Busulfan come mielosoppressiva agente per la generazione stabile ad alto livello di midollo osseo chimerismo nei topi

Sommario

Descriviamo un protocollo in base al quale il condizionamento con busulfan permette di sostituire il midollo osseo di un topo ricevente con cellule di midollo osseo provenienti da topi donatori che esprimono ubiquitariamente la proteina fluorescente verde, in assenza di irradiazione. Questa tecnica è utile per studiare l'accumulo di cellule del midollo osseo nel sistema nervoso centrale.

Abstract

Il trapianto di midollo osseo (BMT) viene spesso utilizzato per sostituire il compartimento del midollo osseo (BM) dei topi riceventi con cellule BM che esprimono un biomarcatore distinto isolato da topi donatori. Questa tecnica consente l'identificazione di cellule ematopoietiche derivate da donatori all'interno dei topi riceventi e può essere utilizzata per isolare e caratterizzare le cellule del donatore utilizzando varie tecniche biochimiche. Il BMT si basa tipicamente sul condizionamento mieloablativo con irradiazione total body per generare uno spazio di nicchia all'interno del compartimento midollare dei topi riceventi per l'attecchimento delle cellule del donatore. Il protocollo che descriviamo qui utilizza il condizionamento mielosoppressivo con l'agente chemioterapico busulfan. A differenza dell'irradiazione, che richiede l'uso di strutture specializzate, il condizionamento con busulfan viene eseguito utilizzando iniezioni intraperitoneali di 20 mg/kg di busulfan fino a quando non è stata somministrata una dose totale di 60-100 mg/kg. Inoltre, l'irradiazione mieloablativa può avere effetti collaterali tossici e richiede l'attecchimento riuscito delle cellule del donatore per la sopravvivenza dei topi riceventi. Al contrario, il condizionamento con busulfan che utilizza queste dosi è generalmente ben tollerato e i topi sopravvivono senza il supporto delle cellule del donatore. Le cellule del midollo osseo del donatore vengono isolate dai femori e dalle tibie di topi che esprimono ubiquitariamente la proteina fluorescente verde (GFP) e iniettate nella vena della coda laterale di topi riceventi condizionati. Il chimerismo del midollo osseo viene stimato quantificando il numero di cellule GFP+ all'interno del sangue periferico dopo il midollo osseo. Livelli di chimerismo >80% sono tipicamente osservati nel sangue periferico 3-4 settimane dopo il trapianto e rimangono stabiliti per almeno 1 anno. Come per l'irradiazione, il condizionamento con busulfan e BMT consente l'accumulo di cellule derivate dal midollo osseo del donatore all'interno del sistema nervoso centrale (SNC), in particolare nei modelli murini di neurodegenerazione. Questo accumulo di SNC mediato da busulfan può essere più fisiologico dell'irradiazione total body, poiché il trattamento con busulfan è meno tossico e l'infiammazione del SNC sembra essere meno estesa. Ipotizziamo che queste cellule possano essere geneticamente modificate per fornire terapie al SNC.

Introduzione

Recentemente, c'è stato un notevole interesse per il ruolo della microglia e delle cellule derivate dal midollo osseo (BMDC) nel sistema nervoso centrale (SNC), sia durante la malattia che con il normale invecchiamento. È ora noto che le microglia, le cellule immunitarie residenti nel SNC, si sviluppano nel SNC in seguito all'ingresso di progenitori mieloidi primitivi durante l'embriogenesi¹. Le microglia conservano aspetti del loro lignaggio mielomonocitico fino alla vita adulta. Sebbene l'evidenza suggerisca che il contributo dei BMDC al pool microgliale sia minimo negli animali adulti sani¹, il ruolo svolto dai BMDC nella progressione di varie....

Protocollo

NOTA: Etica Dichiarazione: Questo protocollo è stato esaminato e approvato dal Comitato di Simon Fraser University Animal Care (UACC; consentire numeri 1037K-12 e 1060K-03) ed è in conformità con il Consiglio canadese cura degli animali, la Guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio, e la direttiva del Consiglio CEE.

1. Considerazioni particolari

NOTA: Busulfan è citotossico. Manipolare e smaltire secondo la scheda dati di sicurezza e le linee guida istituzionali.

1. Eseguire tutte le tecniche asetticamente in una cappa a flusso laminare.
2. Sterilizzare strumenti prima dell'....

Risultati

La somministrazione di 60-100 mg / kg di busulfan è generalmente ben tollerato dai topi. Tuttavia, gli animali in genere perdere peso durante la fase di condizionamento (~ 5-10%) e, quindi, la dieta può essere integrata con gli ossequi, come semi di girasole irradiati per incoraggiare mangiare. Livelli di chimerismo di GFP + cellule> 80% nel sangue periferico e BM dovrebbero essere sempre raggiungibili con 60-100 mg / kg busulfan ^7. Il nostro laboratorio ha utilizzato con successo questo protocollo per gen.......

Discussione

Condizionata busulfan consente la generazione di alto livello BM chimerismo in topi con cellule ematopoietiche che sono facilmente rilevabili. Questo condizionamento può essere eseguita senza la necessità di impianti di irradiazione. Inoltre, mielosoppressione con le dosi di busulfan descritto in questo protocollo è ben tollerato, riducendo al minimo gli effetti collaterali tossici causati da dosi mieloablativi di irradiazione, e quindi può essere una tecnica più adatta a generare BM chimerismo nei giovani, vecchi, mala.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Busulfex	Otsuka Canada Pharmaceutical Inc.	DIN 02240602	Diluire busulfan a 3 mg/mL con PBS sterile appena prima dell'uso. Busulfan è citotossico. Maneggiare e smaltire secondo le schede di sicurezza e le linee guida istituzionali.
ACK Lysing Buffer Life	Technologies	A10492-01	È possibile sostituire un altro tampone di lisi, ma potrebbe essere necessario regolare di conseguenza i tempi di incubazione
Siero fetale bovino	Life Technologies	12483-020