Articolo metodologico

Gangli neuroni e cellule staminali derivate da tessuto adiposo differenziata: An

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DOI:

10.3791/52543

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26 febbraio 2015

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1Centre for Neuroprosthesis, EPFL | STI | IMT/IBI | LSBI, 2Blond McIndoe Research Laboratories, Institute of Inflammation & Repair, The University of Manchester, 3University Hospital of South Manchester

In questo articolo

Sommario

Gangli spinali (DRG) sono strutture che contengono i neuroni sensoriali del sistema nervoso periferico. Quando dissociato, possono essere co-coltura con cellule staminali derivate da tessuto adiposo SC-like (ASC), che fornisce un modello valido per lo studio in vitro rigenerazione e mielinizzazione nervo, imitando l'ambiente in vivo presso il sito di lesione.

Abstract

I neuroni dei gangli della radice dorsale (DRG), situati nei forami intervertebrali della colonna vertebrale, possono essere utilizzati per creare un sistema in vitro che facilita lo studio della rigenerazione nervosa e della mielinizzazione. Le cellule gliali del sistema nervoso periferico, le cellule di Schwann (SC), sono facilitatori chiave di questi processi; È quindi fondamentale che le interazioni di questi componenti cellulari siano studiate insieme. Il contatto diretto tra i neuroni DRG e le cellule gliali fornisce stimoli aggiuntivi rilevati da specifici recettori di membrana, migliorando ulteriormente la risposta neuronale. Le SC rilasciano fattori di crescita e proteine nel terreno di coltura, che migliorano la sopravvivenza dei neuroni e stimolano la germinazione e l'estensione dei neuriti. Tuttavia, le SC richiedono un lungo tempo di proliferazione per essere utilizzate per applicazioni di ingegneria tissutale e il sacrificio di un nervo sano per il loro approvvigionamento. Le cellule staminali di derivazione adiposa (ASC) differenziate nel fenotipo SC sono una valida alternativa alla SC per la messa a punto di un modello di co-coltura con neuroni DRG per studiare la rigenerazione nervosa. Il presente lavoro presenta un protocollo dettagliato e riproducibile passo-passo per raccogliere sia neuroni DRG che ASC da ratti adulti; differenziare l'ASC verso un fenotipo SC; e combina i due tipi di cellule in un sistema di co-coltura diretta per studiare l'interazione tra neuroni e SC nel sistema nervoso periferico. Questo strumento ha un grande potenziale nell'ottimizzazione di costrutti di ingegneria tissutale per la riparazione dei nervi periferici.

Introduzione

Lesioni dei nervi periferici sono comuni con circa 9.000 casi nel Regno Unito che si verificano ogni anno in un prevalentemente giovane e la popolazione 1 lavorare. Nonostante microchirurgiche tecniche di riparazione dei nervi, il normale ripristino della funzione è irraggiungibile con conseguente sensazione di compromissione mano, funzione motoria ridotta e frequente dolore e intolleranza al freddo 2. Tali lesioni hanno un impatto profondo e permanente sul paziente e la loro capacità di svolgere le attività della vita quotidiana, con meno del 60% di tornare al lavoro 3.

Dopo lesioni, il fenotipo e la morfologia dei neuroni e cellule di Schwann (SC) cambiamento al fine di creare un ambiente adatto per consentire l'assone germinazione. In caso di resezione, il nervo è diviso in prossimali e distali ceppi; il moncone prossimale è il punto da cui il processo di rigenerazione ha luogo, mentre il moncone distale subisce walleriana degenerazione dopo di che il distacco SCdagli assoni danneggiati, de-differenziare e proliferare. Questo è fondamentale per la rimozione di detriti mielina e preparare il moncone distale del nervo per ri-generazione 4,5. Axon germinazione è supportata dalla produzione di fattori neurotrofici e chemochine rilasciati dal SC al moncone distale, e guidata dalla lamina basale lasciati seguente degenerazione walleriana 6,7. SC allineare lungo l'assone rigenerare formando bande di Büngner, che aiuti la crescita degli assoni verso l'organo bersaglio, riducendo ramificazione all'esterno del tubo endoneurali. Dopo reinnervation, SC formare il nuovo guaina mielinica avvolgendo gli assoni rigenerati, ma funzioni sensoriali e motorie è solo parzialmente ripristinato 8.

Gangli spinali (DRG) sono strutture situate nel fori intervertebrali della colonna vertebrale, che contengono le cellule neuronali sensoriali che innervano organi periferici. Quando dissociato, possono essere utilizzati come adatto in vitro model per lo studio della rigenerazione nervosa 9 - 11, comprese le indagini di formazione della mielina. In particolare, i neuroni DRG adulto imitano le caratteristiche in vivo di queste cellule e forniscono un formidabile strumento per studiare nuove strategie per la riparazione dei nervi periferici in ingegneria dei tessuti.

Co-colture rappresentano un sistema dinamico che simula in vitro l'interazione di due (o più) tipi di cellule in un particolare ambiente in vivo. Uno dei vantaggi di questi modelli cellule co-coltura è la flessibilità e controllo che può essere esercitata sulla ambiente extracellulare. Neuroni DRG sono stati utilizzati di frequente nei sistemi di co-coltura con SC di imitare le interazioni reali che si verificano tra i due tipi di cellule del sistema nervoso periferico 10,12 - 14. È stato dimostrato che secernono SC matrice extracellulare (ECM) proteine ​​e fattori di crescita che possono notevolmente migliorare lacapacità dei neuroni DRG di sopravvivere e germogliare neuriti 15,16. Tuttavia, SC richiedono lunghi periodi di tempo a proliferare e, nonostante i progressi nella tecnica di coltura cellulare, è ancora difficile generare un adeguato numero di cellule per applicazioni di ingegneria tissutale. Inoltre, il sacrificio di un nervo sano è reso necessario per raccogliere SC autologo. Pertanto, la differenza in sourcing SC è importante sia per ingegneria tissutale e in vitro di rigenerazione nervosa. In questa vista, ASC può essere considerato una valida alternativa per lo sviluppo di un costrutto tissutale da utilizzare per la riparazione dei nervi periferici 17,18. Impieghi precedenti dimostrato la capacità di queste cellule di differenziarsi in SC-like ASC, esprimendo caratteristici gliali marcatori, come S-100, p75 e proteina gliale fibrillare acida (GFAP) 19, così come la proteina mielina zero (P0) 20 . La secrezione di fattori di crescita gliali, come il fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF), fattore di crescita nervoso (NGF) e gliale cellule fattore neurotrofico derivato (GDNF) è stata osservata anche 21,22. Pertanto, SC-like ASC può essere utilizzato come promotore di rigenerazione del nervo periferico, come dimostrato sia in vitro che in vivo studi 23-26. Inoltre, ASC può essere raccolto mediante procedure minimamente invasive in maggior numero rispetto ad altri tipi di cellule staminali; la frequenza di cellule staminali nel tessuto adiposo è 100- a 1.000 volte superiore a quello del midollo osseo 27, e hanno un tasso di proliferazione più elevata rispetto alle cellule staminali mesenchimali SC e del midollo osseo.

Questo lavoro si propone di fornire un protocollo dettagliato per eseguire rispettivamente alti raccolti efficienti di neuroni DRG dissociate e ASC, quest'ultima differenziate in cellule SC-like. Il co-coltura di questi due tipi cellulari fornirà pertanto un sistema molto pratico che può essere usato per futuri studi sulla capacità di DRG neurons germogliare neuriti e ai meccanismi di formazione della mielina sull'impalcatura diverso per l'ingegneria tessuto nervoso.

Protocollo

NOTA: Tutti gli esperimenti su animali sono stati eseguiti in conformità con gli animali del Regno Unito (procedure scientifiche) Act, 1986.

1. set-up sperimentale

  1. Prima di iniziare a tessuti e delle cellule di raccolta, controllare che tutti gli strumenti sono sterili. Se necessario, sterilizzare in autoclave un paio di forbici chirurgiche Sharp, molto fine pinza e una pinza sottile standard. Sterilizzare anche ogni substrato prima semina cella utilizzando la sterilizzazione UV, l'esposizione etanolo o la sterilizzazione a vapore a seconda dei casi.
  2. Preparazione di terreni per la raccolta delle cellule staminali e la differenziazione
    1. Preparare il terreno di coltura di cellule staminali, contenente terreno minimo essenziale (α-MEM) addizionato con siero fetale bovino al 10% (FBS), 200 mm L-glutammina, e l'1% di penicillina-streptomicina (PS).
    2. Preparare una soluzione madre di 10 mm in forskolin sciogliendo 10 mg di forskolina in 2.436 ml di sterile dimetil sulfoxyde. Utilizzare a concentrazione finale di 14 micron.
    3. Preparare una / soluzione madre ml 35 mg di acido retinoico sciogliendo 50 mg in 1,43 ml di sterile dimetil sulfoxyde. Utilizzare a concentrazione finale di 350 ng / ml.
    4. Preparare il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) scorte (100 mg / ml) sciogliendo 10 mg di polvere liofilizzata in 100 ml di acqua distillata sterile. Utilizzare a una concentrazione finale di 5 ng / ml.
    5. Preparare base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF) scorte (100 mg / ml) sciogliendo 50 mg di polvere liofilizzata in 500 ml di acqua distillata sterile. Utilizzare a una concentrazione finale di 10 ng / ml.
    6. Preparare il mezzo di differenziazione delle cellule staminali, contenenti mezzo di crescita delle cellule staminali integrato con 14 micron forskolin, 126 ng / ml di crescita gliale fattore-2 (GGF-2), 5 ng / mL di derivazione piastrinica fattore di crescita (PDGF), e 10 ng / ml di base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF).
  3. Preparazione dei media e soluzioni madre per la raccolta neurone e dissociazione
    1. Preparare BottenstEin e di Sato (BS) medio 28, con l'aggiunta di 1% PS e l'1% supplemento N2 medio F12 di Ham. Calcolare il volume finale necessario come 500 microlitri per bene (se si utilizza un 24-pozzetti).
    2. Preparare scorte collagenasi IV in mezzo F12 di Ham alla concentrazione di 1,25% in peso / v. Filtro-sterilizzare la soluzione e conservare a -20 ° C in 200 microlitri aliquote.
    3. Preparare bovina scorte tripsina pancreatiche in mezzo F12 di Ham alla concentrazione di 2,5% in peso / v, filtro sterilizzare e conservare a -20 ° C in 200 microlitri aliquote.
    4. Preparare il fattore di crescita nervoso (NGF) soluzione madre alla concentrazione di 5 mg / ml in un filtro sterilizzata 1 mg / ml soluzione grassi liberi-acido di siero albumina bovina (BSA) in mezzo F12 e conservare a -20 C come 200 microlitri aliquote. Non filtrata del NGF dopo la ricostituzione.
  4. Nel caso in cui nessuna modifica della superficie è stata eseguita, vetrini cappotto / piastre con poli-D-lisina (0,1 mg / ml per 15 minuti a temperatura ambiente) E / o laminina (2-10 mg / cm 2 per 2 ore a 37 ° C) per supportare attaccamento neurone e crescita dei neuriti come appropriato.
  5. Sempre scaldare media in un bagno d'acqua a 37 ° C prima dell'uso.

2. derivate da tessuto adiposo cellule staminali (ASC) Harvest e differenziazione in un fenotipo SC

  1. ASC raccolta dal grasso viscerale e inguinale dell'adulto maschio ratti Sprague-Dawley
    1. Prima di iniziare, preparare una provetta con 10-15 ml di Hanks 'Balanced soluzione salina (HBSS) supplementato con 1% v / v della soluzione di PS e conservare in ghiaccio fino grasso raccolta.
    2. Terminare il ratto per dislocazione cervicale e decapitazione. Shave ratto ed effettuare una incisione attraverso la pelle addominale, esponendo gli organi interni ed evitando sanguinamento. Rimuovere il grasso viscerale che racchiude lo stomaco e l'intestino (solitamente caratterizzato da una consistenza grassa gialla) e il grasso inguinale che circonda i testicoli di un maschio adulto Sprague-Dawley di ratto. Trasferimento the grassi nel tubo contenente HBSS su ghiaccio.
    3. In un armadio di sicurezza biologica (classe II) tritare finemente il grasso con un paio di forbici e una lama di rasoio sterile fino a consistenza bene raggiungimento e trasferirlo in una provetta contenente 15 ml di 0,2% preparata peso / v soluzione di tipo I e collagenasi sterilizzata per filtrazione il giorno.
    4. Trasferire la provetta in un bagno d'acqua a 37 ° C e lasciare il tessuto adiposo di digerire in presenza dell'enzima per 30 min-1 hr sotto agitazione continua. Monitorare attentamente la digestione e fermare prima che il tessuto è completamente dissociato, questo migliorerà la vitalità delle cellule e la resa delle cellule. Tessuto Filter Theun-dissociato attraverso un colino cella 100 micron.
      NOTA: Una buona digestione del tessuto comporta consistenza omogenea del grasso, visibile a occhio quando agitando delicatamente il tubo, acquisendo un aspetto beige.
    5. Neutralizzare l'enzima aggiungendo 15 ml di terreno di coltura di cellule staminali contenenti siero fetale bovino a 37 ° C e centrifugaresoluzione a 160 g per 10 minuti per raccogliere la frazione stromale vascolare, comprese le cellule staminali, sul fondo della provetta.
    6. In questa fase, il pellet può essere risospeso in 1 ml di globuli rossi Lysis Buffer per eliminare la contaminazione globuli. Dopo la risospensione e pipettaggio per 1 minuto, aggiungere 10 ml di fresco mezzo di crescita delle cellule staminali e centrifugare a 160 g per 10 min.
    7. Attenzione aspirare il surnatante dal tubo, curando il pellet cellulare depositato sul fondo. Risospendere le cellule in 10 ml di terreno di coltura di cellule staminali, trasferirli in 75 cm 2 palloni e incubare a 37 ° C, 5% CO 2. Mantenere le cellule a livello sub-confluenti fino passaggio 1-2, cambiando media ogni 3 giorni.
  2. ASC differenziazione di un fenotipo SC
    1. Al passaggio 1-2, rimuovere il mezzo di crescita delle cellule staminali dal pallone 75 centimetri 2 e sostituirlo con 10 ml di mezzo fresco contenente 1 mM β-mercaptoetanolo appena preparosso e sterilizzata per filtrazione il giorno. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore. In questa fase, è importante che le cellule sono seminate a bassa densità (30%) prima di iniziare la differenziazione.
    2. Lavare le cellule accuratamente con HBSS, aspirare e sostituirlo con 10 ml di mezzo contenente 350 ng / ml acido retinoico. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 per 72 ore. Cercare di ridurre al minimo l'esposizione di medio cellule alla luce.
    3. Dopo 3 giorni, lavare le cellule accuratamente con HBSS, aspirare e sostituirlo con 10 ml di staminali medio differenziazione cellulare (vedi punto 1.2.6). Mantenere le cellule a livelli sub-confluenti, cambiando media ogni 3 giorni.
      NOTA: Dopo 2 settimane di incubazione, ASC sono differenziati in SC-come ASC, esprimendo la loro caratteristica fenotipo (come dimostrato da Kingham et al. 5). Essi possono essere utilizzati fino al 10 ° passaggio, senza cambiamenti notevoli nel comportamento 29.

3. Raccolta e dissociazione dei gangli spinali (DRG) Neuroni

  1. Terminare il ratto per dislocazione cervicale e decapitazione. Shave ratto e sollevare la pelle per esporre la colonna vertebrale. Utilizzando forbici affilate, durare più dell 'la colonna vertebrale prendendo cura supplementare degli organi ristretti e vasi sanguigni. Trasferire la colonna vertebrale in un armadio di sicurezza biologica (classe II) con una capsula di Petri e rimuovere qualsiasi parte dorsale.
  2. Dividere la colonna vertebrale a metà lungo l'asse longitudinale usando forbici chirurgiche sterili e taglienti per esporre il midollo. A questo punto, è utile tagliare la colonna vertebrale in due segmenti più piccoli di sotto del livello della gabbia toracica, per rendere più facile maneggiare durante la raccolta DRG neurone. Utilizzando una pinza sottile, rimuovere delicatamente tutto il tessuto del midollo, facendo attenzione a non tirare e rimuovere le radici DRG. In questo modo il DRG e radici saranno esposti nei canali vertebrali, ancora racchiuso nella colonna. Osservare DRG come bianco filamenti Coming direttamente dai canali.
  3. Estrarre l'intera radice DRG (non solo il DRG) dai canali vertebrali utilizzando una pinza molto fini, andando in profondità nei canali vertebrali e facendo attenzione a non danneggiare le radici dei gangli. Trasferire il DRG in una piccola capsula di Petri (60 mm 2) contenente 3-4 ml di mezzo di F12 di Ham integrato con 1% PS. Se si utilizza diversi animali, usare piatti separati.
  4. Sotto un microscopio da dissezione, pulire il DRG di ogni eccesso di radici nervose che circondano i gangli con pinza sterile e un bisturi per ridurre la contaminazione delle cellule gliali. Trasferire il DRG in una piccola capsula di Petri (35 mm 2) con 1,8 ml di mezzo F12 fresco.
  5. Aggiungere 200 ml di soluzione di peso / v tipo collagenasi IV magazzino 1,25% (concentrazione finale di 0,125%) e incubare il DRG a 37 ° C, 5% CO 2 per 1 ora. Aspirare accuratamente il terreno con una pipetta di vetro, facendo attenzione a non aspirare o danneggiare il DRG. Aggiungere mezzo F12 fresco elasticamented con 0,125% peso / v collagenasi di tipo IV enzima e incubare per 1 ora come descritto precedentemente.
  6. Aspirare il medio e lavare delicatamente la DRG con il mezzo F12. Aggiungere quindi 1,8 ml di mezzo F12 e 200 ml di tripsina (concentrazione finale di 0,25% in peso / v) e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 30 min.
  7. Rimuovere tripsina e aggiungere 1 ml di terreno F12 integrate con 500 ml di FBS di arrestare la reazione enzimatica. Aspirare il mezzo e lavare delicatamente DRG con mezzo F12 per tre volte per rimuovere tracce di siero.
  8. Aggiungere 2 ml di terreno fresco F12 e trasferire accuratamente DRG con il terreno in una provetta da 15 ml usando una pipetta di vetro. Dissociarsi delicatamente i neuroni DRG pipettando su e giù (circa 8-10 volte) con la pipetta di vetro (punte di plastica possono essere utilizzati come alternativa).
  9. Lasciare il pellet di stabilirsi nella parte inferiore del tubo e raccogliere il mezzo in una nuova provetta. Aggiungere 2 ml di terreno fresco F12 per il tubo contenente il pellet e ripetere la mdissociazione eccanico con la pipetta di vetro. Ripetere questa operazione fino a quando la sospensione diventa omogenei (circa 3-4 volte) e raccogliere tutte le DRG dissociato nel nuovo tubo. Questo metodo riduce la sollecitazione derivante dalla dissociazione meccanica e migliora la vitalità dei neuroni.
  10. Filtrare la sospensione omogeneizzata risultante in un nuovo tubo da 15 ml con un colino micron cella 100 per rimuovere i neuroni non-dissociati e altri detriti. A questo punto, potrebbe essere conveniente per filtrare prima sospensione cellulare in una provetta da 50 ml e poi trasferire la soluzione nel tubo più piccolo utilizzando una pipetta di vetro. Centrifugare la sospensione a 110 g per 5 min.
  11. Preparare un siero albumina bovina 15% (BSA) aggiungendo 500 ml di una soluzione di BSA 30% a 500 ml di mezzo F12. Lentamente pipettare la soluzione lungo la parete di un tubo 15 ml per creare un percorso proteine ​​graduale. In questa fase, è utile per tenere il tubo ad un angolo di 45 ° e rilasciare lentamente la BSA utilizzando i numeriil tubo falcon come riferimento per la "pista" formatura.
  12. Aspirare il supernatante dal punto 3.10 lasciare 500 microlitri sul fondo della provetta e risospendere il pellet cellulare nello stesso mezzo. Lentamente pipettare la sospensione lungo il sentiero di proteine ​​precedentemente preparato nel passo 3.11 (usare i numeri sul tubo come riferimento) e centrifugare a 500 g per 5 min.
  13. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 1 ml di terreno BS modificato (o supporto misto per la ASC / DRG co-coltura SC-like, come descritto di seguito nel passo 4.5.
    NOTA: Il volume per risospendere le neuroni DRG può essere effettuata a volume effettivo richiesto, a seconda della concentrazione cellulare finale desiderata e il numero di campioni da seminato. Un animale fornirà abbastanza cellule per un esperimento di 24-pozzetti.
  14. Incubare i campioni seminati a 37 ° C, 5% CO 2 per 2 ore per permettere l'adesione delle cellule e infine aggiungere mezzo BS fresco supplementato con 50 ng / ml di crescita nervoso factor (NGF).

4. Diretta Co-cultura della SC-come ASC e DRG neuroni

  1. Mantenere SC-come ASC in cultura a livello sub-confluenti come descritto al punto 2.2.3. Ventiquattro ore prima della raccolta DRG, aspirare il terreno differenziazione delle cellule staminali e lavare le cellule con HBSS. Aspirare e incubare in 3 ml di tripsina a 37 ° C, 5% CO 2 per 3 min.
  2. Controllare al microscopio luce che tutte le cellule sono staccato dal pallone. Battere delicatamente il pallone per aiutare il distacco. Aggiungere 7 ml di mezzo per arrestare la reazione tripsina, raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e centrifugare a 110 g per 5 min.
  3. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di terreno differenziazione delle cellule staminali. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e diluire la sospensione cellulare in base alla concentrazione finale desiderata. Idealmente, seminando 20.000 SC-like ASC / cm 2 garantirebbe uno strato confluente di cellule.
  4. Seed il SC-likeASC sul substrato e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore per permettere l'adesione delle cellule.
  5. Dopo 24 ore di incubazione, aspirare il terreno e aggiungere i neuroni DRG sopra le cellule come descritto al punto 3.14 e 3.15. Cambiare medio e un mezzo mista contenente il 50% di cellule staminali terreno di differenziamento e il 50% di BS medie. Inoltre, riducendo la concentrazione di FBS al 1-2,5% nel terreno misto finale contribuisce ad evitare la proliferazione delle cellule satelliti contaminanti derivanti dalla dissociazione DRG.
  6. Incubare i campioni co-coltivate a 37 ° C, 5% CO 2 e mantenere in coltura per il tempo necessario per le prove future.

Risultati

Le colture di neuroni DRG dissociate rappresentano un opportuno modello in vitro per lo studio della rigenerazione nervosa. Tuttavia, i substrati non trattati non forniscono un ambiente adatto per l'attacco DRG e l'estensione dei neuriti. SC-like ASC sono in grado di produrre fattori di crescita e chemochine 19 che possono migliorare la capacità dei neuroni DRG a germogliare neuriti quando vengono rilasciati nel mezzo di coltura. La presenza di SC-come ASC nel sistema di coltura può quindi svolgere un ruolo importante nella regolazione delle funzioni DRG.

Questo protocollo (figura 1) illustra la procedura per effettuare una co-coltura diretta di ASC e DRG neuroni SC-simili, durante il quale le cellule neuronali venissero a contatto diretto con precedentemente seminata ASC SC-like. La difficoltà principale associata con questa procedura è l'alta variabilità del numero di neuroni DRG raccolte da animali differenti. Per questo motivo, i risultati possono essere a volte difficile Compare ed una particolare attenzione deve essere prestata durante la procedura di semina in modo da ottenere sempre una densità cellulare paragonabile in ogni esperimento. Il protocollo è stato ottimizzato per ridurre almeno il numero di cellule satelliti rimanenti dalla dissociazione DRG neurone utilizzando il gradiente BSA (passo 3.11). Inoltre, citosina-arabinosio (ARA-C) integratore può essere aggiunto al mezzo di BS al fine di minimizzare ulteriormente la popolazione cellulare satellitare, come descritto da Kingham et al. 11. Tuttavia, la scelta del tempo di trattamento deve essere attentamente conciliate con il DRG e SC-like ASC vitalità, anche influenzata dalla presenza di integratore ARA-C nel mezzo di coltura. Pertanto, è molto difficile da realizzare un sistema privo di cellule satelliti.

La Figura 2 mostra l'importanza di SC-like ASC per DRG neurite germinazione in un modello di co-coltura con poly greggia e chimicamente modificati - caprolattone (PCL) pellicole come substrati. Neuroni DRG erano maintained in coltura per 3 giorni in presenza o assenza di SC-like ASC, utilizzando una soluzione mista contenente il 50% di BS medio e il 50% delle cellule staminali terreno di differenziamento, come descritto al punto 4.5. Dopo questo periodo, le cellule sono state fissate in 4% paraformaldeide e colorati con β-tubulina III (neuroni DRG) e S100 (SC-come ASC) per indagare la morfologia cellulare e di studiare la capacità dei neuroni DRG sporgere neuriti. Nessun neuriti sono stati osservati sulle superfici non trattate in assenza di SC-like ASC (Figura 2A), mentre la formazione di neuriti stato chiaramente migliorato nel sistema di co-coltura (Figura 2C). In media, il numero di neuriti al corpo cellulare significativamente aumentata da 0 a 3 in presenza di cellule staminali. La conferma di questi risultati è stato dato anche da microscopia elettronica a scansione (SEM) analisi, illustrata in figura 3. In particolare, le immagini SEM mostrano che la capacità dei neuroni DRG a germogliare neuriti avviene preferenzialmente in congiunzionecon SC-like ASC, come indicato dalle frecce gialle in Figura 3C.

Occorre rilevare che l'uso di substrati laminina-modificato (compresi peptidi laminina-derivato) nei sistemi di coltura contenenti neuroni DRG è stata spesso definita come una condizione adatta per la coltura delle cellule neuronali, avendo effetti notevoli sulla formazione dei neuriti e prolunga 30-32 . Tuttavia, i risultati mostrati nella Figura 2D e Figura 3D dimostra che la combinazione di segnali chimici e biologici può migliorare ulteriormente la risposta dei neuroni DRG.

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Figura 1. Preparazione del sistema ASC di co-coltura DRG-SC-come diretta. Neuroni DRG e ASC derivano rispettivamente dalla colonna vertebrale e il grasso viscerale e inguinale di mal adultiratti e Sprague-Dawley. Dopo la digestione del tessuto adiposo attraverso una cascata di reazioni enzimatiche, ASC sono differenziati in cellule SC-simili e mantenuto in condizioni sub-confluenti fino a quando necessario. SC-come ASC sono pre-seeded su ogni supporto 24 ore prima del raccolto DRG. Il giorno, neuroni DRG dissociate vengono estratti e attraverso una serie di azioni enzimatiche e meccaniche. I neuroni sono poi seminati sulla parte superiore della ASC SC-come in precedenza ad apporto e mantenute in coltura fino all'analisi (tecnica mista: contenente il 50% di media differenziazione delle cellule staminali e il 50% delle medie BS modificato). Cliccate qui per vedere una più grande versione di questa figura.

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Figura 2. immagini di fluorescenza di neuroni DRG in condizioni di coltura diverse.(A) film PCL non trattati; (B) film PCL RGD-modificati; (C) co-coltura con SC-come ASC sui film PCL non trattati; (D) co-coltura con SC-come ASC sui film PCL RGD modificati. Le cellule sono state mantenute in coltura per 3 giorni con una soluzione mista contenente il 50% di media BS modificato e il 50% di mezzo di differenziazione delle cellule staminali. Dopo questo periodo, le cellule sono state fissate in paraformaldeide 4%, permeabilizzate in una soluzione Triton-X, e non specifici siti di legame sono stati bloccati con 1% BSA. Le cellule neuronali sono state poi colorate contro β-tubulina III (CIC, verde) e ASC SC-like contro S-100 (AlexaFluor568; rosso) anticorpi. Infine nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). Le immagini sono state acquisite usando un microscopio a fluorescenza (Olympus BX60, Giappone). (Re-stampa con il permesso di de Luca et al. 30. Clicca qui per vedere un più ampio versioni di questa figura.

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Figura 3. immagini SEM di neuroni DRG in condizioni di coltura diverse (A) Pellicole PCL non trattati (B) film PCL RGD-modificati;. (C) co-coltura con ASC SC-come film PCL non trattati; (D) co-coltura con SC-come ASC sui film PCL RGD-modificato. Le frecce gialle indicano i punti di contatto tra SC-like ASC e DRG, confermando la loro interazione diretta nel sistema di co-coltura. Le cellule sono state mantenute in coltura per 3 giorni e fissati in glutaraldeide 2,5%. Dopo disidratazione in serie graduata di etanolo (50%, 70%, 90%, 100%), le cellule sono state infine risciacquati in esametildisilazano e asciugati prima del montaggio sul stub e oro sputtering per l'analisi SEM. Le immagini sono state acquisite con un SEM (Zeiss EVO60, UK) con un vol accelerazionetage di 10kV. (Re-stampa con il permesso di de Luca et al. 30. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Neuroni DRG sono spesso utilizzati tra le cellule neuronali per la cultura primaria per studiare la rigenerazione dei neuroni dopo assotomia in vivo. Qui un protocollo preciso per DRG raccolto da ratti adulti è presentato, al fine di ridurre la popolazione di cellule satelliti nell'ambiente circostante senza compromettere la sopravvivenza neuronale. Come ASC differenziato in un fenotipo SC-like sono una valida alternativa a SC per terapie cellulari, un ASC / DRG sistema di co-coltura SC-simile è anche descritto in dettaglio.

È ampiamente noto che laminina (o sequenze peptidiche laminina-derivato) hanno un effetto benefico sulla sopravvivenza dei neuroni e la formazione dei neuriti 31 - 33. Quando si esegue colture di neuroni DRG si consiglia pertanto precedentemente cappotto ciascun substrato con laminina per evitare la perdita di funzionalità delle cellule neuronali. Il concetto di rivestimenti laminina applica anche ai substrati biomateriale per la progettazione dicostrutti di ingegneria tissutale, ad esempio poli - caprolattone (PCL) frequentemente utilizzate per la fabbricazione di condotti 30 nervose. Inoltre, lavoro precedente ha dimostrato che le matrici di fibrina sono materiali adatti per colture neuronali in tre dimensioni 11.

Oltre al rivestimento proteico, modelli co-coltura preziose forniscono condizioni di sopravvivenza DRG neurone e un ambiente adatto per studiare le interazioni che avvengono tra neuroni e SC nel sistema nervoso periferico seguenti lesioni. Le cellule possono essere trapiantate in vivo mediante dispositivi neurali per abbreviare il tempo di reclutamento di cellule autologhe al sito della lesione. Ciò è particolarmente importante in lesioni gravi, che può portare alla senescenza cellulare / morti e atrofia muscolare. Sebbene SC sono le più importanti cellule gliali coinvolti nel processo di rigenerazione del nervo periferico e mielinizzazione, la loro disponibilità limitata e il loro tasso di proliferazione lenta li rende inadattiper applicazioni di ingegneria tissutale 34. ASC è una valida alternativa a causa della loro abbondanza e la capacità di differenziarsi in fenotipo SC, esprimendo specifici marcatori gliali e mostrando analogie funzionali nativo SC 19. ASC è inoltre in grado di produrre proteine ​​e fattori di crescita 5 punti che può essere utile per la formazione e l'estensione dei neuriti da neuroni DRG in un sistema di co-coltura. Tuttavia, due sistemi diversi co-coltura possono essere impostati in funzione delle esigenze sperimentali. Il metodo proposto in questo documento è una versione modificata di un protocollo consolidata nel nostro laboratorio 11 e comporta un contatto diretto tra i due tipi di cellule (co-coltura diretta), in cui il secondo tipo di cellule (neuroni DRG) vengono seminate sulla parte superiore degli altri (SC-like ASC). Questo approccio si basa su risultati precedenti che hanno dimostrato l'importanza della presenza di uno strato di cellule gliali sul substrato quando semina colture neuronali 35 - 37. Questo effetto è probabilmente dovuto alle interazioni cellula-cellula, attraverso integrine DRG e molecole ECM depositati da ASC e altri spunti sulla superficie delle cellule staminali. È stato inoltre osservato che una riduzione di siero proteine ​​nel medio ridotto la proliferazione delle cellule satelliti contaminanti che possono derivare dalla dissociazione di neuroni DRG, senza influenzare le funzioni ASC. Tuttavia, cellule satelliti, tra cui una piccola frazione di SC, sono difficili da eliminare completamente da colture di neuroni DRG e poche cellule rimanenti sarà anche presente nel sistema di co-coltura. È quindi importante notare che questi piccoli sub-popolazioni possono anche partecipare ai processi mielinizzazione durante studi in vitro, ricordando le cellule autologhe che sono presenti in vivo dopo la lesione. Il secondo approccio (non presentata qui) prevede l'utilizzo di inserti di coltura cellulare, evitando un contatto diretto tra i due diversi tipi di cellule (co-coltura indiretta). Carner, non è rappresentativa delle condizioni in vivo durante la rigenerazione del nervo (ridotta capacità delle cellule neuronali sviluppare lunghe neuriti), ma è utilizzato per studiare l'effetto di fattori diffusibili rilasciati nel mezzo di una certa popolazione cellulare sull'altro 38 .

Dichiarazioni

Gli autori confermano che non ci sono conflitti di interesse associati a questa pubblicazione.

Ringraziamenti

Questo lavoro è supportato dal National Institute for Health Research, dall'Accademia delle Scienze Mediche e dalla British Society for Surgery of the Hand. Ringraziamo inoltre con gratitudine la continua fornitura di GGF-2 da parte di Acorda Therapeutics, USA. Gli autori desiderano infine ringraziare il Prof. Giorgio Terenghi per il suo prezioso supporto e guida nel nostro gruppo negli ultimi anni che ha portato allo sviluppo e all'ottimizzazione di questo protocollo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
100 µ filtro cellulare mBD Biosciences35236070 μ I filtri m (rif. 352350) possono essere utilizzati in alternativa
Tubi in plastica da 15 mlSarstedt62.554.002
Tubi in plastica da 50 mlSarstedt62.547.004
Flaconi da 75 cm2CorningBC301
Acido retinoico >98% HPLCSigmaR2625
Integratore ARA-CSigmaC6645
FGF-basico umano ricombinante (154 aa)Peprotech100-18B
Albumina sierica bovina (BSA)SigmaA9205
Collagenasi tipo IGibco17100-017Nota: questa collagenasi viene utilizzata solo per la digestione del tessuto adiposo
Collagenasi di tipo IVWorthington BiochemicalLS004188Nota: questa collagenasi viene utilizzata solo per dissociare gli espianti di DRG
Siero bovino fetale (FBS)BioseraFB-1001
Forskolin SigmaF3917
Pipette in vetroFisher ScientificFB50253Materiale tagliente da smaltire di conseguenza
Glial Growth Factor-2 (GGF-2)Acorda TherapeuticsGGF-2 è stato gentilmente donato da Acorda Therapeutics. Per un'alternativa disponibile in commercio, consigliamo NRG1-β 1 (R & D Systems, Abingdon) per la differenziazione delle cellule staminali da utilizzare alla concentrazione finale di 200 ng/ml
Miscela di nutrienti F12 HAMSigmaN6658Warm a 37 gradi; C a bagnomaria se non diversamente specificato
Hank' s Soluzione salina bilanciata (HBSS)SigmaH9394Caldo a 37 gradi C a bagnomaria se non specificato
Integratore N-2 (100x)Invitrogen17502
Nerve Growth Factor 2.5s Protein, ghiandole sottomascellari di topo  (NGF)MilliporeNC011
Penicillina-Streptomicina (PS)SigmaP0781
[header]
Piastre di PetriCorning430165
Umano ricombinante PDGF-AAPeprotech100-13A
Tripsina Invitrogen25200-056Caldo a 37 gradi C a bagnomaria. Viene utilizzato per il distacco di cellule da fiasche di coltura tissutale
Tripsina (2x pancreatico bovino)Worthington BiochemicalLS003703Viene utilizzato per la dissociazione DRG
Minimum Essential Medium Eagle (MEM)SigmaM8042Caldo a 37 ° C a bagnomaria se non diversamente specificato
2-mercaptoetanoloSigmaM3148Preparare la soluzione nella cabina biologica

Riferimenti

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