Articolo metodologico

Busulfan come mielosoppressiva agente per la generazione stabile ad alto livello di midollo osseo chimerismo nei topi

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DOI:

10.3791/52553

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1 aprile 2015

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1Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University, 2The Biomedical Research Centre, University of British Columbia, 3Division of Neurology, Department of Medicine, Neuromuscular Disease Unit, VHHSC

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un protocollo in base al quale il condizionamento con busulfan permette di sostituire il midollo osseo di un topo ricevente con cellule di midollo osseo provenienti da topi donatori che esprimono ubiquitariamente la proteina fluorescente verde, in assenza di irradiazione. Questa tecnica è utile per studiare l'accumulo di cellule del midollo osseo nel sistema nervoso centrale.

Abstract

Il trapianto di midollo osseo (BMT) viene spesso utilizzato per sostituire il compartimento del midollo osseo (BM) dei topi riceventi con cellule BM che esprimono un biomarcatore distinto isolato da topi donatori. Questa tecnica consente l'identificazione di cellule ematopoietiche derivate da donatori all'interno dei topi riceventi e può essere utilizzata per isolare e caratterizzare le cellule del donatore utilizzando varie tecniche biochimiche. Il BMT si basa tipicamente sul condizionamento mieloablativo con irradiazione total body per generare uno spazio di nicchia all'interno del compartimento midollare dei topi riceventi per l'attecchimento delle cellule del donatore. Il protocollo che descriviamo qui utilizza il condizionamento mielosoppressivo con l'agente chemioterapico busulfan. A differenza dell'irradiazione, che richiede l'uso di strutture specializzate, il condizionamento con busulfan viene eseguito utilizzando iniezioni intraperitoneali di 20 mg/kg di busulfan fino a quando non è stata somministrata una dose totale di 60-100 mg/kg. Inoltre, l'irradiazione mieloablativa può avere effetti collaterali tossici e richiede l'attecchimento riuscito delle cellule del donatore per la sopravvivenza dei topi riceventi. Al contrario, il condizionamento con busulfan che utilizza queste dosi è generalmente ben tollerato e i topi sopravvivono senza il supporto delle cellule del donatore. Le cellule del midollo osseo del donatore vengono isolate dai femori e dalle tibie di topi che esprimono ubiquitariamente la proteina fluorescente verde (GFP) e iniettate nella vena della coda laterale di topi riceventi condizionati. Il chimerismo del midollo osseo viene stimato quantificando il numero di cellule GFP+ all'interno del sangue periferico dopo il midollo osseo. Livelli di chimerismo >80% sono tipicamente osservati nel sangue periferico 3-4 settimane dopo il trapianto e rimangono stabiliti per almeno 1 anno. Come per l'irradiazione, il condizionamento con busulfan e BMT consente l'accumulo di cellule derivate dal midollo osseo del donatore all'interno del sistema nervoso centrale (SNC), in particolare nei modelli murini di neurodegenerazione. Questo accumulo di SNC mediato da busulfan può essere più fisiologico dell'irradiazione total body, poiché il trattamento con busulfan è meno tossico e l'infiammazione del SNC sembra essere meno estesa. Ipotizziamo che queste cellule possano essere geneticamente modificate per fornire terapie al SNC.

Introduzione

Recentemente, c'è stato un notevole interesse per il ruolo della microglia e delle cellule derivate dal midollo osseo (BMDC) nel sistema nervoso centrale (SNC), sia durante la malattia che con il normale invecchiamento. È ora noto che le microglia, le cellule immunitarie residenti nel SNC, si sviluppano nel SNC in seguito all'ingresso di progenitori mieloidi primitivi durante l'embriogenesi1. Le microglia conservano aspetti del loro lignaggio mielomonocitico fino alla vita adulta. Sebbene l'evidenza suggerisca che il contributo dei BMDC al pool microgliale sia minimo negli animali adulti sani1, il ruolo svolto dai BMDC nella progressione di varie malattie neurodegenerative rimane poco chiaro. Questa incertezza è aggravata dal fatto che è difficile distinguere le BMDC che si accumulano all'interno del SNC dalle microglia residenti endogene, poiché non è stato identificato alcun marcatore immunoistochimico discriminante universalmente accettato. Al fine di monitorare le BMDC in vivo, utilizziamo un protocollo di trapianto di midollo osseo (BMT) in base al quale le cellule midollari endogene di un topo ricevente vengono sostituite con quelle di un topo donatore che esprime ubiquitariamente la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo del promotore della β-actina. Questo protocollo consente di determinare sia la localizzazione che la morfologia delle BMDC GFP+ all'interno del topo ricevente utilizzando l'immunoistochimica e facilita l'ulteriore caratterizzazione di queste cellule utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) seguita da successivi saggi biochimici.

Per un BMT di successo, le cellule del midollo osseo ricevente devono essere ablate (chiamata mieloablazione) al fine di generare uno spazio di nicchia all'interno del midollo midollare ricevente per consentire l'attecchimento delle cellule del donatore. Spesso, la mieloablazione si ottiene utilizzando l'irradiazione gamma total body che induce rotture a doppio filamento nel DNA che portano alla morte cellulare, in particolare nelle cellule in divisione attiva come le cellule progenitrici ematopoietiche2,3. I protocolli di irradiazione sono fatti per indurre una morte delle cellule del midollo osseo sufficiente a garantire la letalità dell'animale se l'animale ricevente non raggiunge un adeguato attecchimento delle cellule del donatore dal BMT (la cosiddetta "irradiazione letale"). Tuttavia, l'irradiazione richiede una struttura e attrezzature specializzate, insieme a risorse veterinarie e zootecniche non disponibili per i ricercatori di tutte le istituzioni. Inoltre, l'irradiazione mieloablativa può causare danni potenzialmente letali ad altri tessuti e, a causa dell'immunosoppressione, gli animali irradiati sono più suscettibili alle infezioni secondarie3. Pertanto, sono stati sviluppati regimi di condizionamento a intensità ridotta (i cosiddetti protocolli "RIC") che hanno lo scopo di ridurre al minimo gli effetti collaterali potenzialmente tossici del protocollo di condizionamento nei pazienti, in particolare per l'uso in popolazioni a rischio come bambini e anziani4.

Alcuni protocolli RIC si basano su chemioterapici come il busulfan per condizionare il compartimento midollare. Busulfan è un agente alchilante del DNA bifunzionale spesso utilizzato clinicamente come alternativa all'irradiazione5,6. In particolare, busulfan può essere somministrato in sicurezza ai topi mediante iniezione intraperitoneale (IP) e non richiede le strutture e le attrezzature specializzate necessarie per irradiare i topi. Il condizionamento con busulfan è stato ampiamente utilizzato nel nostro laboratorio7, così come in diverse altre pubblicazioni recenti 8-11. Quando si impiegano dosi di 60-100 mg/kg, si possono stabilire alti gradi di chimerismo stabile (>80% di cellule GFP+) nel sangue periferico e nel BM7. È importante sottolineare che a queste dosi la mieloablazione non è completa e come tale i topi sono in grado di sopravvivere senza ricevere cellule BM di supporto (K. Peake, J. Manning, C. Lewis e C. Krieger, osservazioni non pubblicate). Inoltre, con il condizionamento mielosoppressivo a busulfan si ha una rapida ricostituzione delle cellule mielomonocitiche del sangue periferico da parte delle cellule del donatore. Tuttavia, la sostituzione dei linfociti del sangue periferico con cellule del donatore è più lenta, evidenziando la mancanza di immunosoppressione che si verifica con dosi di 60-100 mg/kg di busulfan rispetto all'irradiazione corporea totale7.

Abbiamo utilizzato con successo il chimerismo indotto da busulfan per studiare le BMDC in topi wild-type, così come in modelli murini delle malattie neurodegenerative sclerosi laterale amiotrofica (SLA)7 e malattia di Alzheimer. È stato osservato che, in determinate condizioni, un numero significativo di BMDC GFP+ si accumula all'interno del SNC7,12. È importante sottolineare che, come il condizionamento mieloablativo con irradiazione, il condizionamento con busulfan seguito da BMT è sufficiente per consentire l'accumulo di BMDC GFP+ all'interno del SNC sia nei topi wild-type che nei topi con disturbi neurologici 7-11. Poiché uno dei principali ostacoli nel trattamento dei disturbi neurodegenerativi è la capacità di portare molecole terapeutiche dalla circolazione al SNC dove possono esercitare effetti benefici, questo solleva la possibilità che le BMDC possano essere ingegnerizzate per esprimere molecole terapeutiche e successivamente utilizzate come veicolo per fornire terapie al SNC di riceventi condizionati da busulfan. un meccanismo che stiamo studiando attivamente. Sebbene abbiamo scoperto che il condizionamento mieloablativo con irradiazione porta a un maggiore accumulo di BMDC GFP+ nel SNC rispetto al condizionamento 7 di busulfan, l'irradiazione può avere una notevole tossicità nei pazienti con disturbi neurodegenerativi e nei modelli murini di malattia del SNC.

Mentre noi, e molti altri, abbiamo utilizzato modelli BMT per studiare i BMDC nei disturbi neurodegenerativi, la capacità di sostituire in gran parte il compartimento BM di un topo ricevente con una popolazione distintamente identificabile di cellule BM è uno strumento inestimabile per studiare vari aspetti del sistema ematopoietico. Ciò include un'ampia gamma di argomenti di ricerca come lo sviluppo del lignaggio ematopoietico, la leucemia, il trapianto di organi, la malattia del trapianto contro l'ospite e l'immunobiologia.

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Protocollo

NOTA: Etica Dichiarazione: Questo protocollo è stato esaminato e approvato dal Comitato di Simon Fraser University Animal Care (UACC; consentire numeri 1037K-12 e 1060K-03) ed è in conformità con il Consiglio canadese cura degli animali, la Guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio, e la direttiva del Consiglio CEE.

1. Considerazioni particolari

NOTA: Busulfan è citotossico. Manipolare e smaltire secondo la scheda dati di sicurezza e le linee guida istituzionali.

  1. Eseguire tutte le tecniche asetticamente in una cappa a flusso laminare.
  2. Sterilizzare strumenti prima dell'uso avvolgendo in un materiale di imballaggio appropriato, ad esempio un pacchetto buccia e autoclave.
  3. Mentre il rischio di infezione è più basso con condizionata busulfan rispetto a irraggiamento, gestire gli animali solo in una cappa a flusso laminare per le prime 2 settimane dopo il trapianto.

2. CondizionamentoTopi riceventi

  1. Diluire busulfan a 3 mg / ml con soluzione salina sterile tamponata fosfato (PBS).
    NOTA: E 'importante fare una nuova diluizione del busulfan appena prima di utilizzare ogni giorno di iniezione.
  2. Somministrare 20 mg / kg di busulfan diluito per topi riceventi tramite iniezione IP quotidiana.
  3. Ripetere iniezioni IP giornaliera di 20 mg / kg fino busulfan una dose totale di 60-100 mg / kg è stata consegnata (cioè, per una dose totale di 80 mg / kg, somministrare 20 mg / kg di busulfan per 4 giorni consecutivi).

3. Isolamento del donatore di midollo osseo Cells

NOTA: Questo protocollo è stato utilizzato con successo per isolare e preparare cellule BM da un massimo di 5 topi donatori. Tipicamente la resa delle cellule per il mouse è di circa 30-40.000.000 BMDCs, che è sufficiente a trapiantare 12-16 topi riceventi. Se sono necessarie più topi donatori il protocollo può avere bisogno di essere adeguato di conseguenza.

  1. Dopo l'ultimo giorno di busulfan condizionata euthanize un topo GFP donatore (1-6 mesi) con CO 2 (o da altra procedura eutanasia accettato istituto). Per evitare complicazioni innesto utilizzano donatori singenici che sono dello stesso sesso come destinatari.
  2. Spray mouse con etanolo al 70%. Pelle Sollevare le forbici chirurgiche addome e con fare un'incisione attraverso la pelle dalla cavità addominale la gamba verso la caviglia. Afferrando il supporto, saldamente tirare la pelle dalla caviglia verso l'anca esposizione del tessuto gamba.
  3. Tagliare via muscoli e tessuto adiposo dal femore per esporre l'articolazione dell'anca.
  4. Mentre delicatamente tirando sul piede di estendere la gamba, premere i forbici contro l'anca. Tagliare appena sopra la testa del femore facendo attenzione a non tagliare femore stesso.
  5. Per aiutare a mantenere la sterilità, tenere la gamba dal piede e pulire qualsiasi restante tessuto dalle ossa strofinando la superficie ossea con i tessuti in autoclave.
  6. Separare femore e tibia tagliando attraverso l'articolazione del ginocchio ecollocare il femore in un piatto di coltura contenente PBS sterile. Incubare in ghiaccio.
  7. Rimuovere e gettare perone tagliando nei punti in cui la fibula collega alla tibia. Posizionare la tibia nel piatto cultura con il femore e incubare su ghiaccio.
  8. Ripetere i passaggi 3,2-3,7 per l'altra gamba, e se necessario, topi donatori supplementari. Dopo la rimozione delle ossa, sterilizzare gli strumenti chirurgici con un tallone sterilizzatrice a caldo o utilizzare una nuova serie di strumenti sterili per le fasi successive.
  9. Per i femori, tenere il femore con una pinza e con le forbici chirurgiche attentamente 'barba' distale finisce l'osso. Rimuovere il meno dell'osso se necessario per esporre la cavità BM.
  10. Riempire una siringa con 3 ml di PBS sterile e inserire un ago G 23. Portava con attenzione l'ago nella cavità BM e lavare la BM in un piatto di coltura sterile. Assicurati di raschiare cavità midollare con la punta dell'ago per garantire la rimozione di tutte le cellule desiderate. Dopo l'estrazione,assicurare che il rosso BM non è più visibile e l'osso appare ora bianco.
  11. Ripetere i passaggi 3,9-3,10 per femori successivi, mettendo in comune tutte le BM nello stesso piatto cultura.
  12. Per la tibie, tenere la tibia con una pinza e con attenzione 'barba' alla fine dove la tibia è stata allegata al ginocchio per esporre la cavità BM. Fare un secondo taglio lungo l'osso in cui termina la BM rosso visibile.
  13. Riempire una siringa con 3 ml di PBS sterile e inserire un ago G 25. Inserire delicatamente l'ago nella cavità BM (dalla fine che era attaccato al ginocchio) e lavare la BM nel piatto di coltura contenente la BM dal femore. Raschiare le pareti della cavità BM con l'ago per rimuovere tutte le cellule. Dopo l'estrazione, assicurarsi che il rosso BM non è più visibile e l'osso ora appare bianco.
  14. Ripetere i passaggi 3,12-3,13 per la successiva tibie, riunendo tutti i BM nello stesso piatto cultura.
  15. Triturare delicatamente la BM con un 1 ml pipetta punta a dissociare la cells.
  16. Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro a cestello 40 mM in una sterile 50 mL provetta da centrifuga. Sciacquare il piatto con PBS per ottenere tutte le cellule residue e trasferire questo attraverso il filtro nel tubo da centrifuga.
  17. Centrifugare per 5 minuti a 450 xga 4 ° C. Rimuovere e scartare il surnatante.
  18. Risospendere il pellet in 3 ml di eritrociti tampone di lisi. Incubare in ghiaccio per 8.5 min.
  19. Aggiungi ~ 30 ml di PBS sterile per placare il buffer di lisi.
  20. Centrifugare per 5 minuti a 450 xga 4 ° C. Rimuovere e scartare il surnatante.
  21. Risospendere il pellet in 1 ml di PBS sterile. Mantenere su ghiaccio.
  22. Prendere una piccola aliquota della omogenato cellulare e diluire con PBS (1: 100 per 1 mouse, 1: 200 per 2 topi, etc.) per quantificare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
  23. Diluire la sospensione cellulare a 8 x 10 6 cellule / ml e incubare in ghiaccio fino iniezione.

4. trapianto di midollo osseo

  1. Fill una siringa da 0,5 ml (con insulina ago 28 G) con 300 ml di sospensione cellulare diluita per ogni mouse da iniettare. Assicurarsi di rimuovere eventuali bolle d'aria presenti nella siringa.
  2. Posizionare la gabbia del mouse che contiene i topi riceventi condizionati su una piastra elettrica e consentire le vene coda di dilatarsi.
  3. Prendete un mouse destinatario e posto nel dispositivo di ritenuta. Pulire la coda con una garza chirurgica imbevuta di etanolo al 70%.
  4. Tenere saldamente la coda e lo smusso up, inserire delicatamente l'ago in una delle vene coda laterali e iniettare la sospensione cellulare.
  5. Tenere garza chirurgica sul sito di iniezione fino a emorragia si ferma prima di introdurre il mouse in una nuova gabbia pulita.

5. valutare l'estensione di BM chimerismo

NOTA: i livelli di chimerismo sono in genere variabile nel sangue periferico dopo 1 settimana post-BMT, e come tali livelli chimerismo sono normalmente stimate almeno 2 settimane dopo BMT. Livelli di chimerism dovrebbe raggiungere> 80% GFP + cellule del sangue periferico entro 3-4 settimane dopo BMT.

  1. Preparare tampone FACS (2 mM EDTA + 2% di siero fetale bovino in PBS).
    NOTA: tampone FACS può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane.
  2. Posizionare il mouse in un tubo di contenimento e accorciare il pelo sulla gamba posteriore, per esporre la vena safena laterale.
  3. Cappotto sottilmente la gamba con vaselina e forare la vena safena con un ago 25 G.
  4. Raccogliere circa 50 ml di sangue con un tubo capillare eparina rivestito. Aggiungere il sangue in una provetta micro-centrifuga contenente 1 ml di tampone FACS. Mescolare il tubo per inversione e memorizzare su ghiaccio.
  5. Tenere garza chirurgica sul sito di iniezione fino a quando il sanguinamento si arresta prima di tornare mouse avanti alla gabbia.
  6. Centrifugare i campioni di sangue per 5 min a 900 x g. Rimuovere e scartare il surnatante.
  7. Risospendere il pellet in 500 ml di eritrociti buffer di lisi. Incubare in ghiaccio per 8.5 min.
  8. Aggiungere 1 ml di tampone FACS per placare il buffer di lisi.
  9. Centrifugare i campioni per 5 min a 900 x g. Rimuovere e scartare il surnatante.
  10. Eseguire una seconda fase di lisi in 500 ml di buffer di lisi degli eritrociti. Incubare in ghiaccio per 8.5 min.
  11. Aggiungere 1 ml di tampone FACS per placare il buffer di lisi.
  12. Centrifugare i campioni per 5 min a 900 x g. Rimuovere e scartare il surnatante. Controllare che il pellet è ora bianca.
    NOTA: Se il pellet appare ancora rosso, un passo lisi supplementare può essere necessario prima di procedere alla fase successiva.
  13. Risospendere il pellet in 1 ml di tampone FACS. Centrifugare i campioni per 5 min a 900 x g. Rimuovere e scartare il surnatante.
  14. Risospendere il pellet in 300 ml di tampone FACS e quantificare + cellule GFP mediante citometria a flusso (NOTA: A questo punto qualsiasi immunocolorazione desiderato delle cellule può essere eseguita, utilizzando tecniche standard, prima analisi citofluorimetrica).

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Risultati

La somministrazione di 60-100 mg / kg di busulfan è generalmente ben tollerato dai topi. Tuttavia, gli animali in genere perdere peso durante la fase di condizionamento (~ 5-10%) e, quindi, la dieta può essere integrata con gli ossequi, come semi di girasole irradiati per incoraggiare mangiare. Livelli di chimerismo di GFP + cellule> 80% nel sangue periferico e BM dovrebbero essere sempre raggiungibili con 60-100 mg / kg busulfan 7. Il nostro laboratorio ha utilizzato con successo questo protocollo per gen...

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Discussione

Condizionata busulfan consente la generazione di alto livello BM chimerismo in topi con cellule ematopoietiche che sono facilmente rilevabili. Questo condizionamento può essere eseguita senza la necessità di impianti di irradiazione. Inoltre, mielosoppressione con le dosi di busulfan descritto in questo protocollo è ben tollerato, riducendo al minimo gli effetti collaterali tossici causati da dosi mieloablativi di irradiazione, e quindi può essere una tecnica più adatta a generare BM chimerismo nei giovani, vecchi, mala...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dalla Ronald Peter Griggs Memorial Fellowship in ALS Research (a KP) e da una sovvenzione del Neuromuscular Research Partnership Program dal CIHR, dalla ALS Society of Canada e dalla Muscular Dystrophy Canada (JNM-69682) a CK e FMR. Un ulteriore supporto è stato fornito anche dalla ALS Society of America (57969). Vorremmo ringraziare il Dr. R. Keith Humphries del Terry Fox Laboratory/Department of Pathology, BC Cancer Agency, Vancouver, Canada e il personale della Simon Fraser University Animal Care Unit.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BusulfexOtsuka Canada Pharmaceutical Inc.DIN 02240602Diluire busulfan a 3 mg/mL con PBS sterile appena prima dell'uso. Busulfan è citotossico. Maneggiare e smaltire secondo le schede di sicurezza e le linee guida istituzionali.
ACK Lysing Buffer LifeTechnologiesA10492-01È possibile sostituire un altro tampone di lisi, ma potrebbe essere necessario regolare di conseguenza i tempi di incubazione
Siero fetale bovinoLife Technologies12483-020

Riferimenti

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Condizionamento con BusulfanoTrapianto di Midollo OsseoAnalisi tramite Citometria a FlussoCellule GFP PositiveIsolamento del Midollo OsseoIniezione in Vena CaudaleAnalisi del Sangue PerifericoAccumulo nel Sistema Nervoso Centrale

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