Articolo metodologico

Forward Genetica schermi usando macrofagi per identificare

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DOI:

10.3791/52556

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12 marzo 2015

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1Department of Microbiology and Immunology, New York Medical College

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

La genetica in avanti è un potente approccio per identificare i geni nei patogeni intracellulari importanti per la resistenza all'immunità autonoma cellulare. L'approccio attuale utilizza cellule immunitarie innate, in particolare macrofagi, per identificare nuovi geni Toxoplasma gondii importanti per l'evasione immunitaria.

Abstract

Il Toxoplasma gondii, l'agente eziologico della toxoplasmosi, è un patogeno protozoo intracellulare obbligato. Il parassita invade e si replica praticamente all'interno di qualsiasi tipo di cellula vertebrata a sangue caldo. Durante l'invasione parassitaria di una cellula ospite, il parassita crea un vacuolo parassitoforo (PV) che origina dalla membrana della cellula ospite indipendentemente dalla fagocitosi all'interno della quale il parassita si replica. Mentre l'immunità innata e cellulo-mediata dipendente dall'IFN è importante per l'eventuale controllo dell'infezione, le cellule immunitarie innate, inclusi neutrofili, monociti e cellule dendritiche, possono anche fungere da veicoli per la disseminazione sistemica del parassita nelle prime fasi dell'infezione. Viene descritto un approccio che utilizza la risposta immunitaria innata dell'ospite, in questo caso i macrofagi, in uno screening genetico diretto per identificare i mutanti del parassita con un difetto di fitness nei macrofagi infetti dopo l'attivazione ma la normale invasione e replicazione nei macrofagi naïve. Pertanto, lo schermo isola i mutanti parassiti che hanno un difetto specifico nella loro capacità di resistere agli effetti dell'attivazione dei macrofagi. L'articolo descrive due ampi fenotipi di parassiti mutanti in seguito all'attivazione di macrofagi infetti: stasi del parassita contro degradazione del parassita, spesso in vacuoli amorfi. I mutanti del parassita vengono quindi analizzati per identificare i geni del parassita responsabili specificamente importanti per la resistenza ai mediatori indotti dell'immunità autonoma cellulare. L'articolo presenta un approccio generale per lo screening genetico diretto che, in teoria, può essere modificato per colpire geni del parassita importanti per la resistenza a specifici mediatori antimicrobici. Descrive inoltre un approccio per valutare gli specifici mediatori antimicrobici macrofagici a cui il mutante del parassita è suscettibile. L'attivazione dei macrofagi infetti può anche promuovere la differenziazione del parassita dallo stadio di tachizoite a quello di bradizoite che mantiene l'infezione cronica. Pertanto, viene presentata una metodologia per valutare l'importanza del gene del parassita identificato per l'instaurazione dell'infezione cronica.

Introduzione

Toxoplasma gondii (T. gondii) è un intracellulare obbligato, patogeno da protozoi. E 'l'agente eziologico della toxoplasmosi, un pericolo per la salute in soggetti immunocompromessi. E 'anche il sistema di modello per altri patogeni Apicomplexa che infettano gli esseri umani, tra cui Cryptosporidium e Cyclospora. La toxoplasmosi è più comunemente acquisito attraverso l'ingestione di cibo o acqua contaminati con la fase bradyzoite o oocisti del parassita. Dopo l'ingestione, queste fasi convertono alla fase tachizoite del parassita che replica all'interno di cellule ospiti e diffonde per via sistemica. Cellule T, IFN-γ e, in misura minore, ossido nitrico 1-4, sono importanti per il controllo di infezione, ma non sono in grado di eliminare la malattia, in proporzione tachizoiti convertono alla fase bradyzoite che sono protetti all'interno cisti tissutali causando una infezione cronica di lunga durata. In realtà, non esistono terapie efficaci contro la cisti s cronicatage della malattia. Grave toxoplasmosi è più spesso dovuta alla riattivazione di infezione persistente, con la fase bradyzoite del parassita riconversione palco rapidamente replicando caratteristico tachizoite di infezione primaria e acuta.

Sopravvivenza All'inizio faccia della risposta immunitaria innata è importante per permettere al parassita di raggiungere numeri parassiti sufficiente, nonché di raggiungere siti distali, per consentire costituzione di infezione cronica. T. gondii è evoluto strategie per contrastare i meccanismi di difesa dell'ospite che probabilmente contribuiscono alla sua capacità di replicare e diffondere all'inizio dell'infezione. Primo, T. gondii forma un PV unico durante parassita invasione che è in gran parte separata dai processi endocitiche e esocitosi della cellula ospite rispetto ad altri patogeni intracellulari 5-9. Inoltre, come tutti di successo patogeni intracellulari T. gondii modifica la sua cellula ospite per creare un ambiente permissivo fo la crescita. Questo include l'espressione genica della cellula ospite riprogrammazione alterando fattori di trascrizione della cellula ospite, comprese quelle importanti per la regolazione attivazione delle cellule 10-15. ROP16 16-19, GRA15 20, 21 e GRA16 GRA24 22 hanno tutti dimostrato di essere importante nella regolazione della risposta trascrizionale e segnalazione cellulare cascate di cellule ospiti infettate con T. gondii. Studi recenti, con incroci genetici tra ceppi di parassiti con fenotipi distinti sono stati molto produttivi per identificare i geni che sono alla base di parassiti tratti genotipo-dipendente parassiti, tra cui l'evasione legate all'immunità GTPases (IRG) 16,19,23-26. Nei topi, legate all'immunità GTPasi (IRG) sono fondamentali per il controllo di tipo II e III genotipi del parassita, mentre il tipo molto virulenta I genotipi sono evoluti meccanismi per eludere le IRG murini. Tuttavia, è anche evidente che il parassita è evoluto meccanismi per eludere mezzi antimicrobicatori in aggiunta ai IRGs e che alcuni di questi meccanismi possono essere conservati tutti genotipi parassita 27,28. Inoltre, si sa molto poco circa i mediatori critici di cellule dell'immunità autonoma contro T. gondii durante toxoplasmosi umana. Parasite geni importanti per la resistenza ai mediatori di cellule dell'immunità autonoma possono essere importanti per la sopravvivenza durante tachizoite a bradyzoite conversione che può anche essere attivato da risposta immunitaria. Ad esempio, l'ossido nitrico ad alti livelli può sopprimere la replicazione parassita in macrofagi infettati ma può anche stimolare tachizoite a bradyzoite conversione con conseguente produzione cisti 30-32.

ToxoDB è un database genomica funzionale per T. gondii che funziona come una risorsa critica per il campo in termini di fornitura di informazioni di sequenza del genoma del parassita e l'accesso ai dati in scala genomica editi e inediti tra cui le annotazioni di comunità, gene exp ression e proteomica dati 33. Simili molti patogeni protozoarie, la maggior parte del genoma è costituito da geni ipotetici senza informazioni disponibili sulla base gene omologia fornire una conoscenza loro potenziali funzioni. Così, la genetica in avanti è un potente strumento per identificare i geni parassiti nuovi importanti per evasione immune, la conversione cisti e altre funzioni critiche per parassita patogenesi e per la conversione tra le varie fasi di sviluppo differenti. Un ulteriore punto di forza genetica diretta è che può essere usato come un approccio relativamente non polarizzato per interrogare il parassita per i geni che sono importanti per compiti specifici in patogenesi, comprese evasione immune e formazione di cisti. Recenti miglioramenti a sequenziamento di nuova generazione per la profilazione mutazionale hanno fatto un metodo di scelta per identificare i geni parassita responsabile di genetica a termine studi utilizzando sia chimico inserzionale mutagenesi 34-37.

S copi "> E 'importante identificare le vulnerabilità in T. gondii che possono essere sfruttate per migliorare l'efficacia delle cellule meccanismi immunitari autonomi contro il parassita particolare quelli che potrebbero essere anche attivo contro il palco cisti resistente. A tal fine, in vitro murino infezione macrofagi e modello di attivazione è stato sviluppato per identificare le mutazioni nel parassita che specificamente compromettere T. gondii idoneità dopo l'attivazione dei macrofagi infetti, ma non in macrofagi ingenui. Questa schermata macrofagi è stata utilizzata per interrogare una libreria di T. gondii mutanti inserzionali per fine identificare i geni T. gondii importanti per la resistenza a ossido nitrico 27,28. L'isolamento di un pannello di mutanti T. gondii con resistenza ridotta alla attivazione di macrofagi infettati, in particolare una marcata sensibilità per ossido nitrico, dimostrato l'utilità di schermo per identificare geni parassita importanti per la resistenzaai mediatori di cellule dell'immunità autonome diverso i meccanismi di resistenza descritti per i IRG murini 28. Mutagenesi inserzionale presenta vantaggi rispetto mutagenesi chimica in termini di generazione di un numero limitato di mutazioni casuali in ogni clone parassita e, in teoria, più facile identificazione del sito di mutazione. Tuttavia, identificando il sito di inserzione del plasmide genomico in T. mutanti inserzionali gondii, in pratica, è stato sorprendentemente difficile in molti casi 37. Inserimento di un plasmide in un gene è anche probabile che interrompere la funzione di un gene in contrasto mutagenesi chimica che provoca tipicamente cambiamenti singolo nucleotide. Tuttavia, mutagenesi chimica sia con N-etil-N-nitrosourea (ITA) o sulfonato ethylmethane (EMS) può offrire una maggiore capacità di analizzare una porzione più ampia del genoma del parassita, rispetto alla mutagenesi inserzionale, in quanto crea più polimorfismi a singolo nucleotide ( stimato a 10 -100) per mutante 34, 38. Inoltre, i recenti progressi in tutto il profiling genoma ha reso possibile l'utilizzo di sequenziamento di nuova generazione per identificare i geni candidati più probabili responsabili del fenotipo identificato di un parassita mutato 34,38. Indipendentemente dal metodo mutagenesi, conferma del ruolo del gene parassita resistenza alla attivazione dei macrofagi richiede infine delezione genica e complementazione di soddisfare postulati di Koch molecolare.

La capacità di analizzare la funzione di un gene mediante manipolazione genetica sia del parassita e macrofagi è importante in quanto molti dei geni identificati tramite genetica diretta in T. gondii, così come altri agenti patogeni, sono ancora caratterizzati come geni ipotetici con poca o nessuna omologia di sequenza con altre proteine ​​con funzioni note. La carta corrente delinea un approccio generale che può essere utilizzato per identificare se il gene interrotto in un mutante è importante per la resistenza ad una nota osconosciuto mediatore della cellula immunità autonoma. L'analisi iniziale di accoglienza fattori antimicrobici è effettuata valutando la sopravvivenza di tipo selvatico e parassiti mutanti in macrofagi da topi wild type rispetto a quelli con specifiche delezioni geniche in ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS), gp-91 phox (NADPH ossidasi), e specifiche GTPasi legate all'immunità (IRG). Questo determinerà se i geni identificati parassita sono importanti per la resistenza a ossido nitrico, intermedi reattivi dell'ossigeno o legate all'immunità GTPases 28 rispettivamente o se un meccanismo immunitario sconosciuto è coinvolto. L'attivazione dei macrofagi infetti sia con IFN-γ e LPS, descritti nel protocollo attuale, si traduce principalmente nel isolamento di geni importanti per la resistenza dei parassiti a ossido nitrico 28. L'uso di agenti farmacologici che inducono ossido nitrico in assenza di attivazione dei macrofagi (donatori di ossido nitrico) ha confermato che la maggior parte dei geni identificati fosse importante per riresistenza a ossido nitrico, piuttosto che l'ossido di azoto in concerto con i mediatori aggiuntivi associati macrofagi attivazione 28.

Fase uno e due descrivono uno schermo genetica avanti volto a isolare i mutanti del parassita con un difetto di forma fisica dopo l'attivazione dei macrofagi del midollo osseo infette in vitro. Passo si descrive un'analisi titolazione della dose per determinare empiricamente una dose di IFN-γ e LPS da utilizzare per l'attivazione dei macrofagi, che riduce la replicazione del parassita, ma non inibisce completamente la replica di tipo T. selvaggia ceppo parentale gondii che viene utilizzato per la creazione della biblioteca di mutanti del parassita. Fase due descrive la schermata genetica avanti dei cloni mutanti nei macrofagi in piastre da 96 pozzetti. Fase tre delinea un approccio per confermare il fenotipo di ogni mutante identificato nella schermata dei 96 pozzetti e di valutare se il difetto in ogni mutante influenza la sopravvivenza del parassita, la replica,o di produzione cisti in risposta all'attivazione dei macrofagi. Fase quattro descrive l'uso di macrofagi del midollo osseo da topi con delezioni in specifiche vie antimicrobiche per identificare i mediatori immunitari a cui il mutante parassita è specificamente sensibili. Fase cinque delinea un approccio per determinare se un mutante parassita è anche compromesso da in vivo patogenesi come valutato dalla produzione cisti nel cervello dei topi infettati.

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Protocollo

NOTA: Tutti i protocolli che prevedono l'uso di animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali del New York Medical College and Use Committee.
NOTA: dettagliata protocolli per mutagenesi chimica 38, isolamento di parassiti, limitando la diluizione 38, isolamento di murine macrofagi midollo osseo derivate 39, la crescita di T. gondii in fibroblasti prepuzio umano (HFF) cellule e cisti produzione nei macrofagi e analisi di base immunofluorescenza (IFA) 32 viene fatto riferimento. Eseguire tutti coltura cellulare a 37 ° C in 5% CO 2 in mezzi D10 (Dulbecco Modified alta glucosio Eagle Medium supplementato con 10% siero fetale di vitello, 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina) . Conservare tutti i reagenti sterili tutto isolamenti cellulari e colture cellulari.

1. La titolazione della dose di IFN-γ e LPS per determinare la Concentrni utilizzare per attivare macrofagi infetti per lo schermo Forward Genetics

  1. Culture osseo murino derivate dal midollo macrofagi O / N a otto vetrini camera ad una concentrazione di 3 x 10 5 cellule / ml in 250 ml di D10 supporti per ogni camera. Utilizzare macrofagi di uno o due settimane dopo l'isolamento dal midollo osseo.
    NOTA: diapositive Camera sono acquistati che hanno una crescita RS migliorando lavare.
  2. Utilizzare un emocitometro per contare i parassiti di tipo selvatico raccolti da fibroblasti prepuzio umano (HFF), le cellule coltivate in un pallone di coltura tissutale T25. Risospendere parassiti ad una concentrazione di 5 x 10 5 Tipo parassiti selvatici per ml in mezzi D10. Questa concentrazione si tradurrà in una molteplicità di infezione di circa 1: 1 come i macrofagi sono moltiplicate O / N. Utilizzare provette di polistirene o PET per tutte le manipolazioni con i parassiti come i bastoncini parassita polipropilene.
  3. Rimuovere il supporto D10 nelle diapositive da camera e sostituirlo con 250 microlitri dellasospensione del tipo parassiti selvatici. Aggiungere delicatamente la sospensione parassita ciascuna camera della slitta consentendo di scorrere lungo la faccia interna di ciascuna camera. Non permettere macrofagi si asciughino in qualsiasi momento durante il protocollo.
  4. Copertina diapositive da camera infettati con i parassiti con il coperchio scorrevole della camera e posto in un incubatore a 37 ° C in 5% di CO 2 per 4 ore per dare il tempo per il parassita di invadere e stabilire un PV.
  5. Effettuare diluizioni di LPS e IFN-γ in 1 ml di mezzi D10 in provette sterili per le titolazioni di dosaggio. Per la dose titolazioni mantenere sia LPS o costante concentrazione IFN e variano l'altro stimolo 40.
    1. Ad esempio, mantenere LPS costante a 10 ng per ml LPS e variare la concentrazione di IFN-γ (0, 1 unità / ml, 10 unità / ml, 100 unità / ml, 1.000 unità / ml). Tenere IFN-γ costante a 100 unità / ml e variare la concentrazione di LPS (0, 0,1 ng / ml, 1 ng / ml, 10 ng / ml, 100 ng / ml). Brevemente agli ultrasuoni magazzino LPS per 2 min senzariscaldamento in un bagno sonicatore (non con un sonicatore punta) prima della diluizione.
      NOTA: Sonicazione si consiglia di interrompere aggregati micelle formate da LPS che non possono vincolare adeguatamente per ospitare le cellule.
  6. 4 ore dopo l'inizio della co-coltura tra i parassiti e macrofagi aderenti nella camera di diapositiva, scartare il supporto D10 in ciascuna camera e sostituirlo con 300 ml di diluizioni appropriate di IFN-γ e LPS in mezzi D10. Include un controllo con solo supporti D10 per valutare replica parassita in assenza di attivazione dei macrofagi.
  7. Re-cover diapositive da camera con il coperchio scorrevole della camera e posto in un incubatore a 37 ° C in 5% di CO 2 per 24 a 30 ore aggiuntive.
    NOTA: Il tempo di incubazione dipende dal tempo di raddoppio del ceppo wild type parassita che può variare 6-12 ore a seconda del ceppo parassita. Un punto di tempo viene scelto prima parassita lisi dei macrofagi ingenui, ma abbastanza a lungo da permettere almeno 3-4 doutempi bling.
  8. Fare una soluzione di formaldeide 2,5% in tampone fosfato di Dulbecco (PBS). Eliminare i media nella diapositiva da camera e sostituirlo con 300 ml di soluzione di formaldeide 2,5%. Fix per 20 minuti a temperatura ambiente.
  9. Slitta Rinse (s) due volte con 300 ml di PBS per ogni camera. Per ogni risciacquo, scartare il PBS nel vetrino e nuova PBS delicatamente la superficie interna di ciascuna camera di scorrimento per non ostacolare i macrofagi aderito alla slitta. Aggiungere 300 ml di PBS per camera e il coperchio posto sul vetrino della camera per evitare che scivoli si secchi prima della colorazione.
    NOTA: Le diapositive possono essere posizionato a 4 ° C per un massimo di 3 giorni in questo punto prima della colorazione.
  10. Protocollo di colorazione per T. rilevamento gondii microscopio immunofluorescenza (IFA).
    1. Effettuare una soluzione allo 0,2% Triton X-100 in PBS (tampone di permeabilizzazione). Porre la soluzione in un tubo a 37 ° C bagnomaria e brevemente vortice di garantire il Triton X-100 va in soluzione. Eliminare ilPBS nelle diapositive da camera e sostituirlo con 300 ml di buffer permeabilizzazione. Lasciare a temperatura ambiente per 30 min.
    2. Fare una soluzione di siero di capra 10% in PBS (soluzione bloccante). Eliminare il buffer permeabilizzazione nella diapositiva e sostituire con 300 ml di soluzione bloccante per ogni camera. Lasciare a temperatura ambiente per 30 min.
      NOTA: il siero fetale di vitello può essere sostituito con siero di capra in tutti i protocolli di colorazione.
    3. Per un protocollo di colorazione IFA un passo, fare una diluizione 1: 1000 di un anticorpo fluorescente coniugato T. gondii nel bloccare soluzione. Rimuovere la soluzione di blocco da diapositive e aggiungere 150 ml di soluzione di anticorpi per ogni camera. Riposizionare il coperchio scorrevole sul vetrino della camera per evitare che le cellule si secchi. Incubare per 1 ora a RT.
      NOTA: concentrazione di anticorpo deve essere determinata empiricamente a seconda della sorgente. Anticorpo viene acquistato direttamente coniugato ad un fluorocromo o coniugato ad un fluorocromo dall'utente.
      1. Per due fasi IFA colorazioneprotocollo con un anticorpo coniugato a T. gondii e un anticorpo secondario coniugato fluorescente, diapositive macchia con 150 ml di anticorpo primario non coniugato contro T. gondii in tampone bloccante per 1 ora a RT. Sciacquare 3x con 300 ml di PBS più siero di capra 1% (tampone di lavaggio).
      2. Aggiungere 150 ml di anticorpo secondario fluorescente coniugato specifici per la specie di origine per l'anticorpo primario. Riposizionare il coperchio scorrevole sul vetrino della camera per evitare che le cellule si secchi. Incubare per 1 ora a RT.
    4. Sciacquare i vetrini 3x con PBS più siero di capra 1% (tampone di lavaggio). Per ogni risciacquo, rimuovere la soluzione nella camera di diapositive scaricando i suoi contenuti e sostituirlo con 300 ml di tampone di lavaggio.
    5. Sciacquare i vetrini 2x con 300 ml di PBS.
    6. Togliere la camera dalla diapositiva camera secondo le istruzioni del produttore.
    7. Montare i vetrini con supporto contenente DAPI montaggio (4'6-diamidino-2-fenilindolo, Dilattato) e 22 mm x 50 millimetri coprioggetto.
  11. Esaminare i vetrini con contrasto di fase e microscopia a fluorescenza. Determinare il numero medio di parassiti per vacuole esaminando un minimo di 100 PV per camera di bene. La dose scelta di IFN-γ e LPS per lo schermo deve essere sufficiente per sopprimere, ma non impedisce, replica di parassiti wild type (vedi Figura 1).

2. Isolamento di Parasite Mutants con un fitness difetto dopo l'attivazione di macrofagi infetti

NOTA: Una libreria di T. casuale mutanti gondii è necessario per la schermata di genetica in avanti. Mutagenesi casuale di T. gondii può essere eseguita da chimica (ITA / EMS) o mutagenesi inserzionale 27,28,38. A seguito di mutagenesi, parassiti clone limitando la diluizione e crescere singoli cloni in piastre da 96 pozzetti contenenti cellule HFF aderenti in un volume di 200 ml di supporti D10 32,38.E 'fondamentale che le piastre a 96 pozzetti per lo screening di parassiti in macrofagi mediante microscopia ottica hanno fondi per consentire lo screening microscopica. Contrasto di fase e microscopia a fluorescenza per lo screening macchiati piastre a 96 pozzetti richiede un microscopio a fluorescenza invertito con contrasto di fase 4, 10, 20 o obiettivo 40X attrezzato per lunghe distanze di lavoro. Un obiettivo 4X è utile per vedere l'intero perfetto ma migliore risoluzione dei parassiti viene raggiunto con l'obiettivo 20X.

  1. Trasferire 50 ml di mutanti tachizoiti coltivate in cellule HFF confluenti in piastre di coltura tissutale a 96 pozzetti in due replicano piastre a 96 pozzetti contenenti macrofagi derivate dal midollo osseo di topo (1-2 settimane dopo l'isolamento) in 100 ml di mezzi D10.
    NOTA: Eseguire la schermata iniziale in piastre da 96 pozzetti del parassita in base al volume della cultura parassita per evitare di dover contare il numero di parassiti trasmessi per ciascun pozzetto. Pertanto, l'analisi di microscopia a 2,6 si basa su qualitativamente tavoer i parassiti sono in genere replicate o meno replicato. Fase 3 descrive l'approccio di confermare il fenotipo dei mutanti in diapositive da camera con un numero uguale di tipo selvatico o parassiti mutanti di infettare i macrofagi.
    1. Direttamente aggiungere parassiti ai media D10 già in ogni pozzetto. Infettare due pozzi con tipo tachizoiti selvatici come controllo positivo per la replica del parassita.
  2. Porre le cellule infette in un incubatore (37 ° C e 5% CO 2) per 4 ore per consentire parassiti tempo di invadere le cellule e creare la PV.
  3. Rimozione di supporti da una piastra a scarico il contenuto della piastra. Utilizzare una sola vibrazione del polso di scaricare i media nella piastra in una vasca di scarto contenente un Cidal detersivo per i parassiti.
    1. Aggiungere 100 ml di "supporti l'attivazione dei macrofagi" utilizzando un bacino sterile per i media e una pipetta multicanale. Utilizzare la concentrazione ottimale di LPS e IFN-γ determinata dal passo 1 per il macmezzi di attivazione rophage. Allo stesso modo rimuovere il supporto dalla piastra di controllo duplicato e sostituirlo con 100 ml di mezzi D10.
  4. Porre le cellule infette in un incubatore (37 ° C e 5% CO 2) per un ulteriore 24-30 hr.
  5. Protocollo di colorazione per piastre a 96 pozzetti per IFA.
    1. Eliminare i media nel piatto e sostituirlo con 100 ml di 2,5% di formaldeide in PBS. Incubare per 20 minuti a RT. Utilizzare un bacino sterile per la formaldeide e una pipetta multicanale.
    2. Eliminare la soluzione di formaldeide nella piastra e aggiungere 100 microlitri di PBS per lavare formaldeide dalla piastra.
    3. Eliminare la soluzione nella piastra e aggiungere 100 ml di tampone di permeabilizzazione (PBS con 0,2% Triton X-100) a ciascun pozzetto. Incubare per 30 minuti a RT.
    4. Eliminare la soluzione nella piastra e aggiungere 100 ml di soluzione di bloccaggio (PBS con siero di capra 10%) a ciascun pozzetto. Incubare per 30 minuti a RT.
    5. Eliminare la soluzione nella pin ritardo. Aggiungere 50 ml / pozzetto di un anti T. fluorescente coniugato anticorpo gondii diluito 1: siero di capra 1000 in PBS più 1%. Incubare per 1 ora a RT con il coperchio e piastra su un bilanciere.
      1. In alternativa, utilizzare un anticorpo primario non coniugato contro T. gondii seguita da colorazione con un anticorpo secondario coniugato fluorescente come descritto in 1.10.3.1.
    6. Eliminare la soluzione di anticorpi nel piatto e sostituirlo con 100 ml / pozzetto di PBS più siero di capra 1%. Eseguire questo 3x risciacquo seguito da 2 risciacqui aggiuntivi con solo PBS. Lasciare 200 microlitri di PBS in ciascun pozzetto e sostituire il coperchio sulla piastra da 96 pozzetti per evitare i pozzetti da essiccazione.
      NOTA: La piastra con il coperchio può essere avvolto in parafilm e posto a 4 ° C per 3 giorni prima analisi al microscopio.
  6. Esaminare le cellule al microscopio a fluorescenza rovesciato con un obiettivo 20-40x. Selezionare i mutanti che replicano nella na &# 239; ve piatto macrofagi, ma soprattutto non riescono a replicare oltre un parassita / vacuole in "macrofagi attivati" o che appaiono amorfa o degradati in "macrofagi attivati".
    NOTA: Il numero di parassiti di tipo selvatico per vacuolo dipende dalla dose di IFN-γ e LPS utilizzati ma idealmente è di circa 4 parassiti per vacuole; un numero che riflette soppressione della crescita ma non completa inibizione della replicazione dallo stimolo di attivazione.

3. Valutare i Mutanti per determinare se il difetto è a livello di Parasite sopravvivenza o di replica dopo l'attivazione dei macrofagi infetti

  1. Trasferimento scelto mutanti parassiti da piastre a 96 pozzetti (contenuti dell'intero bene) per T25s contenenti cellule HFF e consentire la replica.
  2. Culture midollo osseo macrofagi derivati ​​O / N a 8 vetrini camera ad una concentrazione di 3 x 10 5 cellule / ml in 250 ml di supporti D10. Preparare una diapositiva per confrontare pareplica rasite in macrofagi ingenui e uno scivolo ulteriore per confrontare replica parassita dopo l'attivazione dei macrofagi infetti.
  3. Harvest parassiti tachizoiti e contano in un emocitometro. Aggiungere 5 × 10 4 T. gondii parassiti ad una camera ben contenente macrofagi nei media e nella cultura D10 per 4 ore. Includere un pozzetto con wild type parassiti genitori come controllo. Seminare uno scivolo replicare identico con lo stesso clone parassita che non riceverà supporti attivazione al fine di monitorare la replica di parassiti in macrofagi naïve.
  4. Eliminare supporti D10 dal 1 delle diapositive da camera replicati e sostituirlo con 250 ml di "mezzi di attivazione". Eliminare supporti D10 dall'altra vetrino camera di replicare e sostituirlo con 250 ml di mezzi D10. Incubare sia il "attivati" e "naif" slide macrofagi con il coperchio scorrevole sulla camera a 37 ° C e 5% CO 2 per un additionale 24-30 ore.
  5. Fix, permeabilize, e scivoli blocco per IFA colorazione e l'analisi dei parassiti, come descritto al punto 1. Eseguire IFA colorazione con le camere intatti.
    1. Cellule Co-macchia con un anticorpo di membrana lisosomiale 1 associato (LAMPADA1) o Lysotracker e gli anticorpi del T. gondii per valutare se l'attivazione dei macrofagi infetti sta provocando la fusione delle PV mutanti con i lisosomi (Figura 4).
    2. Usare anticorpi contro specifici comparti / organelli all'interno del parassita / PV per la colorazione da IFA per identificare alterazioni del mutante parassita che sono evidenti presto seguito macrofagi attivazione 28.
      NOTA: Tali alterazioni possono fornire una conoscenza del meccanismo che sta alla base del deficit di sopravvivenza / replica del mutante dopo l'attivazione dei macrofagi.
  6. Esaminare i vetrini con un microscopio a fluorescenza e obiettivo 100X olio fase.
    1. Valutare replica parassita determinando lanumero di parassiti per fotovoltaico in 100 vacuoli casuali. Eseguire almeno 2 conti di 100 vacuoli ciascuno per l'analisi statistica.
    2. Valutare morfologia parassita generale utilizzando sia analisi di fluorescenza e microscopio a contrasto di fase. Vedi parassiti sotto dell'obiettivo 100x fase. Parassiti sani hanno parassiti ermeticamente racchiuso all'interno di un vacuolo parassitoforo aderente. Parassiti che hanno amorfi vacuoli spaziose con fase cerchi dense o parassiti amorfi suggeriscono parassita morte piuttosto che solo un difetto in replica (figure 1 e 3).

4. Valutare se la suscettibilità di Mutant Parassiti per attivazione dei macrofagi infetti è associato a noti mediatori anti-microbiche

  1. Isolare macrofagi derivate dal midollo osseo da wild type C57 / BL6 topi, iNOS - / -, gp91-phox - / - o Irgm1 / Irgm3 - / - mice 32.
  2. Mac Cultura rispettivo midollo osseo derivaterophages O / N a 8 vetrini camera ad una concentrazione di 3 x 10 5 cellule / ml in 250 ml di supporti D10.
  3. Procedere con la sfida parassita, IFA colorazione e l'analisi come descritto al punto 3.
  4. Determinare se la capacità dei parassiti mutanti per sopravvivere e replicarsi dopo l'attivazione dei macrofagi infetti viene ripristinato in assenza di ossigeno reattivo o specie di azoto o immunità specifica GTPases 28 connessi.
  5. Utilizzare agenti farmacologici, come donatori di ossido di azoto, per valutare se specifici mediatori anti-microbici sono sufficienti da soli a mettere in pericolo i parassiti mutanti nelle cellule HFF o macrofagi ingenui o se agiscono solo di concerto con altri mediatori di macrofagi attivazione 28.

5. Valutare se il difetto nella infezione cronica Mutant Parasite Compromessi

  1. Isolare tachizoiti da wild type, mutante o gene cancellato parassiti mirati cresciuta in T25s containing cellule HFF. Parassiti devono essere appena lisati da colture HFF.
  2. Conte parassiti con un emocitometro. Parassiti Risospendere in soluzione salina bilanciata Hanks (HBSS) ad una concentrazione appropriata per ml per una dose subletale del parassita consegnato in 200 microlitri da iniezione intraperitoneale (IP).
  3. Utilizzare una siringa tubercolina 1 ml e 25 G ago per iniettare parassiti, con un volume di 200 ml per via intraperitoneale (IP). La dose dipende dal tipo ceppo selvatico del parassita e il genotipo mouse.
    NOTA: di tipo I genotipi del parassita sono letali per i topi durante la fase acuta dell'infezione, indipendentemente dalla dose parassita e non sono adatti per gli studi di infezione cronica in assenza di chemioterapia per T. gondii per sopprimere la replicazione del parassita.
  4. Trenta giorni dopo sfida parassita, sacrificare i topi per inalazione di CO 2 da un serbatoio pressurizzato in una camera poco affollato (una gabbia standard di dimensione del mouse può contenere non più di 5 mghiaccio) seguita da dislocazione cervicale.
  5. Isolare il cervello dal mouse utilizzando procedure stabilite 41-43.
    1. Posare il mouse sul lato anteriore. Spruzzare la testa con etanolo al 70% per sterilizzare l'area.
    2. Utilizzare forbici affilate per tagliare il tronco cerebrale. Utilizzare forbici dissezione per fare un taglio superficiale lateralmente attorno destra e poi il lato sinistro del cranio partendo dalla base del tronco cerebrale. Utilizzare pinze a buccia delicatamente indietro il cranio per esporre il cervello.
    3. Sollevare delicatamente le forbici del cervello e tra il cervello e la base del cranio, per tagliare il nervo olfattivo per liberare il cervello. Estrarre il cervello con pinza sterile o una spatola e mettere in un piatto Petri batteriologico contenente 10 ml di PBS sterile.
  6. Tagliare il cervello a metà con un bisturi sterile attraverso il centro tra il emisferi destro e sinistro.
  7. Aggiungere metà del cervello di un piccolo mortaio contenente 1 ml di PBS. Utilizzare il mortaio e pestello perfare una sospensione di tessuto pregiato del cervello che può passare attraverso un ampio foro 20-200 microlitri punta della pipetta.
    NOTA: L'altra metà del cervello deve essere fissato in 2,5% di formaldeide per 1 ora se sono necessarie sezioni di tessuto per istopatologia.
  8. Mettere 100 ml di lisato cervello in una provetta da microcentrifuga 1,7 ml. Aggiungere 1 ml di 2,5% di formaldeide in PBS nella provetta contenente il lisato cervello per riparare la sospensione cervello per la colorazione. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
  9. Centrifugare il lisato a 8000 xg per 5 minuti in una microcentrifuga e scartare con cura il supernatante.
  10. Aggiungere 1 ml di permeabilizzazione / tampone bloccante al lisato (siero di capra 10%, 0,2% Triton X-100 in PBS). Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
  11. Centrifuga lisato a 8.000 xg per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
  12. Aggiungere 200 ml di FITC-coniugato dolico biflorus agglutin (DBA). Utilizzare una diluizione 1: 100 della lectina in PBS più siero di capra 10%. Risospendere delicatamente il lisato pipettando. Covareper 1 ora a RT.
    NOTA: DBA è un ligando che si lega CST1 sulla parete parassita cisti.
  13. Centrifuga lisato a 8.000 xg per 5 minuti e scartare il surnatante. Aggiungere 1 ml di PBS al pellet. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Ripetere PBS lavaggio 3x. Eliminare il surnatante termine del lavaggio finale con una pipetta.
  14. Utilizzare un ampio foro 20-200 microlitri punta della pipetta di redigere 5 ml di lisato cervello macchiato e posto su un vetrino da microscopio. Montare il vetrino con una copertura di slittamento mm 25 x 25 per creare un supporto umido del lisato cervello. Fai 3 scivoli replicati con 5 ml di cervello lisato ciascuno.
  15. Contare il numero di cisti per ciascuna aliquota 5 ml al microscopio a fluorescenza utilizzando un obiettivo 10X (Figura 6).
    NOTA: Alcune cisti sono grandi (8 o più parassiti circa), mentre alcuni sono molto piccole (1-2 parassiti per cisti). Contare il numero totale di cisti per ciascun numero di diapositiva ma documento del gran numero di contro piccole cisti.
  16. Aggiungere il numero di cisti detette in tre diverse aliquote 5 microlitri e moltiplicare per il fattore di diluizione totale x 2 (solo la metà del cervello è stata fatta in un lisato) per stimare il numero di cisti totali per il cervello.

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Risultati

Toxoplasma gondii replica liberamente nei macrofagi naïve e ha un tempo di raddoppio tra 6-12 ore a seconda del ceppo del parassita. La figura 1 mostra i parassiti di rappresentanza in ingenuo rispetto macrofagi derivate dal midollo osseo attivate. La figura 2 mostra la morfologia generale di parassiti in HFF cellule ospiti a 2, 4, 8, 16 e 32 parassiti / PV. Nel protocollo attuale, il parassita è permesso di invadere macrofagi naïve e stabilire un vacuolo nascente parassitoforo...

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Discussione

Il protocollo descritto fornisce un approccio non-polarizzato che utilizza attivazione dei macrofagi murini derivate dal midollo osseo e la genetica avanti per isolare T. mutanti gondii con un difetto nella loro capacità di sopravvivere attivazione dei macrofagi infetti. Il fenotipo dei mutanti dopo l'attivazione dei macrofagi cade in genere in una delle due grandi categorie: 1) I parassiti appaiono intatte ma non riescono a replicare oltre 1 parassita per PV; 2) I parassiti apparire di qualità inf...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Un ringraziamento speciale al Dr. Peter Bradley per l'anticorpo per rilevare i mitocondri di T. gondii. Il lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health Grants AI072028 and AI107431 a D.G.M e da una generosa donazione al New York Medical College per lo studio della medicina tropicale.

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Materiali

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Riferimenti

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