongelati, aspirare e poi espellere ogni soluzione substrato attraverso un27 G siringa più volte a ri-omogeneizzare. Brevemente agli ultrasuoni ogni soluzione seme TSE-infettati per 10 secondi al ~ 30% di potenza massima. Tenere tutte le soluzioni sul ghiaccio mentre si prepara reazioni di conversione.
  3. Label 5 singoli, pareti sottili tubi basso legame PCR per agente TSE in fase di sperimentazione.
  4. Preparare reazioni di conversione in questi tubi aggiungendo 5 ml di soluzione al 10% di semi TSE-infetta a 95 ml di (a) substrato CER preparati a pH 7,4 e (b) substrato CER preparati a pH 3,5.
    1. Per ogni campione sperimentale, preparare reazioni parallele a coppie substrato CER precedentemente denaturato sia a pH 3,5 e 7,4.
    2. Ottimizzare i rapporti di TSE seme agente per substrato cervello infetto attraverso la determinazione empirica. Seme Comune: rapporti substrato impiegati mantengono un volume totale di reazione di 100 ml e comprendono 1:99 microlitri, 2:98 e 5:95 ul ul. Per la maggior parte delle applicazioni, il seme 5:95 microlitri: rapporto volume del substrato è adeguato ed è quello che si presenta in thè il protocollo.
  5. Preparare tre campioni di controllo per agente TSE in fase di test nel modo seguente: (a) aggiungere 5 ml di soluzione al 10% di semi di TSE-infetta al buffer di conversione 95 microlitri come controllo per ingresso res PrP; aggiungere buffer di conversione 5 ml a 95 ml di substrato preparato a (b) pH 3.5 (c), pH 7,4 come controlli per non-specifico, la conversione non su modelli.
  6. Brevemente vortice ogni campione nella sua provetta PCR chiuso mescolare semi e substrato bene. Seguire con un impulso momentaneo in una bassa velocità da banco mini-centrifuga per rimuovere qualsiasi volume della miscela di reazione intrappolato nel coperchio provetta PCR.
  7. Caricare i campioni in tubi PCR singolarmente etichettati in un banco top termo-shaker attrezzato per accettare provette PCR. Agitare campioni a 1,000 rpm a 37 ° C per 24 ore.
  8. Dopo agitazione, aggiungere sarcosile ad una concentrazione finale del 2% (w / v) e PK ad una concentrazione finale di 100 mg / ml. Campioni Digest a 1,000 rpm a 37 ° C per 1 ora in termo-shaker.
    NOTE: aggiunta di sarcosile campioni aiuti post-conversione in PK digestione di PrP C. Segnali positivi falsi in campioni non teste di serie (punto 4.5) sono virtualmente eliminati con l'aggiunta di sarcosile.
  9. Aggiungere tampone campione SDS-PAGE, campioni di calore a 95 ° C per 5 minuti e risolvere rimanenti PrP res in ciascun campione mediante SDS-PAGE seguita da immunoblotting 16 17.
    NOTA: Dopo l'aggiunta di tampone campione e riscaldamento, i campioni possono essere immediatamente elaborato o campioni possono essere conservati a -20 ° C o -80 ° C prima di immunoblotting. Tutti i dati qui presentati sono stati generati utilizzando i sistemi di gel e di trasferimento Novex NuPAGE. I singoli campioni del test CER sono stati trattati con il tampone e la riduzione dell'agente secondo le istruzioni del produttore. I campioni sono stati successivamente riscaldati a 95 ° C per 5 min e 30 microlitri di ciascun campione sono stati caricati in un 12% bis-tris gel prefabbricati.
  10. Calcolare il rapporto efficienza di conversione (CER) come misurabarriera di specie. Misura i livelli di res PrP di densitometria 17 e dividono la densità totale del campione pH 7,4 da quella del campione di 3,5 pH. Moltiplicare per 100 per produrre una percentuale.
  11. Compilare i dati da repliche sperimentali indipendenti di generare una media CER ± deviazione standard per una specie con un determinato agente TSE.

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Risultati

Uso di successo del dosaggio CER dipende in gran parte dalla qualità delle coppie substrato utilizzati nelle reazioni di conversione. Per questo motivo, secondo procedure per preparare CER coppie substrato, un immunoblot controllo di qualità deve essere eseguito (Figura 2). Per entrambi i substrati, dosaggio 10-25 ml per immunoblotting. PrP C dovrebbe essere facilmente rilevabile in ogni substrato e livelli di PrP C deve essere di circa la stessa tra i due. Immunoreattività sarà pr...

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Discussione

Per il completamento di questo protocollo, occorre prestare attenzione ai livelli PrP C nel tessuto cerebrale infetto usato per la preparazione del substrato (fase 2.1.2) e il seme al substrato rapporto per le reazioni di conversione (passo 4.4.2). Nella nostra esperienza, cervello possono essere estratte per uso come substrato CER dopo un sostanziale periodo post-mortem, purché PrP C è presente per immunoblotting (Figura 4). In effetti, alcuni autolisi è stato osservato nel cervel...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo John Olsen (Dipartimento delle Risorse Naturali del Wisconsin), Tom Cooley, Daniel O'Brien e Steve Schmitt (Dipartimento delle Risorse Naturali del Michigan) e il Dr. Daniel Walsh (USGS National Wildlife Health Center) per l'assistenza nell'acquisizione dei tessuti. Ringraziamo anche il Wisconsin State Laboratory of Hygiene per i servizi di test diagnostici e la dottoressa Tonie Rocke e il suo staff (USGS National Wildlife Health Center) per l'uso delle attrezzature. Qualsiasi uso di nomi commerciali, di prodotti o di aziende è solo a scopo descrittivo e non implica l'approvazione da parte del governo degli Stati Uniti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Gel 12% Bis-Tris SDS-PAGELife TechnologiesNP0342
Perle di ossido di zirconio da 0,5 mmNext AdvanceZROB05Altre varietà di perle sono efficaci Anche
gli anticorpivari fornitoriSeleziona gli anticorpi primari e secondari appropriati per la rilevazione immunoblot di PrPres da specie di interesse
Omogeneizzatoredi perlineIl prossimo articolo AdvanceBBY24M
CentrifugaBeckman Coltro369434Alta velocità con controllo della temperatura
Tubi conicidi qualsiasi marca
Applicatore con punta in cotoneUlineS-18991
Sonicatore CuphornSistemi di calore-UltrasonicsW-380Sistemi di calore-Ultrasonics, Inc. è ora Qsonica, LLC
Densitometria programma softwareUVPVision Works LS Software di acquisizione e analisi delle immaginiAnche altri programmi, come NIH ImageJ, funzioneranno
Omogeneizzatore DounceKimble Chase885300
Miscelatore end-over-endLabnet InternationalH5600
Acido etilendiamminotetra aceticoBoston BioproductsP-770Sostanza chimica pericolosa: irritazione oculare
Guanidina cloridrato, 8 MThermo Fisher Scientific24115Sostanza chimica pericolosa: tossicità acuta, irritazione della pelle, irritazione degli occhi
Blocco riscaldanteFisher Scientific11-718
Acido cloridricoSigma-Aldrich435570Sostanza chimica pericolosa:
acido forte tampone per campioni di dodecil solfato di litio, 4xLife TechnologiesNP0008Sostanze chimiche pericolose: pelle e irritazione respiratoria, gravi lesioni oculari, solido infiammabile
MetanoloFisher ScientificA454-4Sostanza chimica pericolosa: tossicità acuta, liquido infiammabile
Provette per microcentrifugadi qualsiasi marca
Mini-centrifugaLabnet InternationalC1301
N-lauroil-sarcosina (sarkosyl)Sigma-Aldrich L-5125Sostanze chimiche pericolose: tossicità acuta, irritazione della pelle, danni agli occhi
Nonidet P-40AmrescoM158Sostanze chimiche pericolose: irritazione della pelle, danni agli occhi
Sistema di gel SDS-PAGELife TechnologiesSistema di elettroforesi NuPAGE Altrisistemi SDS-PAGE funzioneranno anche
con provette PCR (a basso legameAxygenPCR-02-L-C
Omogeneizzatorea pestelloFisher Scientific03-392-106
Misuratore di pHSentronSI600
Membrana in polivinildifluoruroMilliporeIPVH00010
Proteinasi KPromegaV3021Sostanze chimiche pericolose: irritazione della pelle e degli occhi, sensibilizzazione respiratoria, tossicità d'organo
Agente riducente per campioni SDS-PAGE, 10xLife TechnologiesNP0009
Cloruro di sodioFisher Scientific7647-14-5
Desossicolato di sodioSigma-Aldrich D6750Sostanza chimica pericolosa: tossicità acuta
Sodio dodecil solfatoThermo Fisher Scientific28364Sostanza chimica pericolosa: tossicità acuta, irritazione cutanea, lesioni oculari, solido infiammabile
Idrossido di sodioSigma-AldrichS5881Sostanza chimica pericolosa; base forte
SiringaBD BiosciencesvariUtilizzare siringhe di dimensioni adeguate ai volumi di substrato da omogeneizzare
Aghi per siringaBD Biosciencesvari
Thermoshaker (agitatore per provette PCR)Hangzhou All Sheng InstrumentsMS-100
Tris baseBio Basic77-86-1Sostanze chimiche pericolose: pelle, occhi, irritazione respiratoria
Triton X-100Integra Chemical CompanyT756.30.30Sostanze chimiche pericolose: tossicità acuta, irritazione oculare
VorticeFisher Scientific12-812
)

Riferimenti

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