Misurare la barriera alla trasmissione interspecie delle malattie da prioni è impegnativo e in genere comporta sfide animali o saggi biochimici. Qui, presentiamo un saggio di conversione della proteina prionica in vitro con la capacità di prevedere le barriere di specie.
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Articolo metodologico
Valutare l'encefalopatia spongiforme trasmissibile Specie Barriere con un
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli studi per comprendere la trasmissione interspecie delle encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE, malattie da prioni) sono impegnativi in quanto in genere si basano su lunghi e costosi studi di provocazione animale in vivo. Sono stati sviluppati numerosi saggi in vitro per aiutare a misurare le barriere tra le specie di prioni, riducendo così l'uso da parte degli animali e fornendo risultati più rapidi rispetto ai biotest sugli animali. Qui, presentiamo il protocollo per un test di conversione rapida dei prioni in vitro chiamato test del rapporto di efficienza di conversione (CER). In questo saggio, la proteina prionica cellulare (PrPC) proveniente da un cervello ospite non infetto viene denaturata sia a pH 7,4 che a 3,5 per produrre due substrati. Quando il substrato a pH 7,4 viene incubato con l'agente TSE, la quantità di PrPC che si converte in uno stato resistente alla proteinasi K (PK) viene modulata dalla barriera della specie dell'ospite originale all'agente TSE. Al contrario, la PrPC nel substrato a pH 3,5 è mal ripiegata da qualsiasi agente TSE. Confrontando la quantità di proteina prionica resistente alla PK nei due substrati, è possibile effettuare una valutazione della barriera di specie dell'ospite. Mostriamo che il test CER predice correttamente le barriere note tra le specie di prioni dei topi di laboratorio e, ad esempio, mostriamo alcuni risultati preliminari che suggeriscono che le linci rosse (Lynx rufus) possono essere suscettibili all'agente della malattia del deperimento cronico del cervo dalla coda bianca (Odocoileus virginianus).
Introduzione
Encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE, malattie prioniche) sono un gruppo di malattie neurodegenerative fatali con periodi di incubazione lunghi che interessano una varietà di animali ed esseri umani. L'agente eziologico putativo di TSE comprende un isomero misfolded della proteina prionica host (PrP) che è in grado di auto-propagazione per conversione template-driven della forma cellulare normale PrP (PrP C) in una, associata malattia infettiva forma (PrP TSE) che si accumula nei tessuti del sistema nervoso centrale dell'ospite infettato 1. Prioni mammiferi infettive in genere trasmettono da host-to-host in modo specif....
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Protocollo
Animal lavoro condotto presso l'USGS National Wildlife Health Center è stata eseguita in accordo con l'Ufficio NIH di linee guida Laboratory Animal Welfare e sotto la cura degli animali istituzionale e comitato uso protocollo # EP080716. I tessuti di animali cacciatori-raccolta erano doni del Wisconsin o Michigan dipartimenti delle risorse naturali.
1. Soluzione Preparazione
NOTA: Le soluzioni elencate di seguito sono necessari per la preparazione del substrato test CER nella Sezione 2 sotto. Preparare ciascuna di queste soluzioni di elevate soluzioni concentrazione azionari; Le concentr....
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Risultati
Uso di successo del dosaggio CER dipende in gran parte dalla qualità delle coppie substrato utilizzati nelle reazioni di conversione. Per questo motivo, secondo procedure per preparare CER coppie substrato, un immunoblot controllo di qualità deve essere eseguito (Figura 2). Per entrambi i substrati, dosaggio 10-25 ml per immunoblotting. PrP C dovrebbe essere facilmente rilevabile in ogni substrato e livelli di PrP C deve essere di circa la stessa tra i due. Immunoreattività sarà pr.......
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Discussione
Per il completamento di questo protocollo, occorre prestare attenzione ai livelli PrP C nel tessuto cerebrale infetto usato per la preparazione del substrato (fase 2.1.2) e il seme al substrato rapporto per le reazioni di conversione (passo 4.4.2). Nella nostra esperienza, cervello possono essere estratte per uso come substrato CER dopo un sostanziale periodo post-mortem, purché PrP C è presente per immunoblotting (Figura 4). In effetti, alcuni autolisi è stato osservato nel cervel.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo John Olsen (Dipartimento delle Risorse Naturali del Wisconsin), Tom Cooley, Daniel O'Brien e Steve Schmitt (Dipartimento delle Risorse Naturali del Michigan) e il Dr. Daniel Walsh (USGS National Wildlife Health Center) per l'assistenza nell'acquisizione dei tessuti. Ringraziamo anche il Wisconsin State Laboratory of Hygiene per i servizi di test diagnostici e la dottoressa Tonie Rocke e il suo staff (USGS National Wildlife Health Center) per l'uso delle attrezzature. Qualsiasi uso di nomi commerciali, di prodotti o di aziende è solo a scopo descrittivo e non implica l'approvazione da parte del governo degli Stati Uniti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Gel 12% Bis-Tris SDS-PAGE | Life Technologies | NP0342 | |
| Perle di ossido di zirconio da 0,5 mm | Next Advance | ZROB05 | Altre varietà di perle sono efficaci Anche |
| gli anticorpi | vari fornitori | Seleziona gli anticorpi primari e secondari appropriati per la rilevazione immunoblot di PrPres da specie di interesse | |
| Omogeneizzatore | di perlineIl prossimo articolo Advance | BBY24M | |
| Centrifuga | Beckman Coltro | 369434 | Alta velocità con controllo della temperatura |
| Tubi conici | di qualsiasi marca | ||
| Applicatore con punta in cotone | Uline | S-18991 | |
| Sonicatore Cuphorn | Sistemi di calore-Ultrasonics | W-380 | Sistemi di calore-Ultrasonics, Inc. è ora Qsonica, LLC |
| Densitometria programma software | UVP | Vision Works LS Software di acquisizione e analisi delle immagini | Anche altri programmi, come NIH ImageJ, funzioneranno |
| Omogeneizzatore Dounce | Kimble Chase | 885300 | |
| Miscelatore end-over-end | Labnet International | H5600 | |
| Acido etilendiamminotetra acetico | Boston Bioproducts | P-770 | Sostanza chimica pericolosa: irritazione oculare |
| Guanidina cloridrato, 8 M | Thermo Fisher Scientific | 24115 | Sostanza chimica pericolosa: tossicità acuta, irritazione della pelle, irritazione degli occhi |
| Blocco riscaldante | Fisher Scientific | 11-718 | |
| Acido cloridrico | Sigma-Aldrich | 435570 | Sostanza chimica pericolosa: |
| acido forte tampone per campioni di dodecil solfato di litio, 4x | Life Technologies | NP0008 | Sostanze chimiche pericolose: pelle e irritazione respiratoria, gravi lesioni oculari, solido infiammabile |
| Metanolo | Fisher Scientific | A454-4 | Sostanza chimica pericolosa: tossicità acuta, liquido infiammabile |
| Provette per microcentrifuga | di qualsiasi marca | ||
| Mini-centrifuga | Labnet International | C1301 | |
| N-lauroil-sarcosina (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L-5125 | Sostanze chimiche pericolose: tossicità acuta, irritazione della pelle, danni agli occhi |
| Nonidet P-40 | Amresco | M158 | Sostanze chimiche pericolose: irritazione della pelle, danni agli occhi |
| Sistema di gel SDS-PAGE | Life Technologies | Sistema di elettroforesi NuPAGE Altri | sistemi SDS-PAGE funzioneranno anche |
| con provette PCR (a basso legame | Axygen | PCR-02-L-C | |
| Omogeneizzatore | a pestelloFisher Scientific | 03-392-106 | |
| Misuratore di pH | Sentron | SI600 | |
| Membrana in polivinildifluoruro | Millipore | IPVH00010 | |
| Proteinasi K | Promega | V3021 | Sostanze chimiche pericolose: irritazione della pelle e degli occhi, sensibilizzazione respiratoria, tossicità d'organo |
| Agente riducente per campioni SDS-PAGE, 10x | Life Technologies | NP0009 | |
| Cloruro di sodio | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Desossicolato di sodio | Sigma-Aldrich | D6750 | Sostanza chimica pericolosa: tossicità acuta |
| Sodio dodecil solfato | Thermo Fisher Scientific | 28364 | Sostanza chimica pericolosa: tossicità acuta, irritazione cutanea, lesioni oculari, solido infiammabile |
| Idrossido di sodio | Sigma-Aldrich | S5881 | Sostanza chimica pericolosa; base forte |
| Siringa | BD Biosciences | vari | Utilizzare siringhe di dimensioni adeguate ai volumi di substrato da omogeneizzare |
| Aghi per siringa | BD Biosciences | vari | |
| Thermoshaker (agitatore per provette PCR) | Hangzhou All Sheng Instruments | MS-100 | |
| Tris base | Bio Basic | 77-86-1 | Sostanze chimiche pericolose: pelle, occhi, irritazione respiratoria |
| Triton X-100 | Integra Chemical Company | T756.30.30 | Sostanze chimiche pericolose: tossicità acuta, irritazione oculare |
| Vortice | Fisher Scientific | 12-812 |
Riferimenti
- Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833(2011).
- Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
- Scott, M., et al. Transgenic mice expre....
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Ristampe e permessi
